清熱化瘀方調節凋亡與自噬減輕大鼠急性腦缺血損傷的作用研究*

宋春林 龔 方 劉伍才 袁金華 曾憲晶

缺血性腦血管病(Ischemic cerebrovascular disease,ICD)是一類因腦局部血液循環中斷引起的神經功能障礙性疾病,臨床多見于中老年人。隨著中國人口老齡化加快,腦血管疾病目前己經成為中國致死、致殘的主要疾病之一,其中缺血性腦卒中最為突出,約占腦血管疾病的70%[1]。ICD具有高發病率、高病死率、高致殘率的特點,ICD目前尚缺乏有效的防治手段,給患病家庭帶來沉重的醫療負擔。

中醫防治中風積累了豐富的經驗,“毒損腦絡”是中醫腦病學認識、研究、診療中風病的重要病理機制,清熱化瘀方是根據王永炎院士和國醫大師任繼學關于“毒損腦絡”理論遣藥組方而成,具有“祛瘀清熱、滌痰解毒”之功效,切中了中風的病機和治療要點[2]。隨著中醫藥現代化研究進展,中藥所具有的多層次、多靶點、多途徑的優勢得到進一步挖掘,研究發現:大多數活血化瘀類中藥可通過調控自噬及凋亡途徑來發揮腦保護作用,調節自噬與凋亡是腦缺血損傷有潛力的治療策略[2,3]。本實驗通過觀察清熱化瘀方對急性腦缺血損傷大鼠神經元自噬與凋亡的影響,探究其對腦損傷的部分保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料選用50只體質量為250±50 g 的SPF級SD大鼠,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗單位使用許可證編號為:SYXK 2012-0001,行適應性喂養1周后轉入實驗造模。藥物從院內中草藥房購入,清熱化瘀方藥物組成(水牛角30 g,水蛭12 g,赤芍15 g,丹參15 g,地龍10 g,川芎12 g,牛膝10 g,天竺黃10 g,酒大黃6 g,膽南星6 g)。煎制:將中藥加水至500 ml,煎至藥液剩下約150 ml時倒出保存,接著將煎過的中藥再次加水300 m1,煎得藥汁50 m1,最后將2次煎煮所得的藥汁混合,保鮮備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥采用隨機數字表法將大鼠分為5組:假手術組、缺血模型組、清熱化瘀方低中高劑量組,每組10只,采用《缺血性腦損傷模型的研究》[4]操作方法對大鼠進行大腦中動脈梗阻模型造模(MCAO),其中假手術組術中插入約8 mm魚線,不足以阻斷大腦中動脈血流。清熱化瘀方各劑量組在術后2 h灌胃等體積的清熱化瘀方湯液,給藥劑量參照人與動物體表面積折算的等效劑量系數折算法[5],清熱化瘀方各低、中、高劑量組分別予清熱化瘀方湯液按(0.7、1.4、2.8 m1/100 g) 灌服。假手術組和模型組均予等體積生理鹽水灌胃,各組每天定時2次灌胃,連續2周后處死取樣。

1.2.2 神經功能評分標準大鼠造模清醒后,采用Longa的5 級神經功能缺損評分法[6]對大鼠進行神經功能缺損評分,篩選評分為1～3 分者納入試驗研究。

1.2.3 切片制作與染色將大鼠深麻后仰臥位固定,完整取出的腦組織,4%PFA于4 ℃固定腦組織48 h,在移入30%蔗糖溶液中至腦組織沉入底部,使用冰凍切片機將腦組織切成20 μm切片,然后吸附到防脫載玻片上,-20 ℃儲存。常規 HE染色后,在10×20倍鏡下觀察大鼠神經細胞病理形態變化。

1.2.4 TUNEL細胞凋亡檢測將制作完成的石蠟切片脫苯后依次浸泡于不同濃度的無水乙醇,蛋白酶K中孵育后清洗切片,加入TUNEL反應混合物,用PBS溶液封片,置于熒光顯微鏡下進行觀察,凋亡細胞在450～500 nm波長下激發綠色熒光,計算出凋亡細胞比例。

1.2.5 Western-blot檢測腦組織自噬與凋亡蛋白完整取出大鼠腦組織標本勻漿處理后提取樣本總蛋白,接著進行蛋白含量的測定,SDS-PAGE電泳,轉膜,免疫反應,化學發光,顯影定影成相,利用凝膠圖像處理系統分析計算目標條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分假手術組神經功能評分為0分,說明假手術組未出現神經功能損傷;與假手術組相比,缺血模型組和清熱化瘀方組均出現明顯的神經功能損傷(P<0.01);與模型組比較,清熱化瘀方組神經功能評分明顯下降(P<0.05),其中高劑量組降低明顯。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 (分,

2.2 大鼠HE染色情況假手術組大鼠神經元形態完整,胞膜呈圓或橢圓形,核仁大小不一,胞核染色清晰。缺血模型組神經元排列紊亂,細胞間隙增寬、胞體皺縮,核固縮,胞核異形且染色質深染,核仁消失。清熱化瘀方各組見有少量神經元胞核異形,染色質深染,細胞間隙縮短,整體病理損傷改變較缺血模型組減輕,以清熱化瘀方-高劑量組改善更明顯。見圖1。

圖1 大鼠HE染色圖

2.3 各組大鼠神經細胞凋亡情況假手術組少量被染色的TUNEL陽性細胞,缺血模型組和清熱化瘀方組TUNEL陽性細胞明顯高于假手術組(P<0.01);與缺血模型組比較,清熱化瘀方各劑量組TUNEL陽性細胞比例下降(P<0.05)。見表2,圖2。

表2 各組大鼠神經功能凋亡比例比較 (只,

2.4 大鼠腦組織自噬和凋亡蛋白水平結果結果顯示:各組腦組織中均見Beclin-1、LC3、Caspase-3蛋白的表達;與缺血模型組比較,清熱化瘀方各劑量Beclin-1和LC3蛋白表達量上升,Caspase-3蛋白表達水平下降(P<0.05)。見表3,圖2。

注:A假手術組,B缺血模型組,C清熱化瘀方-低, D清熱化瘀方-中,E清熱化瘀方-高圖2 各組自噬和凋亡在蛋白水平的變化

表3 各組大鼠自噬和凋亡蛋白水平結果 (只,

3 討論

近年來,多項研究報道凋亡和自噬在缺血性腦卒發生發展中的重要作用,凋亡是腦缺血后神經元死亡的主要形式之一[7]。細胞凋亡是在特定基因調控下進行的一種主動性死亡過程,是維持細胞內環境穩定的重要機制之一。自噬是一種可逆的細胞死亡形式,可以使細胞重生,其與壞死和凋亡使細胞最終走向死亡的命運不同,自噬對胞內各類物質持續更新及進化起保護作用。生理條件下的基礎自噬對維持細胞基因組的穩定性、促進損傷細胞衰老、對細胞內大分子物質的循環利用中發揮著重要作用。然而,當不足或者過度的自噬過程在細胞內發生時,則會導致細胞內環境失衡,最終會引導細胞走向死亡[8]。因此,從調節凋亡和自噬切入,或許能成為缺血性腦卒中治療中有潛力的策略。

Caspase依賴性凋亡是凋亡的2種主要機制之一,Caspase的表達變化與細胞凋亡密切相關[9],在Caspase家族蛋白中,Caspase-3是參與凋亡過程的最終效應因子。Beclin-1、LC3是參與自噬過程的主要蛋白,其中Berlin-1作為自噬的直接執行者,不僅可促進自噬吞噬體的形成,增加自噬的發生,還參與神經細胞凋亡[10]。而以LC3復合物為代表的蛋白分子則參與了自噬體膜的形成,進一步參與自噬的降解階段[11]。Beclin-1、LC3作為反映細胞自噬發生及強度的代表性指標,在缺血性腦卒中的進展過程中具有重要的指示作用。有研究顯示,在急性腦梗死大鼠模型中,LC3和Beclin 1上調參與誘導了自噬,予自噬抑制劑(3-MA)后可抑制自噬的激活,減輕了腦缺血損傷。本研究顯示:各組大鼠腦組織中均見Beclin-1、LC3、Caspase-3蛋白的正常少量表達[12],與缺血模型組比較,清熱化瘀方各劑量組Beclin-1和LC3蛋白表達量上升,Caspase-3蛋白表達水平下降,TUNEL染色陽性細胞降低,HE染色病理損傷減輕,表明清熱化瘀方可能通過調節凋亡和自噬蛋白水平而起到腦保護作用。

缺血性中風病因、病機復雜,王永炎院士提出“毒損腦絡”理論,指出毒損腦絡為病機關鍵[13],發病總由瘀毒、熱毒、痰毒、火毒痹阻,腦髓神機受損而致,“腦絡瘀阻”既成,“痰瘀飲”蘊結化熱而毒變,其中“痰瘀熱結”為重要環節,而“痰瘀→蘊熱→毒變→髓傷”是缺血性中風重要病理連鎖反應,與臨床醫學實踐提出的腦內興奮性毒性物質、氧自由基、炎性免疫因子等異常即為“毒邪”一致。痰瘀久之而積熱,熱結則毒生,這些病理因素相互影響,又形成新的致病因素的惡性循環,最終加重病情。在“毒損腦絡”病機理論指導下進行組方的清熱化瘀方是根據缺血性中風的病機演變特點遣藥組方而成,全方以水牛角清熱化瘀、解毒;丹參活血通絡、 清心, 同為君藥;赤芍、川芎、水蛭加強丹參活血通絡之效, 地龍、酒大黃既可活血, 又可清熱解毒, 共為臣藥;佐以膽南星化痰開竅, 天竺黃清熱化痰, 牛膝引血熱下行,諸藥合用,共奏清熱解毒、化瘀通絡之功。清熱化瘀方通過打斷“血瘀、痰飲、熱毒、再瘀塞”的惡性病理循環而減輕患者癥狀,在前期研究發現其對缺血性中風的具有較好的療效[14,15]。

綜上,清熱化瘀方可能通過調節凋亡和自噬從而起到減輕腦缺血損傷的作用,為“毒損腦絡”理論防治缺血性中風提供了較好的實驗依據。