基于網絡藥理學和實驗驗證探究芒果苷鈉鹽對動脈粥樣硬化的作用機制

蒲澤江,趙川平,閆子涵,王乾,周程艷

(1.河北大學 藥學院,河北省藥物質量分析控制重點實驗室,河北 保定 071002;2.河北大學附屬醫院 神經內科,河北 保定 071000)

調查數據顯示,由動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)引起的心血管疾病死亡率占居民總死亡率的40%以上[1].AS是由于動脈血管管腔狹窄或堵塞而引起的一種心腦血管病,多見于中老年時期,由于其極大的致殘率和致死率,嚴重危害人體健康和生活質量[2].經研究發現,AS的發生是多方面作用的結果,涉及炎癥、細胞凋亡、代謝異常等,故AS的發生是一個多部位、多靶點的協同作用[3].中藥具有多成分、多靶點、多種調節方式的特點,在治療臨床疾病上蘊藏巨大的開發價值,因此從傳統中醫藥里開發多靶點的化合物治療AS成了日益關注的新焦點.

芒果苷(mangiferin,MF)又名莞知母寧,是一種雙苯吡酮類化合物,具有止咳、平喘、化痰、抗炎、抗腫瘤、降血糖、抑菌等作用[4].本課題組研究的芒果苷鈉鹽(MF-Na)是芒果苷的鈉鹽形式,MF-Na比芒果苷具有更高的水溶性和更高的生物利用度.筆者之前的研究表明芒果苷鈉鹽(MF-Na)具有抗炎、調節脂質代謝異常等作用[5],而AS的發展涉及炎癥、代謝異常等情況,因此MF-Na在治療AS的研究上具有很大的前景,但是MF-Na治療AS的作用機制尚不明確.

網絡藥理學是把方藥與疾病間相關聯的分子放在一個背景網絡里,以“網絡靶標”為核心,進行多角度分析,從而探究藥物治療疾病的機制[6].本文以MF-Na為研究對象,運用網絡藥理學與分子對接的方法,對MF-Na治療AS的作用機制進行初步探討.巨噬細胞是調控炎癥反應、調節免疫的重要角色,為許多炎癥性疾病的病理標志,如肥胖、AS等,并與腫瘤預測、轉移、預后有重要關系[7].巨噬細胞又是人體重要的固有免疫細胞之一,因此本文選擇巨噬細胞進行了深入的實驗驗證研究,大大減少了后期實驗的盲目性,為研究MF-Na對AS的治療作用提供了有益的參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠巨噬細胞系(RAW264.7細胞)為實驗室凍存庫凍存細胞;芒果苷鈉鹽[8]、ox-LDL(批號:2021-04-15);DMEM培養基(批號:AF29449021);胎牛血清(批號:21110702);CCK-8(批號:006Z0102);大鼠酶聯免疫試劑盒(ELISA): TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2、CXCL1(批號:202108);NF-κB p65抗體(批號:A107086414);NF-κB p50抗體(批號:A108261659);即用型SP免疫組化試劑盒(批號:20220519);質量分數4%多聚甲醛固定液(批號:22105339);載玻片(批號:19048);RIPA裂解液(批號:01408/28421);Triton X-100(批號:1109F055).

1.2 MF-Na治療AS的網絡藥理學研究

1.2.1 MF-Na化學成分靶標預測及靶點PPI網絡構建

選擇MF作為MF-Na靶點篩選的化合物,登錄Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),通過搜索“Mangiferin”獲得MF的化學結構、Smile號、InChikey號等相關信息.進一步通過四大數據庫“TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、STITCH數據庫(http://stitch.embl.de/)、Swiss Target Prediction數據庫(http://swisstargetprediction.ch/)、SEA數據庫(http://sea.bkslab.org)”預測MF-Na的作用靶點.為了統一靶點的標準名稱,則把預測出來的靶點信息利用Uniprot數據庫將所有靶點統一轉換為官方基因名,即Official Symbol.

STRING(https://string-db.org/)數據庫是一個在線搜索已知蛋白質之間相互作用的數據庫,可以對輸入蛋白間的相互作用進行打分評價,連接度越大,則可信度越高.為了讓MF-Na中篩選出來的蛋白相互作用關系可視化,將上述篩選出來的MF-Na潛在靶點信息上傳到STRING數據庫,在該網站通過設置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關系網絡圖(PPI網絡圖)以及相關的拓撲學分析.

1.2.2 AS疾病靶點預測

OMIM數據庫(https://www.omim.org/)、Genecards 數據庫(https://www.genecards.org/)、GAD數據庫(https://geneticassociationdb.nih.gov/)里面提供了基因組、蛋白組、轉錄組和遺傳上所知的全部人類基因信息.分別登錄OMIM、Genecards、GAD數據庫,輸入關鍵詞“Atherosclerosis”獲得與AS相關的疾病靶點.登錄STRING數據庫,將篩選到的AS相關靶點上傳,在該網站通過設置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關系網絡圖(PPI網絡圖)以及相關的拓撲學分析.蛋白互作網絡的構建能夠用于深入了解不同蛋白在復雜疾病中的作用,因此本研究構建“MF-Na的成分靶點PPI”及“AS相關靶點PPI”.

1.2.3 MF-Na作用于AS的潛在關鍵作用靶點

首先登陸Webtools.venn網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),分別錄入“1.2.1”、“1.2.2”中篩選得到的靶標,點擊“Submit”得到2個靶標的交集,即藥靶和疾病基因的交集,這個交集中的靶標即MF-Na治療AS的關鍵作用靶點.為了進一步了解這些靶標在疾病治療中的作用,將上述篩選出來的靶點信息上傳到STRING數據庫,在該網站通過設置研究物種為“Homo sapiens”,得到蛋白間的相互作用關系網絡圖(PPI網絡圖)以及相關的拓撲學分析.

1.2.4 相關靶點功能及通路分析

DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)是一個開放的多功能生物信息在線數據庫,為大規模的基因或蛋白列表提供系統綜合的生物功能注釋信息.DAVID數據庫通常用于靶基因的描述和注釋,以此來探究靶基因的信號通路.登錄DAVID數據庫,把篩選出來的關鍵靶標導入,限定物種為“Homo sapiens”,P≤0.05為篩選閾值,勾選生物學過程(biological process,BP)、細胞學組分(celluar components,CC)和生物學功能(molecular function,MF)3個方面進行GO分析,預測關鍵靶點的相關功能.再利用DAVID對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析,設置物種為“Homo sapiens”,最終得到氣泡圖.

1.2.5 “化合物-靶標-通路-疾病”網絡的構建

Cytoscape是一個生物信息學領域的專業繪圖軟件,具有強大的功能,可用于信號通路與靶點分子間相互作用關系的可視化研究.以MF-Na靶標預測結果、MF-Na治療AS關鍵靶標預測結果、作用的通路富集結果這幾個方面的數據為節點(node),先在Excle表中建立彼此對應的關系,再導入Cytoscape軟件,然后構建并分析“化合物-靶標-通路-疾病”的網絡藥理圖.網絡圖中若其中某個靶標是該化合物的潛在靶標,則用線把它們連接起來.通過構建這樣一個多邊的、多層次的、全面的網絡圖來了解靶標所處的通路.

1.3 MF-Na對AS的分子對接研究

采用AutoDock Vina軟件,進行分子對接.首先登陸Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫,下載芒果苷的sdf化學結構,再使用Chemdraw畫出芒果苷鈉鹽(MF-Na)化學結構,把MF-Na作為分子對接的配體,其次登陸RCSB PDB(https://www.rcsb.org)數據庫下載MF-Na與AS對應的共同靶標蛋白質的pdb分子結構,作為分子對接的受體.打開AutoDock Vina軟件,分別導入 Degree值靠前的靶標蛋白質受體與MF-Na進行分子對接.對接完成后分別得到MF-Na與每個蛋白受體的對接得分值,得分值越低,表示配體與蛋白受體的結合越穩定.

1.4 細胞實驗驗證

1.4.1 細胞培養

將小鼠單核巨噬細胞RAW264.7培養于含體積分數10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素與鏈霉素)的DMEM高糖培養基中,然后放置于37 ℃、CO2孵育箱中培養,在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態.采用氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)構建炎癥細胞模型.

1.4.2 CCK-8法檢測細胞活性

用胰酶消化細胞,再取密度為1×104/mL的RAW264.7細胞懸液,接種到96孔板中,設好細胞分組后培養過夜,待細胞貼壁后按分組加入含不同濃度(0、10、20、40、80、160、320 μmol/L)MF-Na的DMEM培養基100 μL,置于孵育箱中培養24 h后向每個孔中加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h,用酶標儀測定450 nm處每個孔的吸光度(OD)值,通過計算后獲得細胞活力,以對照組細胞活力為基準.計算其余各組的相對細胞活力.

1.4.3 酶聯免疫吸附法檢測細胞培養上清液和細胞裂解液中炎癥因子水平

將細胞以1×105/mL接種于6孔板中,然后分為空白組、模型組和治療組,治療組中給藥濃度依據CCK-8實驗篩選得到.過夜貼壁后,棄去原培養基,正常組中加入DMEM完全培養基、模型組中加入含ox-LDL(50 μg/mL)的培養基、治療組中分別加入不同濃度的MF-Na(20、40 μmol/L)和ox-LDL(50 μg/mL)的培養基,繼續在培養箱中培養24 h.隨后吸出細胞培養液用2 500 r/min離心20 min后收集上清液.同時,用PBS緩沖液沖洗細胞3次,加入RIPA裂解細胞,12 000g/min離心10 min,收集細胞裂解液.采用酶聯免疫吸附法(ELISA)法,通過加樣、加酶、溫育、洗滌和顯色等過程進行檢測,然后于450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(OD值),并根據標準曲線進行細胞培養上清液和細胞裂解液中的TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2和CXCL1的水平的計算.

1.4.4 免疫細胞化學檢測NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達

1.4.5 統計學分析

2 結果

2.1 MF-Na對AS的網絡藥理學研究結果

2.1.1 MF-Na化學成分靶標預測及靶點PPI網絡構建

TCMSP、STITCH、Swiss Target Prediction、SEA幾大數據庫對MF-Na靶點進行篩選之后,分別預測得到2、30、72、24個靶點,整合來自各個數據庫的靶點,去除重復的靶點后共得到119個靶點.119個靶標導入STRING數據庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關系,通過Cytoscape繪制PPI網絡,于是得到MF-Na活性成分所作用的蛋白之間的相互作用關系網絡圖,結果如圖1所示.圖1中的每1個靶點都代表1個節點,連線表示靶點的連接度,即靶點與其他靶點相關聯的程度.靶點在圖中的連線越密集就說明該靶點在PPI網絡圖中的占比權重越大,越說明此靶點就是MF-Na的重要靶點.另外對這些排名前15的靶點進行了拓撲學分析,由拓撲學分析結果可知AKT1,TP53,EGFR,HRAS,IL-6,TNF等是MF-Na作用的重要靶點,如表1所示.

表1 MF-Na蛋白互作拓撲學分析(度值排序前15個靶點)

圖1 MF-Na活性靶點蛋白-蛋白互作網絡Fig.1 PPI network of MF-Na active target

2.1.2 AS疾病相關靶點數據構建

進入OMIM、GAD和Genecards 數據庫,檢索AS相關的靶點,輸入“Atherosclerosis”獲得與AS相關靶點分別為200、150、257個靶點,并刪除重復后共有433個,得到在3個數據庫中AS疾病重要的一些靶標基因.把得到的433個靶標導入STRING數據庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關系,然后導入Cytoscape軟件,繪制PPI網絡,網絡中邊最多、連接最密集的節點就是與疾病相關的最重要的基因,如圖2所示.由拓撲學分析結果可知,IL-6、TNF、INS、ALB、AKT1、VEGFA等是治療AS的重要靶點,結果如表2所示.

表2 AS蛋白互作拓撲學分析(度值排序前15個靶點)

圖2 AS相關疾病靶點蛋白-蛋白互作網絡Fig.2 PPI network of AS related disease targets

2.1.3 MF-Na-AS共同靶點的篩選

通過對MF-Na作用靶點和AS疾病作用靶點進行篩選后,得到了MF-Na作用的119個靶點和AS疾病作用的433個靶點.登錄http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/網站,分別輸入MF-Na作用的靶點和AS的靶點,兩者取交集后就得到了“藥物-疾病”共同靶點23個.將交集中的靶點導入STRING數據庫中,限定物種為“Homo sapiens”,得到各蛋白基因之間的相互作用關系,然后導入Cytoscape軟件,得到23個主要靶點的相互作用網絡,如圖3所示.23個主要靶標的相互作用網絡圖中直觀地展示了重點靶標與其他靶標之間的聯系.由拓撲學分析結果(表3)可知,TNF、IL-6、AKT1、PTGS2、TP53、ESR1等靶點在網絡圖中的占比權重較大,可能是MF-Na治療AS的關鍵靶點.

這一目標給他帶來巨大的“壓力”，他努力把壓力化作“趕路”的動力。在這本書的前言“寫在前面”中寫到：“是因為幾十年來，我幾乎天天都在極為緊張地‘趕路’，追求專業鉆研上的進展，……總之一句話，如果說我這一生有這樣那樣的壓力，那么，‘趕路’便是主流壓力。我給父親的信，主要述說的便是在這一主流壓力下我之所思所寫所為。”

表3 MF-Na對AS作用靶點的拓撲學分析

圖3 MF-Na治療AS的潛在直接作用靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of potential direct targets of MF-Na in the treatment of AS

2.1.4 MF-Na治療AS的靶蛋白功能和通路富集分析結果

將篩選得到的MF-Na治療AS的23個關鍵靶點導入DAVID數據庫,限定物種為“Homo sapiens”,進行GO分析,共得到33個富集結果(P≤0.05).其中生物學過程(BP)21個,涉及一氧化氮生物合成過程、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的正向調控、糖皮質激素反應、蛋白激酶活性的負調控等;生物學功能(MF)9個,包括類固醇激素受體、細胞因子活性、酶的結合等;細胞學組分(CC)3個,包括蛋白質絡合物、細胞外空隙、胞外區等.

KEGG通路富集分析,得到46個相關通路(P≤0.05),按照顯著性P值由高到低進行排序,圖4列出了排序前30條的富集結果.橫軸表示靶點的得分值,縱軸是通路名稱,點大小表示路徑中目標的數量,點顏色反映顯著性,P值越小顏色越偏紅色,P值越大越呈藍色.Rich factor越大,表示富集的程度越大,P值越接近于零,表示富集越顯著.排除與本疾病關聯性不大的通路,再從前30條通路中選擇得分高的通路,于是得到estrogen signaling pathway(脂質代謝相關)、TNF signaling pathway(炎癥相關)、hypertrophic cardiomyopathy (HCM)(炎癥通路)、HIF-1 signaling pathway(缺氧誘導因子)、HTLV-I infection(炎癥相關)、PI3K-Akt signaling pathway(細胞代謝)、platelet activation(血小板活化)、insulin resistance(代謝調節)等通路.

圖4 前30條KEGG通路Fig.4 Top 30 KEGG pathways

2.1.5 “化合物-靶標-通路-疾病”網絡分析

利用Cytoscape軟件,繪制了MF-Na的“化合物-靶標-通路-疾病”網絡圖,直觀地呈現了MF-Na、AS所對應的靶標與30條作用通路之間的關系,如圖5所示.圖5中藍色圓形代表MF-Na或疾病的作用靶標、紅色圓形代表兩者的交集靶標、紫色倒三角形代表作用通路、藍色三角形代表MF-Na、綠色菱形代表AS這種疾病,連線表示它們之間的相互作用.從網絡圖中可以看出,AKT1、TNF、IL-6是連接度較高的靶點,TNF signaling pathway、platelet activation是主要的通路途徑.圖5結果顯示了化合物-靶標-通路-疾病之間的復雜的過程,體現了藥物在體內發揮作用時復雜的生物過程,這表明MF-Na在體內主要是通過調節炎癥通路、脂質代謝和血小板活化通路來發揮治療作用的.

圖5 MF-Na “化合物-靶標-通路-疾病”網絡Fig.5 Network “compound-target-pathway-disease” of MF-Na

2.2 MF-Na對AS的分子對接分析結果

對23個共同靶標的PPI網絡中Degree值排前10的靶標(IL-6、TNF、AKT1、PTGS2、TP53、ESR1、NOS3、MMP9、CDKN2A、ALOX5)與MF-Na進行分子對接,并且選用辛伐他汀作為對照藥物與MF-Na進行對接作為參考.結果顯示與MF-Na結合較好的靶點有TNF,與Glu、Ser、Met等氨基酸殘基形成氫鍵,結合能為-38.07 kJ/mol,小于對照藥物(-32.22 kJ/mol);IL-6與Gln、Asn、Lys、Thr、Tyr等氨基酸殘基形成氫鍵,結合能為-30.12 kJ/mol,小于對照藥物(-28.45 kJ/mol),結果如圖6.

2.3 細胞實驗驗證結果

2.3.1 MF-Na對RAW264.7活性影響

細胞活力檢測結果如圖7所示,適量的MF-Na對Raw264.7細胞活力具有促進作用.在MF-Na濃度從10～320 μmol/L時,細胞活力呈先上升再下降趨勢,當MF-Na濃度為40 μmol/L時細胞活力最大.從10～20 μmol/L時,細胞活力逐漸降低;20～40 μmol/L時,細胞活力上升;在40 μmol/L之后,隨著MF-Na給藥濃度增大,細胞活力逐漸下降.因此選擇MF-Na 20、40 μmol/L作為低濃度和高濃度進行后續實驗驗證.

不同字母表示具有顯著差異P<0.05;相同字母表示無顯著差異圖7 CCK-8法檢測細胞活性Fig.7 Cell viability detected through CCK-8 method

2.3.2 MF-Na降低細胞培養上清液和裂解液中炎癥因子的表達水平

在培養上清液中,MF-Na顯著降低了TNF-α、NF-κB和IL-6炎性因子的表達水平,并且降低了CCL2、CXCL1趨化因子的水平,結果如表4所示.在裂解液中,模型組的上述炎癥因子顯著增加,當給予MF-Na治療后,上述炎癥因子水平明顯下降,這與培養上清液的檢測結果相一致.這表明MF-Na是作用于TNF-α、IL-6等靶點來減少炎癥反應和CCL2等靶點來降低趨化因子,從而達到治療效果,較好地驗證了上述網絡藥理學預測的靶點.

表4 細胞培養上清液和細胞裂解液中炎癥因子的含量

2.3.3 MF-Na降低細胞中NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達

NF-κB p65和NF-κB p50蛋白的表達結果如圖8所示.NF-κB p65的表達水平,模型組較正常組高,并有顯著性差異;MF-Na高劑量組,NF-κB p65表達明顯降低.NF-κB p50的表達水平,正常組表達較低,而模型組中表達則顯著升高;MF-Na高劑量組,p50表達明顯降低.總體而言,MF-Na顯著降低了細胞中NF-κB p65和NF-κB p50的表達水平,表明NF-κB可能是被調控的靶點之一.

N.正常組;M.OX-LDL處理的模型組;L.低劑量MF-Na治療組;H.高劑量MF-Na治療組圖8 細胞中NF-κB p65、NF-κB p50的表達Fig.8 Expression of NF-κB p65 and NF-κB p50 in cells

3 討論

本次研究利用網絡藥理學的方法,通過TCMSP、STITCH、SEA、Swiss Target Prediction數據庫和相關的資料文獻篩選出了MF-Na的119個潛在靶點,再通過OMIM、GAD和Genecards數據庫篩選出AS的433個靶點,進行比對之后得到23個核心靶點基因.結果表明,TNF-α、IL-6、CCL2等是MF-Na治療AS的重要靶點.

AS屬于慢性炎癥疾病,炎癥的發生貫穿在整個AS的發生、發展等過程中.血脂升高等因素導致內皮損傷,內皮細胞分泌炎癥因子和趨化因子,如單核細胞趨化因子(monocyte chemoat-tractant protein,MCP),單核細胞黏附、聚集并遷移至內皮下分化為巨噬細胞.巨噬細胞轉變為泡沫細胞,并形成脂質條紋、粥樣硬化斑塊等病理改變,進而引起炎癥大爆發.因此,巨噬細胞在AS的發生和發展過程中均起著直觀重要的作用[9-10].TNF-α是一種顯著的促炎細胞因子,參與多種炎癥反應.大量炎癥因子的產生會維持體內的炎癥水平.當體內TNF-α水平較高時,大量巨噬細胞發生M1型活化,從而加速AS的發展[11].大量TNF-α還能促進其下游NF-κB信號的激活(圖9)[12].NF-κB是介導炎癥反應的關鍵轉錄因子,當其被激活時,體內炎性因子的轉錄翻譯水平隨之上調,增加活性氧自由基、促進內質網應激、加重AS[13].NF-κB的激活可以調節CCL2的表達水平.CCL2作為趨化因子配體2,可與Th2型趨化因子受體(CCR2)協同作用,促進單核細胞向動脈募集.此時,大量單核細胞聚集到動脈壁中,它們分化為巨噬細胞,這些巨噬細胞吞噬LDL后最終成為內膜中的泡沫細胞,導致管腔狹窄[14].CXCL1結合CXCR2是造成急性細胞炎癥反應的原因之一,并且CXCL1-CXCR2軸促進巨噬細胞聚集,從而發生AS病變[15].此外,炎性因子IL-6可促使巨噬細胞對低密度脂蛋白(LDL)的攝取,使脂肪沉積增加,誘導形成泡沫細胞而促進AS的形成[16].由此推測,MF-Na抗AS的作用機制與炎癥因子的關系十分緊密.

圖9 TNF-α促進NF-κB的激活機制Fig.9 Mechanism of TNF-α promoting NF-κB activation

GO功能富集分析結果顯示,MF-Na治療AS涉及多個細胞進程和生物過程,并且主要生物過程均與體內炎癥反應和細胞的增殖凋亡密切相關.KEGG通路富集結果顯示,TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、Estrogen信號通路等是MF-Na發揮抗AS作用的重要信號通路.富集到TNF信號通路中的基因多以促炎癥基因為主,此通路在影響巨噬細胞活化、釋放炎癥因子、調控免疫反應方面發揮著重要作用,從而對AS產生影響[17].此外,分子對接結果顯示,TNF、IL-6等炎癥因子靶標與MF-Na的結合能較低,結合關系較好.MF-Na處在對接靶點蛋白質的氨基酸組成的活性區域里,并與這些氨基酸通過氫鍵連接,十分穩定.因此本研究以TNF通路中的部分炎癥因子為目標,驗證其與MF-Na的相互作用,從而探究MF-Na抗AS的作用機制.

研究結果表明,TNF-α、NF-κB、IL-6、CCL2和CXCL1在模型組中高表達,加入MF-Na干預后它們表達水平均降低,表明MF-Na能逆轉AS過程中炎癥因子的升高.同時,免疫細胞化學實驗發現,NF-κB p65和NF-κB p50在模型組和MF-Na高劑量組中的表達水平具有顯著差異,MF-Na能顯著降低細胞中NF-κB p65和NF-κB p50的表達水平.已有研究表明,TNF能激活NF-κB表達,NF-κB的激活可以調節CCL2的水平[12,14].這與本研究結果相一致,說明MF-Na可以通過TNF-α/NF-κB/CCL2途徑相關基因的轉錄與蛋白表達來調節炎癥反應,從而發揮對AS的治療作用.

綜上所述,MF-Na對AS具有多途徑調節作用.MF-Na可以有效緩解細胞炎癥情況,降低炎性因子TNF-α、NF-κB、IL-6的含量和降低趨化因子CCL2、CXCL1的含量,并通過TNF-α/NF-κB/CCL2通路發揮治療作用.網絡藥理學結合細胞實驗驗證,深入闡述了MF-Na治療AS的作用機制,為MF-Na治療AS的進一步深入研究提供了依據.