基于16S rDNA測序分析重組人生長激素對矮身材兒童腸道菌群的影響

陳文雅,經(jīng) 緯,粟 平,王宏歌,俞意佳,陶月紅

(1.揚州大學醫(yī)學院,江蘇 揚州,225001;2.揚州大學附屬蘇北人民醫(yī)院 兒科,江蘇 揚州,225001;3.大連醫(yī)科大學,遼寧 大連,116044)

兒童矮身材是指在相似生活環(huán)境下,兒童個體身高低于同種族、同性別和同年齡人群平均身高2個標準差(-2.00 SD),或低于第3百分位數(shù)(-1.88 SD)[1]。世界衛(wèi)生組織公布的發(fā)展中國家矮小癥發(fā)病率為32.5%[2],中國的抽樣調(diào)查結(jié)果[3]顯示兒童矮小癥的發(fā)病率約為3%,其中僅10%的矮小癥患者得到治療,嚴重影響患兒的身心健康。目前,重組人生長激素(rhGH)在臨床中應用廣泛,已成為治療兒童矮身材的重要措施。腸道菌群是一個動態(tài)的微生物群體,其中厚壁菌及擬桿菌占90%以上,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對宿主的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌及代謝等有重要的影響[4-5]。生長激素能夠影響宿主腸道菌群的組成和豐度,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)也可通過多種途徑影響生長的相關(guān)機制,例如生長激素/胰島素樣生長因子-1軸、甲狀腺素等[6],但關(guān)于生長激素影響矮身材兒童腸道菌群的研究目前鮮有報道。近年來,高通量測序技術(shù)快速發(fā)展,這為研究腸道菌群與生長的關(guān)系及其潛在途徑提供了可行性。本研究基于16S rDNA測序技術(shù)分析rhGH治療前后矮身材兒童腸道菌群的組成及變化,探討rhGH對腸道菌群的影響,以期為矮身材兒童的治療提供新思路和新方案。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年7月—2022年4月就診于江蘇省蘇北人民醫(yī)院的3～14歲且初次使用rhGH治療的矮身材兒童作為研究對象。收集患兒的臨床資料,包括性別、年齡、身高標準差積分(SDS)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1),并收集患兒的糞便樣本。所有患兒及其監(jiān)護人同意參與本研究并簽署知情同意書,本研究經(jīng)江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(批文編號2021ky181)。納入標準：① 年齡3～14歲者;② 需使用生長激素治療的矮身材兒童[1](在正常生活水平下,身高低于同性別、同年齡、同種族兒童平均身高2個標準差,或低于第3百分位數(shù));③ 參與本研究前尚未使用生長激素治療者。排除標準：① 每階段樣本收集前1個月內(nèi)有益生菌、益生元或抗生素使用史和(或)有急性腹瀉病史和(或)其他感染性疾病者;② 在收集樣本的任意階段有明顯飲食結(jié)構(gòu)改變者;③ 合并嚴重先天性心臟病、消化道畸形、炎癥性腸病、肝腎功能損害、代謝性疾病、血液系統(tǒng)腫瘤者;④ 被研究者認為不適合參加本研究者。

1.2 治療與分組方法

本研究最終納入32例矮身材兒童,根據(jù)所用rhGH劑型的不同分為長效組和短效組,每組16例。長效組使用聚乙二醇重組人生長激素(PEG-rhGH)注射液(商品名金賽增,長春金賽藥業(yè)有限責任公司,國藥準字S20140001)皮下注射,劑量為每周0.2 mg/kg,睡前0.5～1.0 h皮下注射,連續(xù)治療6個月。短效組使用rhGH注射液(商品名賽增,長春金賽藥業(yè)有限責任公司,國藥準字S20050025),劑量0.10～0.15 IU/(kg·d),睡前0.5～1.0 h皮下注射,連續(xù)治療6個月。治療前1周內(nèi)和治療3、6個月時,分別留取2組患兒的糞便標本,檢測并記錄身高SDS和IGF-1水平。治療過程中,部分患兒因病使用抗生素或益生菌,故未收集相應階段的糞便標本及臨床資料。長效組治療前及治療后3、6個月收集例數(shù)分別為16、12、10例,短效組治療前及治療后3、6個月收集例數(shù)分別為16、16、13例,共收集83份糞便樣本。

1.3 16S rDNA測序方法

1.3.1 糞便樣本收集及處理：分別留取入組患兒治療前1周內(nèi)和治療3、6個月時的新鮮糞便樣本約2 g,置于無菌采集管或可室溫保存的一次性大便樣本采集處理器中,于2 h內(nèi)送至醫(yī)院并置于-80 ℃冰箱保存待測,運輸時需用干冰低溫保存。

1.3.2 16S rDNA高通量測序：將糞便樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行16S rDNA測序。全程按照試劑盒說明和操作規(guī)范進行操作。采用十六烷基三甲基溴化銨或十二烷基硫酸鈉方法提取糞便基因組DNA,通過引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGAC

TACNNGGGTATCTAAT -3′)對細菌的16S rDNA V3～V4高變區(qū)序列進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增、產(chǎn)物純化和文庫構(gòu)建。通過NovaSeq 6000測序平臺進行上機測序,對測序所得原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾,得到有效數(shù)據(jù)。通過DADA2插件對有效數(shù)據(jù)進行降噪,并過濾掉豐度<5的序列,獲得最終的擴增序列變體(ASVs)。

1.3.3 生物信息學分析：采用QIIME2軟件的classify-sklearn算法對每個ASV使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進行物種注釋。根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣品特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,比較各組腸道菌群的優(yōu)勢物種及其相對豐度。α多樣性分析通過對各樣本進行組間差異分析,可反映各組間微生物群落的豐富度、多樣性和均勻度。β多樣性分析通過分析坐標軸中樣本間的距離直觀地對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進行比較,可評估樣本間物種多樣性。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

短效組男9例、女7例,平均年齡(9.16±2.56)歲;長效組男10例、女6例,平均年齡(8.99±2.39)歲。2組患兒年齡(t=0.344,P=0.561)、性別(χ2=0.130,P=0.719)比較,差異均無統(tǒng)計學意義。短效組患兒不同時點間身高SDS、IGF-1比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=17.863、34.853,P<0.001);長效組患兒不同時點間身高SDS、IGF-1比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=270.536、27.234,P<0.001)。2組患兒治療3、6個月時的身高SDS、IGF-1均高于治療前,且治療6個月時的身高SDS、IGF-1均高于治療3個月時,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);長效組治療6個月時身高SDS高于短效組,治療3個月時IGF-1低于短效組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 短效組和長效組患兒不同時點身高SDS、IGF-1水平比較

2.2 樣本數(shù)據(jù)分析

2.2.1 α多樣性指數(shù)組間差異性分析：Chao1指數(shù)反映物種豐富度,數(shù)值越大表示物種豐富度越高;Shannon指數(shù)反映群落多樣性,數(shù)值越大表示群落多樣性越高;Pielou e指數(shù)反映群落均勻度,數(shù)值越大表示物種越均勻。治療前及治療3、6個月時,長效組Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Pielou e指數(shù)均逐漸升高,但不同時點間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.308、0.982、0.818,P=0.737、0.385、0.450);治療前及治療3、6個月時,短效組Chao1指數(shù)、Pielou e指數(shù)均逐漸升高,Shannon指數(shù)先升高再降低,但不同時點間差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.663、0.761、0.930,P=0.520、0.473、0.403)。長效組治療3個月時Chao1指數(shù)高于短效組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);長效組其他時點Chao1指數(shù)和各時點Shannon指數(shù)、Pielou e指數(shù)與短效組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的豐富度、多樣性、均勻度得到改善;PEG-rhGH在改善腸道菌群豐富度、多樣性、均勻度方面相較于短效rhGH更具持續(xù)性和穩(wěn)定性,PEG-rhGH短期內(nèi)(治療3個月)在改善腸道菌群豐富度方面顯著優(yōu)于短效rhGH。見表2、表3、表4。

表2 短效組和長效組不同時點Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)比較

表3 短效組和長效組不同時點Pielou e指數(shù)比較

表4 不同時點樣本的α多樣性指數(shù)比較

2.2.2 β多樣性分析：β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進行比較分析,通過分析坐標軸中樣本和樣本之間的距離直觀觀察各組樣本的菌群差異性,若各組樣本間的直線距離較近,表示各組間菌群差異較小,反之表示差異較大。置換多元方差分析(Per MANOVA)unweighted-Unifrac結(jié)果顯示,F=3.425,P=0.001,表明組間腸道菌群組成存在顯著差異;非度量多維尺度(NMDS)分析是將樣本中包含的物種信息以點的形式反映在多維空間上,不同樣本間的差異程度通過點與點之間的距離體現(xiàn),可反映樣本組間和組內(nèi)差異,見圖1。圖中每個點表示1個樣本,點與點之間的距離表示差異程度,同組同時點樣本使用同一種顏色表示,其中Stress值為0.17(<0.20)具有一定解釋意義,可反映各樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異程度。Per MANOVA結(jié)合NMDS分析結(jié)果表明,rhGH可在一定程度上調(diào)節(jié)矮身材兒童腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)。

2.2.3 腸道菌群物種組成：基于QIIME2軟件分別在門水平和屬水平選取前4位的優(yōu)勢物種并列出相關(guān)豐度占比,見表5、表6。在門水平上,2組不同時點樣本均以厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、變形菌門為主(占95%以上);在屬水平上,2組不同時點樣本均以布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬和擬桿菌屬為主。隨著rhGH使用時間的延長,擬桿菌門、擬桿菌屬的豐度和擬桿菌門與厚壁菌門比值(B/F)逐漸上升;長效組治療6個月時放線菌門豐度低于治療前,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);治療6個月時,長效組雙歧桿菌豐度分別低于治療3個月時和短效組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的物種豐度雖然受到影響,但優(yōu)勢菌群的種類未發(fā)生改變。

表5 門水平優(yōu)勢菌群的豐度占比和B/F比較

表6 屬水平優(yōu)勢菌群的豐度占比 %

2.2.4 功能預測：PICRUSt2功能預測結(jié)果顯示,排名前10位的信號通路分別為卡爾文循環(huán)(CBB)、糖原降解Ⅰ、糖原生物合成Ⅰ(來自ADP-D-葡萄糖)、L-異亮氨酸生物合成Ⅰ(來自蘇氨酸)、磷酸戊糖途徑(非氧化分支)、L-異亮氨酸生物合成Ⅱ、蔗糖降解Ⅲ(蔗糖轉(zhuǎn)化酶)、淀粉降解Ⅴ、丙酮酸發(fā)酵制異丁醇、L-纈氨酸生物合成,表明腸道菌群主要參與碳水化合物代謝和氨基酸代謝等途徑。

2.2.5 優(yōu)勢菌群與IGF-1、身高SDS的相關(guān)性分析：根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣本特征表,獲得各樣本在門水平和屬水平的優(yōu)勢物種及其相對豐度,并與對應的IGF-1、身高SDS進行Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。在門水平上,長效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌門(r=0.706,P=0.022)、B/F(r=0.794,P=0.006)呈正相關(guān),身高SDS與擬桿菌門(r=0.632,P=0.048)、B/F(r=0.626,P=0.047)呈正相關(guān);短效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌門(r=0.637,P=0.019)、B/F(r=0.736,P=0.004)呈正相關(guān),與厚壁菌門(r=-0.581,P=0.037)呈負相關(guān)。在屬水平上,長效組治療6個月時擬桿菌屬與IGF-1(r=0.640,P=0.046)、身高SDS(r=0.675,P=0.032)呈正相關(guān);短效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌屬(r=0.577,P=0.039)呈正相關(guān);短效組治療3個月時雙歧桿菌屬與IGF-1(r=0.562,P=0.024)、身高SDS(r=0.556,P=0.049)呈正相關(guān)。rhGH應用于矮身材兒童能實現(xiàn)促生長作用并提高體內(nèi)IGF-1水平,且2組患兒部分時點的腸道優(yōu)勢菌群與IGF-1、身高SDS呈正相關(guān),提示rhGH與腸道菌群可能具有協(xié)同促生長作用。

3 討 論

2000年世界衛(wèi)生組織通過了一項關(guān)于孕產(chǎn)婦、嬰幼兒營養(yǎng)問題的決議并商定了全球目標,其中主要目標是到2025年將5歲以下發(fā)育不良兒童的數(shù)量減少40%,但按照目前的進展速度,2025年仍會有1.27億名發(fā)育不良兒童,數(shù)量僅減少26%[2]。中國目前仍有很多矮身材兒童未得到治療,而rhGH治療是一個長期、動態(tài)的過程,療程應視患兒具體情況決定,一般治療時間不宜短于1年[1]。動物試驗[7]證實,生長激素對腸道菌群存在一定影響,例如在生長激素基因中斷(GH-/-)小鼠和生長激素長期增加的牛生長激素轉(zhuǎn)基因(bGH)小鼠的模型中,6月齡的GH-/-小鼠和bGH小鼠的微生物圖譜與同窩對照小鼠相比均發(fā)生改變。本研究對使用不同劑型rhGH的矮身材兒童不同時期腸道菌群進行測序發(fā)現(xiàn),隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的豐富度、多樣性、均勻度和結(jié)構(gòu)組成改善,且相較于短效的rhGH,PEG-rhGH在改善患兒腸道菌群豐富度、多樣性和均勻度方面更具有穩(wěn)定性,短期內(nèi)改善腸道菌群豐富度的優(yōu)勢更明顯。

腸道菌群數(shù)量繁多且組成復雜,了解發(fā)揮主要作用的菌群至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示,2組患兒不同時點的門水平優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門,屬水平優(yōu)勢菌群均為布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和糞桿菌屬。厚壁菌門和擬桿菌門可以產(chǎn)生糖苷水解酶,促進食物發(fā)酵和分解,將其轉(zhuǎn)化成SCFAs,從而促進能量吸收[8]。變形菌門是具有潛在致病性的常見菌,能促進炎癥反應[9]。放線菌門可在人類、動物和植物中引發(fā)各種感染,其中最主要的致病放線菌是結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌[10]。擬桿菌屬作為人體腸道重要的益生菌,可促進碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和丙酸,參與多糖和膽固醇代謝,影響體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及能量代謝,為人體提供營養(yǎng)并維持腸道功能。本研究發(fā)現(xiàn),長效組和短效組治療過程中擬桿菌門、擬桿菌屬豐度及B/F均逐漸上升,并與IGF-1、身高SDS呈正相關(guān),其余菌門和菌屬豐度呈波動性變化,治療6個月時2組厚壁菌門、放線菌門的豐度和長效組變形菌門的豐度均較治療前降低。由此提示,持續(xù)使用rhGH一方面能夠提高對人體有益的擬桿菌的豐度及B/F,另一方面能夠降低有害菌的豐度。研究[6]表明,腸道微生物對生長激素的代謝途徑(或影響)不同等,是腸道菌群中有益菌群和致病菌群豐度變化不同的原因,進一步證實生長激素與腸道菌群之間存在相互作用。

腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主的生長,例如嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和部分大腸桿菌已被證實可以促進生長[6]。腸道菌群及其主要代謝產(chǎn)物SCFAs可通過影響生長激素、IGF-1、甲狀腺激素、性激素[6,11-12]等多種途徑影響宿主的生長發(fā)育。研究[6]指出,腸道菌群的定植可通過SCFAs增加血清IGF-1表達。SCFAs大部分由腸道菌群分解碳水化合物產(chǎn)生,少部分來自腸道菌群對蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝,且厚壁菌門和擬桿菌門是產(chǎn)生SCFAs的優(yōu)勢菌[13]。本研究中,功能預測結(jié)果顯示腸道菌群主要參與碳水化合物和氨基酸代謝等途徑,相關(guān)分析結(jié)果顯示擬桿菌屬、B/F、雙歧桿菌屬與IGF-1和(或)身高SDS具有相關(guān)性,提示腸道菌群促生長的潛在途徑可能與SCFAs相關(guān)。

綜上所述,rhGH能夠改善矮身材兒童腸道菌群的豐富度、多樣性和均勻度,提高腸道內(nèi)部分有益菌的豐度,并降低有害菌的豐度,且短期內(nèi)PEG-rhGH在改善腸道菌群豐富度方面相較于短效rhGH具有一定優(yōu)勢。大量動物實驗已證實腸道菌群與生長激素存在相互作用,本研究亦證實外源性rhGH對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用,但腸道菌群對人體生長激素的影響及相關(guān)途徑還需進一步研究。本研究納入樣本數(shù)量較小,后續(xù)研究還應擴大樣本量、延長樣本收集周期及完善代謝組學檢測,以探尋與生長相關(guān)的特定菌群或介質(zhì),通過補充益生菌或糞菌移植等方式實現(xiàn)協(xié)同rhGH促生長的目標,在為臨床診治提供新方案的同時減輕矮身材兒童家庭和社會的壓力。