基于NLRP3/細胞焦亡通路研究荊芥揮發油的抗抑郁作用及作用機制

秦甜甜，黃如楊，謝紅瀟，胡靖文，曾九僧，劉 蓉*，曾 南*

基于NLRP3/細胞焦亡通路研究荊芥揮發油的抗抑郁作用及作用機制

秦甜甜1, 2，黃如楊1, 2，謝紅瀟1, 2，胡靖文1, 2，曾九僧1, 2，劉 蓉1, 2*，曾 南1, 2*

1. 成都中醫藥大學 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

觀察荊芥揮發油對慢性溫和不可預知應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型小鼠抑郁樣行為的干預作用，探究其調控NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體/細胞焦亡從而抑制神經炎癥的作用機制。雄性ICR小鼠制備CUMS抑郁樣模型，依據糖水偏好率將造模成功的小鼠隨機分為模型組、氟西汀（10 mg/kg）組和荊芥揮發油高、低劑量（100、50 mg/kg）組，同時設置對照組。給予藥物干預5周后，進行小鼠糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗與飛濺實驗。行為學測試結束后，取血并分離血清，取海馬組織。ELISA法測定血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；尼氏染色法檢測海馬CA3區神經元尼氏小體平均吸光度值；免疫熒光法檢測海馬CA3區NLRP3、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）、IL-1β及小膠質細胞離子鈣結合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）表達；Western blotting檢測海馬組織NLRP3炎癥小體及焦亡通路相關蛋白表達。與模型組比較，荊芥揮發油能明顯提高小鼠糖水偏好率（＜0.01），顯著縮短小鼠強迫游泳與懸尾實驗中的不動時間（＜0.01、0.001），明顯延長飛濺實驗中的小鼠梳洗時間（＜0.05），表現出抗抑郁樣行為作用。荊芥揮發油顯著降低小鼠血清中IL-1β水平（＜0.05、0.01），增加海馬CA3區神經元尼氏小體數目（＜0.05、0.01），減弱海馬CA3區cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1的平均熒光強度（＜0.05、0.01、0.001），并顯著下調海馬組織NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β、gasdermin-D（GSDMD）、-GSDMD及Iba-1的蛋白表達（＜0.05、0.01、0.001）。荊芥揮發油能改善CUMS模型小鼠的抑郁樣行為，具有抗抑郁作用，其作用機制與抑制NLRP3炎癥小體激活及細胞焦亡、抑制小膠質細胞活化，從而減輕神經炎癥反應與神經元損傷有關。

荊芥揮發油；抑郁；慢性溫和不可預知應激；神經炎癥；NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3；細胞焦亡；胡薄荷酮；異薄荷酮；薄荷酮；胡椒酮

抑郁癥是一種常見的精神疾病，以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征，主要表現有心境低落、意志活動減退、思維遲緩和認知功能損害，同時伴有睡眠障礙、焦慮，甚者出現嚴重的自殘或自殺行為[1]。抑郁癥的病因和發病機制復雜，且尚未完全闡明。目前認為中樞神經炎癥是抑郁癥發病的核心機制之一，機體長期暴露于高水平的炎性細胞因子可誘發神經系統的病變，進而可能導致抑郁障礙等神經精神疾病的發生[2]，表現為炎癥因子能促進活性氧自由基生成，直接損傷與抑郁癥發病相關的腦區神經元和膠質細胞，擾亂神經內分泌功能，引起抑郁癥相關的各種癥狀[3-4]。臨床研究發現，抑郁癥患者外周血中的白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細胞因子水平顯著升高，使用抗抑郁藥治療后，上述促炎細胞因子的水平顯著降低[5]。活化的神經小膠質細胞會產生大量炎癥介質，誘導神經炎癥和認知障礙[6]，其機制涉及炎癥反應發生密切相關的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小體激活，NLRP3炎性小體存在于中樞神經系統的小膠質細胞和星形膠質細胞中[7]，激活后釋放炎癥因子并啟動下游炎癥反應[8]，誘發的神經炎癥參與神經損傷，可導致疾病和抑郁樣行為。

荊芥Briq.揮發油及其主要成分胡薄荷酮、薄荷酮具有良好的抗炎作用，能夠減輕炎性損傷[9]。左旋薄荷酮還能抑制下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）軸過度活化，促進皮質腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達，從而發揮抗抑郁作用[10]。課題組前期研究表明，荊芥揮發油的良好抗炎效應與抑制NLRP3炎癥小體激活有關[11]，同時發現荊芥揮發油通過減輕神經炎癥反應對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的抑郁樣模型小鼠發揮保護作用[12]。基于前期研究基礎，結合目前中藥揮發油的中樞神經系統作用的認識[13]，本研究采用慢性溫和不可預知應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導的小鼠抑郁樣模型，開展荊芥揮發油的抗抑郁作用及NLRP3/細胞焦亡通路作用機制研究，為進一步探究荊芥揮發油的抗抑郁作用及臨床應用拓展提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性ICR小鼠，5周齡，體質量18～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0010。所有動物均自由飲食飲水，在24 h明暗周期的環境中飼養，晝夜各12 h，溫度（25±1）℃，相對濕度40%～60%。本實驗符合動物實驗倫理學標準，獲得成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準（批準號20200320）。

1.2 藥材

荊芥穗Briq.購自太極大藥房，批號20210101，經成都中醫藥大學鑒定教研室嚴鑄云教授鑒定符合《中國藥典》2020年版要求。

1.3 藥品與試劑

鹽酸氟西汀（fluoxetine，FLX）膠囊（20 mg/粒，批號9833A）購自Patheon France公司；小鼠IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒（批號分別為E-EL-M0037C、E-EL-M3063）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）購自碧云天試劑公司；UltraSignal超敏ECL化學發光底物（批號4AW011-100）購自北京四正柏生物科技有限公司；二甲苯、中性樹膠（批號分別為10023418、10004160）購自國藥集團化學試劑有限公司；冰醋酸（批號G10000218）購自武漢谷歌生物科技有限公司；NLRP3兔多克隆抗體（批號T55655ES）購自Abmart公司；凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）兔多克隆抗體（批號DF6304）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）兔多克隆抗體（批號AF5418）、cleaved Caspase-1兔多克隆抗體（批號AF4022）、IL-1β兔多克隆抗體（批號AF4006）、gasdermin-D（GSDMD）兔多克隆抗體（批號AF4012）、離子鈣結合適配器分子-1（ionized calcium binding adapter molecule-1，Iba-1）兔多克隆抗體（批號DF6442）均購自Affinity公司；β-tubulin兔多克隆抗體（批號GB11017B）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號GB11002）、尼氏染液（批號G1032）均購自塞維爾有限公司。

1.4 儀器

UPK-10T型純水儀（廣州市優普科技有限公司）；BS323S型電子天平（德國Sartorius公司）；3001型酶標儀、ST16R型冷凍離心機、Revos型脫水機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；1658000型小型垂直電泳槽、轉膜槽、ChemiDoc型免染型化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；JB-P5型包埋機、JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；GFL-230型烤箱（天津市萊玻瑞儀器設備有限公司）；Eclipse E100型正置光學顯微鏡、DS-U3型成像系統（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 荊芥揮發油的制備

荊芥穗打粉，以6倍量水浸泡30 min后，水蒸氣蒸餾法提取揮發油，大火煮沸后微火加熱至無揮發油生成為止，收集揮發油提取器中上層揮發油，無水硫酸鈉脫水后避光保存，1 kg生藥經提取得到9 mL荊芥揮發油。荊芥揮發油經GC-MS檢測，其主要成分有胡薄荷酮、異薄荷酮、薄荷酮及胡椒酮等，相對質量分數分別為36.76%、14.39%、14.39%、2.73%[12]。

2.2 CUMS模型的建立、分組及給藥

小鼠適應性飼養3 d后，按體質量分層隨機分為對照組和造模組，對照組小鼠合籠飼養不施加造模程序，造模組小鼠單籠飼養，并施加CUMS程序進行造模：冷水游泳（4 ℃、5 min），空籠，夾尾（3 min），頻閃燈刺激（12 h），明暗顛倒，禁食24 h，禁水24 h，潮濕墊料（12 h），異味刺激（3 h），束縛（3 h），鼠籠傾斜，噪音環境（60 Hz，1 h），將以上刺激因子隨機分配，每日安排2種單因子刺激或復合因子刺激，相鄰2 d刺激因子不重復，使動物不能預料刺激的發生。給藥期間造模程序不停止。造模前及開始造模后每周測定小鼠糖水偏好率，連續造模6周后，與對照組比較模型組小鼠糖水偏好率出現顯著降低，提示造模成功。隨后依據小鼠糖水偏好率，將造模組小鼠重新分組，使各組糖水偏好率相近且與對照組比較均有顯著性差異，分為模型組、FLX（10 mg/kg，相當于成人臨床日用劑量的30倍）組和荊芥揮發油高、低劑量（100、50 mg/kg，分別為1/5 LD50、1/10 LD50）組，每組10只，其中荊芥揮發油的劑量設置參考其急性毒性實驗結果及以往研究基礎[12]。各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續給藥5周。

2.3 行為學實驗

2.3.1 糖水偏好實驗 糖水偏好實驗前，各組小鼠給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用，適應一邊白水、一邊蔗糖水的情況。適應12 h后，所有小鼠單籠飼養，禁食禁水12 h。每只小鼠各給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水，稱定2只水瓶質量。在小鼠飲用白水或蔗糖水12 h后，取下水瓶，再次稱定水瓶質量，以2次水瓶質量差值記為小鼠白水或蔗糖水的消耗量，計算小鼠糖水偏好率。造模前測定小鼠糖水偏好率基礎值，造模開始后于每周固定時間測定小鼠糖水偏好率1次。

糖水偏好率＝蔗糖水消耗量/(白水消耗量＋蔗糖水消耗量

2.3.2 強迫游泳、懸尾實驗 參考文獻方法[14-15]，各組小鼠于處理前1周進行實驗。

（1）強迫游泳實驗：在高30 cm、直徑20 cm的圓柱型透明器皿中注入20 cm深清水，溫度（25±2）℃。將小鼠置于器皿內，計時6 min，前2 min使其適應性游泳，記錄后4 min內累積不動時間。

（2）懸尾實驗：將小鼠尾部后2 cm處用膠帶固定在水平位置，使其呈倒掛狀態，頭部離下水平面5～6 cm，記錄動物在6 min內后4 min的累積不動時間。

2.3.3 飛濺實驗 將10%的蔗糖水連續3次噴于小鼠背部靠近尾端處。之后放入小鼠原本居住的籠中記錄5 min內小鼠的梳洗時間（小鼠梳洗背部噴灑糖水位置的行為時間記為梳洗時間），于取材前1周進行測定。

2.4 ELISA檢測血清炎癥因子水平

行為學測試完畢后，小鼠眼球取血，室溫靜置2 h，3500 r/min離心10 min（離心半徑7.5 cm），分離血清，按試劑盒說明書測定血清中IL-1β及TNF-α水平。

2.5 尼氏染色檢測海馬CA3區尼氏小體

取小鼠大腦組織固定于4%多聚甲醛中，常規方法脫水、透明、浸蠟并包埋。取小鼠全腦蠟塊切片（3 μm），烘干后將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min，水洗。甲苯胺藍染色45 min，水洗，0.1%冰醋酸分化，水洗終止反應，顯微鏡下控制分化程度，水洗后置于60 ℃烤箱烘干。切片于二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。置于顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，IDO法檢測海馬CA3區尼氏小體平均吸光度（）值。

2.6 免疫熒光法檢測小鼠海馬CA3區NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β和Iba-1的表達

取各組小鼠腦組織脫水、包埋、切片（約3 μm），切片常規脫蠟至水，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復。PBS溶液（pH 7.4）洗滌后用組化筆畫圈，在圈內加入自發熒光淬滅劑后流水沖洗。牛血清白蛋白封閉30 min后，滴加PBS配制的一抗，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用CaseViewer 4.0掃描瀏覽軟件選取組織的目的區域對海馬CA3區進行成像，應用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.7 Western blotting檢測海馬組織NLRP3/細胞焦亡通路相關蛋白表達

稱取各組小鼠海馬組織20 mg，加入RIPA裂解液200 μL勻漿、裂解，12 000×離心10 min后，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度，調整蛋白濃度一致后，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，洗膜后分別加入NLRP3、ASC、GSDMD、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、Iba-1（1∶1000）兔抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后孵育二抗（1∶5000），洗膜后在凝膠成像系統中成像，Image Lab凝膠圖像分析系統分析條帶灰度值。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠行為學的影響

3.1.1 糖水偏好率 如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠糖水偏好率顯著降低（＜0.05），提示動物快感缺失，出現抑郁樣行為，表明造模成功。與模型組比較，各給藥組小鼠糖水偏好率顯著升高（＜0.01），表明荊芥揮發油能夠改善模型小鼠快感缺失的行為異常表現，表現出抗抑郁作用。

表1 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠糖水偏好率的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group, same as below tables

3.1.2 強迫游泳、懸尾實驗不動時間及飛濺實驗梳洗時間 如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠游泳及懸尾實驗中的不動時間分別延長（＜0.05），飛濺實驗中小鼠梳洗時間縮短（＜0.01），表明CUMS模型小鼠出現行為學異常。與模型組比較，各給藥組小鼠懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間明顯縮短（＜0.01、0.001），梳洗時間延長（＜0.05）。

3.2 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清IL-1β水平明顯升高（＜0.05），TNF-α呈升高趨勢；與模型組比較，各給藥組小鼠血清IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01），TNF-α呈降低趨勢。

表2 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠行為學表現的影響()

表3 荊芥揮發油對CUMS小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的影響()

3.3 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬CA3區尼氏小體的影響

如圖1所示，對照組小鼠海馬神經元尼氏體豐富，著色明顯，排列整齊，神經元細胞形態結構較好。與對照組比較，模型組小鼠海馬CA3區神經元細胞排列不佳，細胞間間隙增寬，胞體多角形變小改變明顯，海馬神經元細胞皺縮，胞質尼氏體數量減少。與模型組比較，各給藥組海馬CA3區神經元形態結構正常，胞質尼氏體豐富呈藍染顆粒狀，染色比較清晰，排列較為整齊。如表4所示，與對照組比較，模型組尼氏小體數量明顯減少（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組尼氏小體數量均顯著增加（＜0.05、0.01），說明荊芥揮發油可以通過發揮神經保護作用對抗動物的抑郁樣行為。

3.4 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬CA3區NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達的影響

如圖2和表5所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬CA3區NLRP3、cleaved Caspase-1及Iba-1的熒光強度顯著升高（＜0.05、0.01），IL-1β有升高趨勢，提示小膠質細胞的激活及炎癥反應啟動；與模型組比較，各給藥組cleaved Caspase-1和Iba-1熒光強度顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），FLX組NLRP3熒光強度顯著降低（＜0.05），FLX組和荊芥揮發油高劑量組IL-1β熒光強度顯著降低（＜0.05）。

黃箭頭表示海馬神經元細胞皺縮，藍箭頭表示胞質尼氏體數量減少，黑箭頭表示胞質尼氏體豐富呈藍染顆粒狀

表4 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬CA3區尼氏小體的影響(, n = 4)

3.5 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細胞焦亡通路相關蛋白表達的影響

如圖3和表6所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1、cleaved Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β、ASC、GSDMD、-GSDMD和Iba-1蛋白表達水平均明顯升高（＜0.05、0.01），提示CUMS模型小鼠海馬組織中小膠質細胞活化且NLRP3炎癥小體被激活，細胞焦亡發生，引起小鼠海馬部位的神經炎癥。與模型組比較，各給藥組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GSDMD、-GSDMD、蛋白表達水平均明顯降低（＜0.05、0.01、0.001），荊芥揮發油各劑量組cleaved Caspase-1、Iba-1蛋白表達水平均明顯降低（＜0.01、0.001），FLX組和荊芥揮發油低劑量組pro IL-1β、ASC蛋白表達水平均明顯降低（＜0.05、0.01），表明荊芥揮發油能對抗模型小鼠海馬組織中小膠質細胞的活化，同時抑制NLRP3炎癥小體的激活，抑制細胞焦亡，從而減少炎癥因子釋放。

圖2 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬CA3區NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達的影響(×200)

表5 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬CA3區NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β及Iba-1表達的影響(, n = 4)

圖3 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細胞焦亡通路相關蛋白表達的影響

表6 荊芥揮發油對CUMS模型小鼠海馬組織NLRP3/細胞焦亡通路相關蛋白表達的影響(, n = 4)

4 討論

傳統中藥揮發油（精油）依賴于其獨特的芳香氣味、易透過血腦屏障、多靶點、不良反應少等特點，通過抗焦慮、抗抑郁、鎮靜安神、神經保護等多種藥理活性，在防治抑郁、焦慮等情志疾病上呈現出獨特優勢[13]。荊芥揮發油作為荊芥的主要物質基礎，已被證明具有良好的抗炎、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮痛等作用[16]，且前期研究亦表明其抗炎作用與其對抗LPS所致的抑郁樣模型小鼠行為學異常有關[12]，因此究其抗抑郁效應，值得進一步探究。

CUMS抑郁模型模仿了人類抑郁癥的發生和發病機制，被認為是較為理想的動物抑郁模型[17-20]。接觸重復應激的動物糖水消耗會減少，出現快感缺乏跡象，因此糖水偏好實驗可用于評價抑郁程度[21-22]。飛濺實驗主要觀察動物是否出現行為淡漠狀態。本實驗結果表明，CUMS造模后，小鼠糖水偏好率降低，提示CUMS抑郁模型構建成功。荊芥揮發油連續給藥5周，能明顯提高糖水偏好率，顯著縮短小鼠懸尾與強迫游泳實驗中不動時間，延長飛濺實驗中的梳洗時間，結合小鼠行為絕望抑郁模型的結果，表明荊芥揮發油具有抗抑郁作用。

近年來研究認為，壓力增加會引起外周和中樞神經系統中的促炎細胞因子釋放，以及大腦中小膠質細胞的激活，特征表現為細胞表面標志物Iba-1的增加。IL-1β和TNF-α作為炎癥介質在細胞信號傳導中發揮重要作用，自身也會影響神經遞質系統、大腦功能和情緒[23]，與抑郁癥的發生、發展較為密切[24]。本研究結果發現，CUMS模型小鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α水平升高，小鼠海馬CA3區Iba-1蛋白表達上調，提示小膠質細胞被激活，荊芥揮發油則能顯著對抗上述變化，表明藥物能抑制小膠質細胞激活，減少炎癥因子釋放，從而抑制神經炎癥來發揮抗抑郁作用。當神經元長期受到應激或受損時，尼氏體會減少、解體甚至消失，常被用于評估神經元損傷表現[25]。與模型組小鼠比較，荊芥揮發油治療后能減輕小鼠海馬CA3區神經元形態病理表現，增加尼氏小體數目，提示藥物對CUMS造模導致的海馬神經元損傷有保護作用。

研究認為，抑郁癥的神經炎癥反應病理機制與小膠質細胞功能變化、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）以及NLRPs等信號通路有關[26]，其中NLRP3炎癥小體被證實參與了抑郁癥的發病機制[27]。NLRP3作為炎癥小體的核心蛋白，組裝ASC和Caspase-1形成NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體被激活后，cleaved Caspase-1切割GSDMD中端和端結構域之間的接頭，然后端GSDMD結構域片段易位到質膜形成膜孔，導致細胞裂解死亡或通過孔分泌成熟狀態的IL-1β、IL-18，誘導一系列炎癥反應，最終引起細胞焦亡[28-29]。本研究結果發現，CUMS抑郁模型小鼠海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、pro IL-1β蛋白表達水平顯著上調，免疫熒光法同樣表明NLRP3、IL-1β蛋白表達量增加，提示模型小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體被激活，致使炎癥因子增加；進一步檢測發現GSDMD、-GSDMD、cleaved Caspase-1表達量增加，提示出現細胞焦亡，進而導致神經元的損傷。研究結果也證實了抑郁癥的發生與NLRP3炎癥小體激活、細胞焦亡發生密切相關。荊芥揮發油治療后，上述蛋白的表達量均呈現下調的表現，表明荊芥揮發油能通過抑制NLRP3炎癥小體激活及細胞焦亡發生，從而減輕神經損傷來發揮抗抑郁作用。

綜上，本研究證實了荊芥揮發油的抗抑郁作用，并提示其抗抑郁作用與抑制NLRP3炎癥小體激活及細胞焦亡、抑制小膠質細胞活化、降低炎癥因子表達等有關。研究結果豐富并拓展了荊芥揮發油良好抗炎作用的應用依據，明確了該揮發油的抗抑郁作用表現。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antidepressant effect and mechanism of essential oil frombased on NLRP3/pyroptosis pathway

QIN Tian-tian1, 2, HUANG Ru-yang1, 2, XIE Hong-xiao1, 2, HU Jing-wen1, 2, ZENG Jiu-seng1, 2, LIU Rong1, 2, ZENG Nan1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To observe the intervention effect of essential oil fromon depression-like behavior in chronic unpredictable mild stress (CUMS) model mice, and investigate its mechanism of regulating NOD-like receptor pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasome and pyroptosis signaling pathway to inhibit neuroinflammation.CUMS depression-like model was established in male ICR mice. According to the preference rate of sugar water, the successful modeling mice were randomly divided into model group, fluoxetine (10 mg/kg) group and essential oil fromhigh-, low-dose (100, 50 mg/kg) groups, and the control group was set at the same time. After five weeks of drug intervention, the sugar water preference test, forced swimming test, tail suspension test and splash test were carried out in mice. After the behavioral test, blood was taken and serum was separated, and hippocampus tissue was taken. Levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) in serum were measured by ELISA. Nissl staining was used to detect the average optical density of Nissl body in hippocampal CA3 neurons. The expressions of NLRP3, cleaved cystein-asparate protease-1 (cleaved Caspase-1), IL-1β and ionized calcium binding adapter molecule-1 (Iba-1) in hippocampus CA3 were detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect the expressions of NLRP3 inflammasome and pyroptosis signaling pathway related proteins in hippocampus.Compared with model group, essential oil fromsignificantly improved the preference rate of sugar water in mice (< 0.01), significantly shortened the immobility time in forced swimming and tail suspension tests (< 0.01, 0.001), and significantly prolonged the grooming time in splash tests (< 0.05), showing the antidepressant-like behavior. The essential oil fromsignificantly decreased the level of IL-1β in serum of mice (< 0.05, 0.01), increased the number of Nissl body in hippocampal CA3 area (< 0.05, 0.01), weakened the average fluorescence intensity of cleaved Caspase-1, IL-1β and Iba-1 in hippocampal CA3 area (< 0.05, 0.01, 0.001), downregulated NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), Caspase-1, cleaved Caspase-1, IL-1β, pro IL-1β, gasdermin-D (GSDMD),-GSDMD and Iba-1 protein expressions in hippocampus (< 0.05, 0.01, 0.001).The essential oil fromcan improve the depression-like behavior of CUMS model mice, and has antidepressant effect. Its mechanism is related to inhibiting the activation of inflammasome of NLRP3 and pyroptosis, and inhibiting the activation of microglia, thus reducing the neuroinflammatory reaction and neuronal injury.

essential oil fromBriq.; depression; chronic unpredictable mild stress; neuroinflammation; NOD-like receptor pyrin domain containing 3; pyroptosis; pulegone; isomenthone; menthone; ()-piperitone

R285.5

A

0253 - 2670(2023)12 - 3878 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.014

2022-12-13

西南特色中藥資源國家重點實驗室開放研究基金項目（2020XSGG002）；國家自然科學基金資助項目（82074094）

秦甜甜，碩士研究生，研究方向為中藥藥理與毒理。E-mail: qinyankao@163.com

通信作者：曾 南，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理和毒理學研究。E-mail: zengnan966@126.com

劉 蓉，教授，研究生導師，主要從事中藥藥理和毒理學研究。E-mail: liurong_1116@126.com

[責任編輯 李亞楠]