東紫蘇化學(xué)成分及其抗炎活性研究

楊 剛，崔小燕，張佳雄，陳態(tài)明，劉亞平，王易芬, 4

東紫蘇化學(xué)成分及其抗炎活性研究

楊 剛1，崔小燕2#，張佳雄3，陳態(tài)明3，劉亞平3*，王易芬1, 4*

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南 昆明 650106 3. 昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500 4. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650201

對(duì)東紫蘇全株的化學(xué)成分及其抗炎活性進(jìn)行研究。采用正相硅膠色譜、Sephadex LH-20凝膠色譜、ODS柱色譜、高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)行分離純化，根據(jù)核磁共振、質(zhì)譜等波譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢測(cè)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)和一氧化氮（NO）的抑制能力，評(píng)價(jià)所分離化合物的抗炎活性。從東紫蘇全株的醋酸乙酯部位分離得到19個(gè)單體化合物，包括7個(gè)黃酮、5個(gè)倍半萜、3個(gè)三萜、3個(gè)甾體及1個(gè)苯丙素類化合物，結(jié)構(gòu)分別鑒定為芹菜素（1）、木犀草素（2）、白楊素（3）、木犀草素-7β葡萄糖苷（4）、圣草酚（5）、喬松素（6）、semecarpanone（7）、咖啡酸乙烯酯（8）、oplodiol（9）、lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane（10）、1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol（11）、teucladiol（12）、caryolane-1,9β-diol（13）、齊墩果酸（14）、烏蘇酸（15）、坡模酸（16）、5α,8α-環(huán)二氧-24()-甲基麥角甾-6,22-二烯-3β-醇（17）、β-谷甾醇（18）、豆甾醇（19）。從東紫蘇中分離獲得19個(gè)單體化合物，其中化合物7、9～13、17首次從該屬植物中分離得到。化合物1、4、9、12～14、17～19能顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬炎癥細(xì)胞中NO的釋放以及抑制炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，具有較好的體外抗炎活性。

東紫蘇；分離鑒定；LPS誘導(dǎo)；抗炎活性；炎癥因子；semecarpanone；oplodiol；5α,8α-環(huán)二氧-24()-甲基麥角甾-6,22-二烯-3β-醇

東紫蘇Vaniot別名鳳尾茶、小山茶、云松茶、小香薷等，為唇形科（Labiatae）香薷屬Willd.多年生草本植物，高25～30 cm，主要分布在云南、貴州和四川等地，全草皆可入藥，可治外感風(fēng)寒、虛火牙痛、消化不良等癥狀，亦可當(dāng)茶飲，具有清熱解毒之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究也表明，東紫蘇具有顯著的抗氧化、抗流感以及抗疲勞等作用[2-4]，其化學(xué)成分主要為黃酮類、三萜類、酚類以及揮發(fā)油類成分等[5]，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了萜類化合物的抗炎活性[6]。東紫蘇的這些功效均與民間用途相關(guān)，進(jìn)一步解析東紫蘇的化學(xué)組成以及傳統(tǒng)用途，對(duì)東紫蘇進(jìn)行化學(xué)成分和抗炎活性研究，尋找其抗炎活性成分。本研究從東紫蘇全株中分離鑒定了19個(gè)單體化合物，運(yùn)用核磁共振技術(shù)（NMR）與質(zhì)譜（MS）等波譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)鑒定了19個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)，分別為芹菜素（apigenin，1）、木犀草素（luteolin，2）、白楊素（chrysin，3）、木犀草素-7β葡萄糖苷（luteolin-7βglucoside，4）、圣草酚（eriodictyol，5）、喬松素（pinocembrin，6）、semecarpanone（7）、咖啡酸乙烯酯（caffeic acid ethylene ester，8）、oplodiol（9）、lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane（10）、1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol （11）、teucladiol（12）、caryolane-1, 9β-diol（13）、齊墩果酸（oleanelic acid，14）、烏蘇酸（ursolic acid，15）、坡模酸（pomolic acid，16）、5α,8α-環(huán)二氧-24()-甲基麥角甾-6,22-二烯-3β-醇 [5α,8α-epidioxy-24()- methylergosta-6,9(11),22- trien-3β-ol，17]、β-谷甾醇（β-sitoster，18）、豆甾醇（stigmasterol，19）。化合物1～7為黃酮類化合物，9～13為倍半萜類化合物，14～16為三萜類化合物，17～19為甾體類化合物，8為苯丙素類化合物，其中7、9～13、17首次從該屬植物中分離得到。利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型，探討東紫蘇單體化合物的抗炎活性。結(jié)果表明，化合物1、4、9、12～14、17～19能顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬炎癥細(xì)胞中NO的釋放以及顯著抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照地塞米松，顯示出較好的抗炎活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

柱色譜硅膠（200～300目）購(gòu)自青島譜科分離材料有限公司。Bruker AV-400和DRX-500超導(dǎo)核磁共振儀，TMS作為內(nèi)標(biāo)。Waters 600半制備型高效液相色譜儀和Shimadzu SIL-20A型制備型高效液相色譜儀，兩者均是雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，色譜柱為COSMOSILRP-C18（250 mm×10 mm，5 μm，COSMOSIL，日本），Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（瑞典烏普拉薩公司），YMC凝膠由日本YMC有限公司生產(chǎn)，反相硅膠填料RP-18購(gòu)自日本FUJI公司，顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液。NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），MTT（sigma-Aldrich，上海），LPS（北京Solarbio公司），TNF-α、IL-6和IL-1β試劑盒（MultiSciences Biotech公司，杭州），陽(yáng)性對(duì)照地塞米松（批號(hào)D1001A，大連美侖生物技術(shù)有限公司）。乙腈為色譜級(jí)（美國(guó)Merck公司），其余工業(yè)級(jí)溶劑均重蒸后使用。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)用東紫蘇于2020年11月購(gòu)買于云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，由昆明理工大學(xué)劉亞平副教授鑒定為東紫蘇Vaniot的全株，植物標(biāo)本（Liu20201103）存放于昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

2 方法

2.1 提取與分離

將東紫蘇全株（5.0 kg）粉碎，加入80%甲醇回流提取4次，每次4 h，減壓濃縮回收溶劑至無(wú)醇味，得到甲醇的粗提取物674 g。向醇提取物中加入適量的水和醋酸乙酯，攪拌均勻，萃取3次得到醋酸乙酯層，觀察到水層有化合物析出，運(yùn)用濾過(guò)離心等純化手段得到化合物4（43 g），將醋酸乙酯層減壓濃縮得到浸膏246 g。用硅膠色譜柱粗分，用氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜（TLC）追蹤檢測(cè)得到5個(gè)餾份Fr. I～V。

Fr. I（20 g）首先用中壓柱MCI分離，用溶劑甲醇-水（8∶2～10∶0）洗脫得到2個(gè)餾份Fr. Ia和Fr. Ib。Fr. Ia用硅膠分離，用石油醚醋酸乙酯（50∶1～10∶1）梯度洗脫得到19（17 mg），重結(jié)晶得到化合物18（100 mg），剩下成分屬于色素?fù)]發(fā)油成分。

Fr. II（50 g）首先用中壓柱MCI分離，用溶劑甲醇-水（8∶2～10∶0）洗脫得到3個(gè)餾份Fr. II（a～c），F(xiàn)r. II a用硅膠分離，經(jīng)過(guò)石油醚-醋酸乙酯（30∶1）等度洗脫得到化合物14（4 mg），F(xiàn)r. II b用硅膠分離，用石油醚-醋酸乙酯（20∶1～10∶1）梯度洗脫，得到化合物15（3 mg）。Fr. II c通過(guò)正相硅膠色譜分離和半制備高效液相純化得到化合物12（4 mg，R＝9.0 min；乙腈-水75∶25，3.0 mL/min）和化合物16（20 mg，R＝17.5 min；乙腈-水75∶25，3.0 mL/min）。

Fr. III（40 g）首先用中壓柱MCI分離，用溶劑甲醇-水（7∶3～10∶0）洗脫得到3個(gè)餾份Fr. III（a～c），F(xiàn)r. Ⅲ a用硅膠分離，用石油醚醋酸乙酯體系梯度洗脫得到化合物17（19 mg），F(xiàn)r. III b用Sephadex LH-20以氯仿-甲醇（1∶1）分離得到化合物6（80 mg）。Fr. III c采用正向色譜柱洗脫，用氯仿-甲醇（50∶1～40∶1）梯度洗脫得到化合物10（5 mg），再經(jīng)半制備高效液相純化得到化合物11（20 mg，R＝7.0 min；乙腈-水67∶33，3.0 mL/min）和9（4 mg，R＝10.0 min；乙腈-水67∶33，3.0 mL/min）。

Fr. IV（35.2 g）首先用中壓柱YMC柱加壓分離，用甲醇-水（4∶6～0∶10）洗脫得到4個(gè)餾份Fr. IV（a～d），F(xiàn)r. IV a用正相硅膠進(jìn)行分離，有晶體析出，為化合物5（30 mg）。Fr. IV b用Sephadex LH-20凝膠柱，以氯仿-甲醇（1∶1）分離得到化合物7（23 mg）。Fr. IV c用正相硅膠進(jìn)行分離得到化合物3（7 mg）和亞餾份Fr. IV c1，將Fr. IV c1采用半制備高效液相純化得到化合物8（4 mg，R＝8.0 min；乙腈-水56∶44，3.0 mL/min）與13（8 mg，R＝14.5 min；乙腈-水56∶44，3.0 mL/min）。

Fr. V（12.9 g）采用硅膠劃段，用氯仿-甲醇（10∶1～0∶1）梯度洗脫，TLC追蹤監(jiān)測(cè)得到2個(gè)餾份Fr. V（a～b），F(xiàn)r. Va用正相硅膠進(jìn)行分離，再經(jīng)Sephadex LH-20分離得到化合物1（92 mg），F(xiàn)r. Vb用中壓柱YMC分離，洗脫劑為甲醇-水（30∶70）得到化合物2（20 mg）。

2.2 體外抗炎活性評(píng)價(jià)

按照文獻(xiàn)方法[7]，將RAW 264.7巨噬細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板上，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組、陽(yáng)性對(duì)照地塞米松（dexamethasone，DEX）組和實(shí)驗(yàn)組，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均以20 μg/mL待測(cè)的單體化合物1～19或DEX加入到處理好的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中。放置4 h后在對(duì)照組加入10 μL的培養(yǎng)基，其余組加入LPS（1.0 μg/mL）用以誘導(dǎo)細(xì)胞，培養(yǎng)孵育24 h，離心，收集細(xì)胞上層清液，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定NO的釋放量，然后優(yōu)選出具有較好抑制活性的化合物。然后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，測(cè)定RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表達(dá)量。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測(cè)化合物在20 μg/mL對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，ESI-MS/: 269 [M－H]?，分子式為C15H10O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.97 (1H, s, 5-OH), 10.58 (1H, brs, 7-OH), 7.93 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.93 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 6.79 (1H, s, H-3), 6.49 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 164.2 (C-2), 102.8 (C-3), 181.7 (C-4), 161.4 (C-5), 98.8 (C-6), 163.2 (C-7), 93.9 (C-8), 157.3 (C-9), 103.7 (C-10), 121.1 (C-1), 128.4 (C-2, 6), 115.9 (C-3, 5), 161.2 (C-4)，以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[8]，鑒定化合物1為芹菜素。

化合物2：黃色粉末，ESI-MS/: 287 [M＋H]+，分子式為C15H10O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.96 (1H, s, 5-OH), 7.41 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 7.38 (1H, brs, H-2), 6.88 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.65 (1H, s, H-3), 6.43 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,=2.4 Hz, H-6)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 163.9 (C-2), 102.8 (C-3), 180.6 (C-4), 161.4 (C-5), 98.8 (C-6), 164.2 (C-7), 93.8 (C-8), 157.3 (C-9), 103.6 (C-10), 121.5 (C-1), 113.3 (C-2), 145.7 (C-3), 149.7 (C-4), 116.0 (C-5), 119.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[9]，鑒定化合物2為木犀草素。

化合物3：淡黃色粉末，ESI-MS/: 253 [M－H]?，分子式為C15H10O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.79 (1H, s, 5-OH), 10.88 (1H, s, 7-OH), 8.01 (2H, d,= 6.8 Hz, H-2′, 6′), 7.53 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.91 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 157.4 (C-2), 105.1 (C-3), 181.8 (C-4), 161.4 (C-5), 99.0 (C-6), 164.4 (C-7), 94.1 (C-8), 163.1 (C-9), 105.9 (C-10), 130.7 (C-1′), 126.3 (C-2′, C-6′), 129.1 (C-3′, C-5′), 131.9 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)[10]，鑒定化合物3為白楊素。

化合物4：淡黃色粉末，ESI-MS/: 447 [M－H]?，分子式為C21H20O11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.98 (1H, s, 5-OH), 9.68 (1H, s, 3′-OH), 7.43 (1H, dd,= 8.4, 1.6 Hz, Hz-6′), 7.21 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2′), 6.88 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.77 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.42 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6), 5.06 (1H, d,= 6.0 Hz, Glc-H-1), 3.40～3.10 (6H, overlapped, Glc-H-2～5, 6a, 6b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 162.9 (C-2), 105.3 (C-3), 181.9 (C-4), 161.1 (C-5), 99.5 (C-6), 164.4 (C-7), 94.6 (C-8), 156.9 (C-9), 103.1 (C-10), 121.3 (C-1′), 113.5 (C-2′), 145.8 (C-3′), 149.9 (C-4′), 115.9 (C-5′), 119.1 (C-6′), 99.8 (Glc-C-1), 73.0 (Glc- C-2), 76.3 (Glc-C-3), 77.1 (Glc-C-4), 69.4 (Glc-C-5), 60.5 (Glc-C-6)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[11]，鑒定化合物4為木犀草素-7β葡萄糖苷。

化合物5：黃色粉末，ESI-MS/: 289 [M＋H]+，分子式為C15H12O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.4 (1H, s, 5-OH), 9.04 (2H, s, 3, 4-OH), 6.87 (1H, brs, H-2), 6.74 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 5.88 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 5.87 (1H, d,= 2.4 Hz, H-6), 5.38 (1H, dd,= 10.0, 2.4 Hz, H-2), 3.18 (1H, dd,= 14.0, 10.0 Hz, H-3a), 2.67 (1H, dd,= 14.0, 2.4 Hz, H-3b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.4 (C-2), 42.0 (C-3), 196.3 (C-4), 163.4 (C-5), 95.7 (C-6), 165.6 (C-7), 94.9 (C-8), 162.9 (C-9), 101.7 (C-10), 129.4 (C-1), 114.3 (C-2), 145.7 (C-3), 145.2 (C-4), 115.3 (C-5), 117.9 (C-6)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[12]，鑒定化合物5為圣草酚。

化合物6：白色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS/: 257 [M－H]?，分子式為C15H12O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.11 (1H, s, 5-OH), 7.51～7.37 (5H, m, H-2～6), 5.91 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6), 5.89 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 5.57 (1H, dd,= 12.4, 3.8 Hz, H-2), 3.16 (1H, dd,= 16.0, 12.4 Hz, H-3a), 2.77 (1H, dd,= 16.0, 3.8 Hz, H-3b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.3 (C-2), 42.1 (C-3), 195.9 (C-4), 162.7 (C-5), 95.1 (C-6), 166.9 (C-7), 95.9 (C-8), 163.5 (C-9), 101.7 (C-10), 138.7 (C-1), 126.6 (C-2, 6), 128.5 (C-3～5)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[13]，鑒定化合物6為喬松素。

化合物7：黃色粉末，ESI-MS/: 597 [M－H]?，分子式為C30H30O13。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 12.01 (2H, s, 5-OHⅠ, 5-OHⅡ), 5.85 (2H, dd,= 2.4, 1.6 Hz, H-6Ⅰ, 6Ⅱ), 5.82 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8Ⅱ), 5.78 (1H, d,= 2.6 Hz, H-8Ⅰ), 4.89 (1H, m, H-2Ⅰ), 4.64 (1H, m, H-2Ⅱ), 3.57 (6H, s, 1-OMeⅠ, 1-OMeⅡ), 3.37 (2H, m, H-3Ⅰ,3Ⅱ), 2.89 (4H, m, H-3Ⅰ,3Ⅱ), 2.73 (4H, m, H-2Ⅰ,2Ⅱ), 2.26 (3H, s, H-5Ⅰ-CH3), 2.23 (3H, s, H- 5Ⅱ-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-d): 76.0 (C-2Ⅰ), 38.6 (C-3Ⅰ), 195.8 (C-4Ⅰ), 101.6 (C-4aⅠ), 162.2 (C-5Ⅰ), 96.0 (C-6Ⅰ), 163.4 (C-7Ⅰ), 94.8 (C-8Ⅰ), 166.5 (C-8aⅠ), 172.2 (C-1Ⅰ), 29.9 (C-2Ⅰ), 51.0 (C-3Ⅰ), 208.0 (C-4Ⅰ), 31.2 (C-5Ⅰ), 51.7 (1-OMe), 77.0 (C-2Ⅱ), 38.3 (C-3Ⅱ), 195.3 (C-4Ⅱ), 101.6 (C-4aⅡ), 162.1 (C-5Ⅱ), 96.1 (C-6Ⅱ), 163.4 (C-7Ⅱ), 94.8 (C-8Ⅱ), 166.5 (C-8aⅡ), 171.8 (C-1Ⅱ), 31.3 (C-2Ⅱ), 51.0 (C-3Ⅱ), 206.9 (C-4Ⅱ), 29.4 (C-5Ⅱ), 51.5 (1-OMe)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[14]，鑒定化合物7為semecarpanone。

化合物8：淡黃色粉末，ESI-MS/: 207 [M＋H]+，分子式為C11H10O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.63 (1H, d,= 12.8 Hz, H-7), 7.34 (1H, dd,= 4.8, 1.2 Hz, H-10), 7.11 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.07 (1H, dd,= 6.4, 1.6 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 6.4 Hz, H-5), 6.34 (1H, d,= 12.8 Hz, H-8), 4.87 (1H, dd,= 11.2, 1.2 Hz, H-11a), 4.69 (1H, dd,= 11.2, 4.8 Hz, H-11b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 125.2 (C-1), 115.0 (C-2), 145.6 (C-3), 149.1 (C-4), 115.7 (C-5), 122.0 (C-6), 147.4 (C-7), 112.0 (C-8), 163.8 (C-9), 141.4 (C-10), 97.9 (C-11)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[15]，鑒定化合物8為咖啡酸乙烯酯。

化合物9：白色粉末，ESI-MS/: 239 [M－H]?，分子式為C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.25 (1H, brd,= 4.8 Hz, H-8), 4.25 (1H, s, 1-OH), 3.78 (1H, s, 4-OH), 3.05 (1H, d,= 8.8 Hz, H-1), 2.11 (1H, m, H-11), 1.95～1.57 (8H, m, H-2, H-3, H-6, H-9), 1.03 (3H, s, CH3-15), 0.98 (6H, d,= 5.6 Hz, 12, 13-CH3), 0.83 (3H, s, CH3-14)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.1 (C-1), 26.9 (C-2), 39.8 (C-3), 69.0 (C-4), 46.1 (C-5), 22.9 (C-6), 141.8 (C-7), 115.9 (C-8), 40.5 (C-9), 37.3 (C-10), 34.5 (C-11), 21.1 (C-12), 21.8 (C-13), 11.7 (C-14), 29.6 (C-15)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[16]，鑒定化合物9為oplodiol。

化合物10：白色粉末，ESI-MS/: 257 [M－H]?，分子式為C15H28O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.62 (1H, d,= 2.4 Hz, 1-OH), 5.45 (1H, s, 4-OH), 4.33 (1H, d,= 3.6 Hz, 6-OH), 3.05 (1H, dt,= 4.0, 7.6 Hz, H-1), 1.96 (1H, m, H-11), 1.16 (3H, s, CH3-15), 1.03 (3H, d,= 5.2 Hz, 12-CH3), 0.86 (3H, d,= 5.2 Hz, 13-CH3), 0.80 (3H, s, 14-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 77.8 (C-1), 28.1 (C-2), 35.7 (C-3), 71.8 (C-4), 46.4 (C-5), 71.8 (C-6), 49.7 (C-7), 23.5 (C-8), 40.3 (C-9), 40.0 (C-10), 24.8 (C-11), 22.2 (C-12), 22.4 (C-13), 14.0 (C-14), 24.5 (C-15)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，鑒定化合物10為lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane。

化合物11：無(wú)色油狀物，ESI-MS/: 255 [M＋H]+，分子式為C15H28O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.85 (1H, d,= 5.2 Hz, 6-OH), 3.38 (1H, m, H-6), 3.02 (1H, dd,= 8.8, 6.0 Hz, H-1), 2.72 (1H, d,= 8 Hz, H-5), 2.14-1.54 (8H, m, H-2, 3, 8, 9), 1.54 (1H, m, H-11), 1.29 (3H, s, CH3-15), 1.23 (3H, s, CH3-14), 0.86 (6H, d,= 6.2 Hz, 12, 13-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 59.0 (C-1), 24.2 (C-2), 34.1 (C-3), 58.9 (C-4), 67.6 (C-5), 68.7 (C-6), 48.9 (C-7), 22.6 (C-8), 40.5 (C-9), 59.3 (C-10), 31.5 (C-11), 20.5 (C-12, C-13), 16.5 (C-14), 16.4 (C-15)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[19]，鑒定化合物11為1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol。

化合物12：無(wú)色透明油狀物，ESI-MS/: 239 [M－H]?，分子式為C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.65 (2H, d,= 13.2 Hz, H-14a, 14b), 4.41 (1H, s, 4-OH), 3.85 (1H, dd,= 6.8, 3.2 Hz, H-6), 3.78 (1H, d,= 3.2 Hz, 6-OH), 2.19 (1H, dd,= 8.8, 3.2 Hz, H-1), 2.01 (1H, m, H-7), 1.55 (8H, m, H-2, 3, 8, 9), 1.16 (3H, s, CH3-15), 0.92 (3H, d,= 5.2 Hz, CH3-12), 0.87 (3H, d,= 5.2 Hz, CH3-13)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 42.8 (C-1), 26.4 (C-2), 40.4 (C-3), 79.5 (C-4), 60.0 (C-5), 70.6 (C-6), 48.3 (C-7), 23.4 (C-8), 36.6 (C-9), 153.2 (C-10), 29.2 (C-11), 21.5 (C-12), 21.4 (C-13), 106.9 (C-14), 23.9 (C-15)，以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]。鑒定化合物12為teucladiol。

化合物13：白色粉末，ESI-MS/: 239 [M－H]?，分子式為C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.22 (1H, d,= 2.8 Hz, 9-OH), 3.93 (1H, s, 1-OH), 3.17 (1H, dd,= 14.8, 2.0 Hz, H-9), 2.09 (1H, m, H-2), 1.88 (2H, m, H-3), 1.78 (1H, m, H-5), 0.93 (6H, s, 13, 14-CH3), 0.76 (3H, s, CH3-15)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-d): 69.0 (C-1), 38.1 (C-2), 34.1 (C-3), 34.2 (C-4), 43.0 (C-5), 20.2 (C-6), 35.0 (C-7), 38.8 (C-8), 70.2 (C-9), 28.0 (C-10), 33.3 (C-11), 43.1 (C-12), 20.9 (C-13), 30.5 (C-14), 27.2 (C-15)，以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[22]，鑒定化合物13為caryolane-1, 9β-diol。

化合物14：白色粉末，ESI-MS/: 455 [M－H]?，分子式為C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.28 (1H, brs, H-12), 3.21 (1H, dd,= 10.4, 4.0 Hz, H-3), 2.81 (1H, dd,= 13.6, 4.0 Hz, H-18), 1.13 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-27), 0.92 (3H, s, H-24), 0.90 (3H, s, H-29), 0.89 (3H, s, H-30), 0.76 (3H, s, H-25), 0.74 (3H, s, H-26)；13C-NMR (125 Hz, CDCl3): 38.7 (C-1), 28.0 (C-2), 79.0 (C-3), 38.3 (C-4), 55.1 (C-5), 18.2 (C-6), 33.7 (C-7), 39.2 (C-8), 47.6 (C-9), 37.0 (C-10), 27.9 (C-11), 122.6 (C-12), 143.5 (C-13), 41.5 (C-14), 27.6 (C-15), 23.3 (C-16), 45.8 (C-17), 40.9 (C-18), 46.4 (C-19), 30.6 (C-20), 33.7 (C-21), 32.5 (C-22), 27.1 (C-23), 15.5 (C-24), 15.3 (C-25), 17.1 (C-26), 25.9 (C-27), 182.7 (C-28), 32.4 (C-29), 23.5 (C-30)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[23]，鑒定化合物14為齊墩果酸。

化合物15：白色粉末，ESI-MS/: 455 [M－H]?，分子式為C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 5.12 (1H, t,= 6.8 Hz, H-12), 4.28 (1H, d,= 5.2 Hz, 3-OH), 2.99 (1H, m, H-3), 1.03 (3H, s, H-23), 0.89 (3H, s, H-25), 0.89 (3H, d,= 7.4 Hz, H-30), 0.86 (3H, s, H-26), 0.80 (3H, d,= 7.6 Hz, H-29), 0.74 (3H, s, H-24), 0.67 (3H, s, H-27)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 38.2 (C-1), 27.5 (C-2), 76.8 (C-3), 38.3 (C-4), 54.7 (C-5), 17.9 (C-6), 32.6 (C-7), 41.6 (C-8), 47.0 (C-9), 35.5 (C-10), 22.8 (C-11), 124.5 (C-12), 138.1 (C-13), 40.0 (C-14), 26.9 (C-15), 23.8 (C-16), 46.8 (C-17), 52.3 (C-18), 38.4 (C-19), 38.4 (C-20), 30.1 (C-21), 35.3 (C-22), 28.2 (C-23), 15.2 (C-24), 16.0 (C-25), 16.9 (C-26), 23.2 (C-27), 178.2 (C-28), 17.0 (C-29), 21.0 (C-30)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[24]，鑒定化合物15為烏蘇酸。

化合物16：白色粉末，ESI-MS/: 473 [M－H]?，分子式為C30H48O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 5.16 (1H, t,= 5.6 Hz, H-12), 4.29 (1H, d,= 4.4 Hz, 3-OH), 3.75 (1H, s, 19-OH), 3.00 (1H, m, H-3), 1.28 (3H, s, H-27), 1.03 (3H, s, H-26), 0.90 (3H, s, H-23), 0.89 (3H, s, H-24), 0.85 (3H, d,= 2.4 Hz, H-30), 0.80 (3H, s, H-29), 0.74 (3H, s, H-25)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 38.1 (C-1), 27.0 (C-2), 76.9 (C-3), 38.4 (C-4), 54.8 (C-5), 18.1 (C-6), 32.7 (C-7), 40.1 (C-8), 46.7 (C-9), 36.5 (C-10), 23.1 (C-11), 126.8 (C-12), 138.6 (C-13), 41.1 (C-14), 28.1 (C-15), 25.2 (C-16), 46.9 (C-17), 53.2 (C-18), 71.6 (C-19), 41.4 (C-20), 25.9 (C-21), 37.2 (C-22), 28.2 (C-23), 16.0 (C-24), 16.3 (C-25), 16.0 (C-26), 23.9 (C-27), 178.9 (C-28), 26.4 (C-29), 15.1 (C-30)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[25]，鑒定化合物16為3β,19α-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸。

化合物17：無(wú)色油狀物，ESI-MS/: 427 [M－H]?，分子式為C28H44O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.50 (1H, d,= 6.8 Hz, H-7), 6.24 (1H, d,= 6.8 Hz, H-6), 5.22 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-22), 5.18 (1H, dd,= 12.0, 6.4 Hz, H-23), 3.97 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d,= 5.6 Hz, H-27), 0.90 (3H, d,= 5.6 Hz, H-28), 0.87 (3H, s, H-19), 0.83 (3H, d,= 4.2 Hz, H-26), 0.82 (3H, d,= 4.2 Hz, H-21), 0.81 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 Hz, CDCl3): 34.6 (C-1), 31.9 (C-2), 66.5 (C-3), 36.8 (C-4), 82.1 (C-5), 135.4 (C-6), 130.7 (C-7), 79.4 (C-8), 51.0 (C-9), 36.9 (C-10), 20.6 (C-11), 39.3 (C-12), 44.5 (C-13), 51.0 (C-14), 23.4 (C-15), 28.6 (C-16), 56.1 (C-17), 12.8 (C-18), 18.1 (C-19), 39.7 (C-20), 20.8 (C-21), 135.2 (C-22), 132.3 (C-23), 42.7 (C-24), 33.0 (C-25), 19.6 (C-26), 19.9 (C-27), 17.5 (C-28)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[26]，鑒定化合物17為5α,8α-環(huán)二氧-24()-甲基麥角甾- 6,22-二烯-3β-醇。

化合物18、19與β-谷甾醇、豆甾醇對(duì)照品共薄層，不同體系展開劑展開Rf值相同，與對(duì)照品混合熔點(diǎn)不下降，故確定化合物18為β-谷甾醇，化合物為19豆甾醇。

4 抗炎活性的評(píng)價(jià)

通過(guò)檢測(cè)化合物1～19對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞中NO的釋放量，然后優(yōu)選出具有較好抑制活性的化合物，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中炎癥因子（TNF-、IL-6和IL-1β）的分泌量來(lái)評(píng)價(jià)其抗炎活性，結(jié)果見圖1。圖中LPS為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)組，Dex為陽(yáng)性對(duì)照組，1～19為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞中NO的釋放以及炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌顯著升高。與LPS組相比，大多數(shù)化合物在20 μg/mL的質(zhì)量濃度下都能較好地抑制NO的釋放以及炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌，化合物4、7、9、12～14、17～19均能較好地抑制NO的釋放，其中化合物19抑制NO釋放的能力相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照組。根據(jù)抑制NO的抑制效果，選取化合物4、7、9、12～14、17～19進(jìn)行炎癥因子的測(cè)定，結(jié)果表明化合物4、9能夠較好地抑制TNF-α分泌，其中化合物9的抑制效果與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)；化合物4、9、12～14、17、19在抑制IL-6的分泌上表現(xiàn)出更好的作用，其中13、19的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組；化合物4、9、12、13、17、19在抑制IL-1β的分泌上展現(xiàn)出更好的抑制率，其中4的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（圖1）。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)東紫蘇全株的醋酸乙酯層進(jìn)行研究，從中分離并鑒定單體化合物19個(gè)，化合物1～7為黃酮類化合物，9～13為倍半萜類化合物，14～16為三萜類化合物，17～19為甾體類化合物，8為苯丙素類化合物，其中7、9～13、17首次從該屬中分離得到。體外抗炎活性結(jié)果表明大多數(shù)化合物在20 μg/mL下均能有效抑制NO的釋放，化合物4、9能夠較好地抑制TNF-α分泌，化合物4、12～14、19在抑制IL-6的分泌上展現(xiàn)出更好的抑制活性，化合物4、9、12、13、17、19在抑制IL-1β的分泌上展現(xiàn)出更好的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)豐富了東紫蘇中化合物種類和藥理活性的研究，進(jìn)一步闡述了東紫蘇的藥用價(jià)值，為后續(xù)東紫蘇的活性篩選提供理論支撐和研究方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志(第六十六卷) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1977: 304.

[2] 張海濤, 張亞光, 毛媛, 等. 東紫蘇揮發(fā)油的化學(xué)組成及其抗氧化活性研究 [J]. 中國(guó)林副特產(chǎn), 2022(2): 15-17.

[3] 楊琳?qǐng)? 杜江超, 邵亮, 等. 東紫蘇中黃酮類成分及其抗流感活性研究 [J]. 昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2020, 45(6): 104-110.

[4] 王猛, 顏克亮, 楊瑩, 等. 東紫蘇提取物抗疲勞及抗氧化作用的研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2020, 22(5): 1641-1647.

[5] 王春梅, 龍平, 許利嘉, 等. 鳳尾茶的來(lái)源及近代研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2013, 15(3): 250-255.

[6] 汪電雷, 陳衛(wèi)東, 徐先祥. 茯苓總?cè)频目寡鬃饔醚芯?[J]. 安徽醫(yī)藥, 2009, 13(9): 1021-1023.

[7] Yang M L, Wang Y D, Patel G,.andanti-inflammatory effects of different extracts fromthrough down-regulation of NF-κB and MAPK signaling pathways [J]., 2020, 261: 113105.

[8] 劉俊霞, 侯微, 竇鳳鳴, 等. 五味子藤莖正丁醇部位化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(13): 1878-1882.

[9] 孫麗君, 常福厚, 白圖雅, 等. 山苦荬保肝活性部位篩選及其化學(xué)成分研究 [J]. 中國(guó)藥房, 2021, 32(9): 1089-1092.

[10] 向康林, 韓慶通, 趙琳, 等. 粘毛黃芩全草的化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(24): 5917-5923.

[11] 李勝華. 雞眼草中黃酮類化學(xué)成分研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2014, 49(10): 817-820.

[12] 侯勇, 厲博文, 張廣杰, 等. 楊樹花化學(xué)成分的分離鑒定Ⅱ [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(23): 77-81.

[13] 張瀟, 蒙春旺, 何亞聰, 等. 趕黃草黃酮類化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2017, 48(1): 31-35.

[14] Dang P H, Nguyen T T, Le T H,. A new bischromanone from the stems of[J]., 2018, 32(15): 1745-1750.

[15] 姚士, 徐乃玉, 褚純雋, 等. 藍(lán)萼香茶菜的抗補(bǔ)體活性成分研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(2): 199-203.

[16] Kuo Y H, Lo J M, Chan Y F. Cytotoxic components from the leaves of[J]., 2002, 49(3): 427-431.

[17] Hu Y M, Liu C, Cheng K W,. Sesquiterpenoids fromaffect osteoblast proliferation, differentiation and mineralization[J]., 2008, 69(12): 2367-2373.

[18] García-Granados A, Martínez A, Onorato M E,.Chemical-microbiological synthesis of 6β-eudesmanolides bycultures from eudesmanes with functions at C-1 and C-6 [J]., 1991, 47(1): 91-102.

[19] Sanz J F, Marco J A. A germacrane derivative from[J]., 1991, 30(8): 2788-2790.

[20] Bruno M, Torre M C, Rodríguez B,Guaiane sesquiterpenes from[J]., 1993, 34(1): 245-247.

[21] Ono M, Yamashita M, Mori K R,. Sesquiterpenoids, triterpenoids, and flavonoids from the fruits of[J]., 2008, 14(5): 499-508.

[22] 王富強(qiáng), 孫立秋, 王金蘭, 等. 兔兒傘化學(xué)成分研究(II) [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 2878-2885.

[23] 李平, 隆李萍, 陶娥, 等. 雀兒舌頭化學(xué)成分的分離與鑒定 [J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 39(10): 1197-1203.

[24] 張德莉, 李曉強(qiáng). 毛泡桐葉化學(xué)成分研究 [J]. 中藥材, 2011, 34(2): 232-234.

[25] 陳紅, 陳敏, 黃澤豪, 等. 巴戟天的化學(xué)成分研究 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(21): 69-71.

[26] 蘇日娜, 武海波, 王文蜀. 暗花金挖耳化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2012, 43(9): 1721-1723.

Chemical constituents fromand their anti-inflammatory activities

YANG Gang1, CUI Xiao-yan2, ZHANG Jia-xiong3, CHEN Tai-ming3, LIU Ya-ping3, WANG Yi-fen1, 4

1. School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Kunming Medical University Haiyuan Collage, Kunming 650106, China 3. Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 4. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China

The purpose was to analyze the chemical compositions and their anti-inflammatory activities from.The separation and purification of compounds were performed by normal-phase silica gel chromatography column (CC), Sephadex LH-20 CC, ODS CC, and high-performance liquid chromatography (HPLC). The structures of the isolated compounds were identified based on the nuclear magnetic resonance spectroscopies (NMR) data and comparison with corresponding data of the reported literature. All the isolated compounds were assessed for their anti-inflammatory effects via detecting inflammatory mediator releases (IL-6, IL-1β, TNF-α) and NO medium level in RAW 264.7 macrophage cells induced by LPS.A total of 19 compounds were isolated from the ethyl acetate layer of, including 7 flavonoids, 5 sesquiterpenoids, 3 triterpenoids, 3 steroids and 1 phenylpropanoids compound. The structures of these isolates were unambiguously identified as apigenin (1), luteolin (2), chrysin (3), luteolin-7βglucoside (4), eriodictyol (5), pinocembrin (6), semecarpanone (7), caffeic acid ethylene ester (8), oplodiol (9), lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane (10), 1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol (11), teucladiol (12), caryolane-1,9β-diol (13), oleanelic acid (14), ursolic acid (15), pomolic acid (16), 5α,8α-epidioxy-24()- methylergosta-6, 9(11), 22-trien-3β-ol (17), β-sitoster (18), stigmasterol (19).Compounds 7, 9—13 and 17 are isolated from this genusfor the first time. Compounds 1, 4, 9, 12—14 and 17—19 significantly reduce the release of NO and inhibited the secretion of inflammatory mediators (IL-6、IL-1β、TNF-α) in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages cells at the concentration of 20μg·mL?1, comparable to DXM used as the positive control, which suggested thatmight be possess the anti-inflammatory activity.

Vaniot; isolated and identified; LPS induction; anti-inflammatory activity; inflammatory factors; semecarpanone; oplodiol; 5α, 8α-epidioxy-24()-methylergosta-6, 9(11), 22-trien-3β-ol

R284.1

A

0253 - 2670(2023)12 - 3777 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.004

2023-03-08

云南省基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目（202101AT070436，202101BE070001-053）

楊剛（1998—），男，在讀碩士，專業(yè)方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: 2661436316@qq.com

通信作者：王易芬，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)與物質(zhì)資源。E-mail: wangyifen@mail.kiz.ac.cn

劉亞平，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)與物質(zhì)資源。E-mail: liuyaping@kust.edu.cn

#并列第一作者：崔小燕（1986—），女，副教授，研究方向?yàn)橛袡C(jī)化學(xué)。E-mail: cuixiaoyan910@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]