9個歐洲李品種自交不親和S-RNase基因的克隆及序列分析

王亞銅,玉米提·玉素甫,耿文娟,章世奎,孫召展,王紹鵬,王尚棟,樊國全

(1.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃,新疆輪臺 841600;2新疆農業大學園藝學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】自交不親和性(self-incompatibility,SI)是植物花粉與雌蕊之間的相互識別,防止其近親繁殖的一種生殖機制。歐洲李(PrunusdomesticaL.)屬于薔薇科果樹,該系列優良品種在新疆喀什、阿克蘇等地區均有栽培,其中喀什地區栽培面積最大,2021年為4.25×104hm2[1]。法蘭西是該系列品種中主栽品種之一,女神、斯泰勒等品種是繼法蘭西之后的栽培品種。歐洲李系列品種大部分自花不能結實或自交結實率較低[2-3],屬于典型的配子體自交不親和性果樹(self-incompatibility,GSI),在生產中需要配置適宜的授粉樹才能保證一定的經濟效益。GSI由一個具有復等位基因的S位點(S-locus)控制,當花粉與雌蕊中的其中一個S等位基因相同時,花粉無法識別或花粉管生長受到抑制,從而表現為自交不親和。鑒定歐洲李品種的S基因型并預測授粉品種之間的親和性,對生產果園合理配置授粉樹及雜交育種親本的選擇具有重要意義。【前人研究進展】早期通過田間授粉、IEF-PAGE和SDS-PAGE方法鑒定品種的S基因型。隨著S基因PCR鑒定技術的發展,并以田間授粉予以輔助驗證,S基因型鑒定已在部分薔薇科核果類果樹中取得了較大進展,如在杏(Prunusarmeniaca)[4-6]、甜櫻桃(Prunusavium)[7-8]、扁桃(Prunusdulicis)[9-10]等樹種上都成功鑒定出了S-RNase基因,并以鑒定的86份仁用杏S基因型為基礎,構建了雜交組合數據庫。李S基因相關的報道主要集中在中國李和杏李中,張樹軍等[11]從15個槜李等品種中鑒定出了9個新的S-RNase基因,分別為S15～S22和S27。朱福榮等[12]結合田間授粉驗證,對桐鄉槜李及其4個授粉品種進行了S-RNase基因鑒定,結果表明4個授粉品種不適宜作為槜李的授粉樹。李芳東等[13-14]先后確定了味王、味厚等7個杏李S-RNase基因型和花粉SFB基因型。李洪果[15]利用RT-PCR技術鑒定了45個李和杏李品種的S基因型,并根據花期、單果重和內在品質等多個性狀指標篩選出了66對可供進行授粉雜交的組合。目前,已有近70個李和杏李品種的S基因型被相繼鑒定。歐陽麗婷等[16]認為野生歐洲李屬于異交為主的混合交配系統,具有一定的自交可能。王斐[2]、馮貝貝等[3]利用田間授粉驗證了栽培歐洲李品種屬于自交不親和果樹,并通過不同品種間的坐果率確定了授粉樹。【本研究切入點】目前國內主要對歐洲李的研究集中在資源調查、引種栽培、部分生物學特性及組織培養等方面[17-20],但關于S基因方面的研究還未見報道。研究鑒定歐洲李品種自交不親和S-RNase基因型,有助于合理配置授粉品種、高效育種及提高生產效率。【擬解決的關鍵問題】利用PCR和DNA測序技術鑒定9個歐洲李品種的S基因型,以豐富歐洲李品種S基因型信息,為雜交育種親本的選擇和授粉樹的配置提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

9個試驗品種采自新疆農業科學院輪臺果樹資源圃2號種質保存圃(84°22′E、41°78′N,海拔906 m),分別是法蘭西、女神、斯泰勒、理查德早生、塔城酸梅、烏孜干1號、總統、Silvia及Decbrowice。該保存圃地勢平坦,園相整齊,水肥管理良好。試驗樹均于2013年定植,株行距為2 m×4 m,樹體生長良好。2021年4月下旬采集各品種幼嫩的葉片用硅膠保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 葉片DNA提取

參照新型植物基因組DNAsecure試劑盒(天根科技生化有限公司)提取歐洲李葉片DNA,用超微量紫外可見分光光度儀(型號ND5000)在260和280 nm處測定吸收值確定DNA的質量,1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定抽提DNA的完整性。

1.2.2 引物

選取2對薔薇科通用引物組合,分別為Pru-C2/PruCE-R、EM-PC2consFD/EM-PC3consRD。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。表1

表1 選取的引物組合及其序列

1.2.3 S基因的特異性PCR擴增

利用2對引物組合對試驗品種進行PCR擴增,擴增體系和程序參考Ortega等[23]方法,并在此基礎上略作調正,PCR反應為30 μL:DNA模板2 μL,3 μL 10×Buffer,1 μL dNTP(濃度50 ng/mL),1 μL正反向引物(濃度10 mmol/L),1 μLTaqDNA聚合酶,21 μL ddH2O。PCR反應程序:95℃預變性10 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40個循環后72℃延伸5 min。

1.2.4 S基因的克隆測序

用瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物,回收并純化目的基因條帶,連接至pMD18-T克隆載體,轉化XL10-Gold感受態細胞,藍白斑篩選后挑取單菌落于LB培養基中搖菌,酶切法鑒定陽性菌落,挑取質粒送青島鵬翔生物科技有限公司測序,3次重復測序。

1.3 數據處理

測序結果用生物信息學軟件進行校正分析,將校正后的測序結果在NCBI中Blast搜索比對同源性并分析序列,確定供試品種S基因型。

2 結果與分析

2.1 歐洲李品種 S-RNase基因的PCR擴增

研究表明,9個歐洲李品種均擴增出2條帶,檢測出13個大小不同的片段,片段長度在308～830 bp,其中引物Pru-C2+PruCE-R擴增出6個大小不同的片段,包括:308 bp(理查德早生等)、309 bp(Silvia等)、473 bp(女神)、653 bp(斯泰勒)、659 bp(烏孜干1號)、662 bp(烏孜干1號),引物EM-PC2consFD+EM-PC3consRD擴增出6個大小不同的片段,包括330 bp(法蘭西等)331 bp(理查德早生等)、482 bp(總統)、678 bp(塔城酸梅)、736 bp(Decbrowice)、828 bp(Silvia)、830 bp(法蘭西等)。圖1,圖2

注:M為2 000 bp的Marker,1.理查德早生;2.烏孜干1號;3.Silvia;4.法蘭西;5.總統;6.Decbrowice;7.斯泰勒;8.女神;9.塔城酸梅

注:M為2 000 bp的Marker,10.理查德早生;11.烏孜干1號;12.Silvia;13.法蘭西;14.總統;15.Decbrowice;16.斯泰勒;17.女神;18.塔城酸梅

2.2 歐洲李S-RNase基因型鑒定

研究表明,僅有1條S-RNase基因序列與已登錄的歐洲李S-RNase基因序列同源性僅為96%,其它序列均高度同源。

不同引物擴增出的308、331 bp兩個大小不同的基因片段與S1-RNase基因同源性為100%,屬于同一種S-RNase基因。同一種引物擴增出的序列長度相近的片段也有可能屬于同一種基因,如330 bp與331 bp、659 bp與662 bp、828 bp與830 bp。根據13個基因片段在GenBank中的同源性比對結果,確定了7條不同的歐洲李S-RNase等位基因,鑒定出了9個參試品種中的8個歐洲李品種的S-RNase基因型,其中塔城酸梅僅鑒定出具有S1-RNase等位基因。理查德早生和斯泰勒基因型相同為S1S9;法蘭西和Silvia基因型相同為S1S5;烏孜干1號、總統、Decbrowice和女神4個品種的S基因型分別為S1S11、S6SSJ、S1SSJ和SSAS11。表2

表2 13個基因片段在GenBank上的比對

2.3 歐洲李S基因頻率

研究表明,理查德早生、斯泰勒等7個品種共有1條S1-RNase基因,法蘭西和Silvia、理查德早生和斯泰勒分別具有S5和S9基因,總統和Decbrowice、女神和烏孜干1號分別具有SSJ和S11基因,各個S基因出現的頻率具有較大差異,其中S1基因出現的頻率最高為66.7%;S6、SSA基因出現的頻率最低為11.1%。

2.4 供試品種在薔薇科李亞科S-RNase基因遺傳距離

研究表明,從NCBI數據庫中選取20條薔薇科李亞科已公布的S-RNase基因序列:歐洲李、杏、甜櫻桃、扁桃、梅(Prunusmume)、黑刺李(Prunusspinosa)、中國李(Prunussalicina)、野櫻桃(Prunusvirginiana)、野杏(Prunuswebbii)、櫻桃李(Prunuscerasifera)、桂櫻(Prunuslaurocerasus)、歐李(Prunushumilis),再與試驗獲得的7條不同的S-RNase基因序列共同利用MEGA6軟件的Neighbor-Joining法構建系統進化樹。該發育樹聚成3個大類,第一大類主要為試驗檢測出的5個歐洲李的S-RNase基因和其它李亞科樹種的S-RNase基因的聚類;第二大類將野櫻桃、黑刺李、中國李和歐洲李S1-RNase基因聚為一類;第三大類為甜櫻桃、扁桃、野杏、中國李和試驗歐洲李中檢測出的S11-RNase基因的聚類。獲得的7個S-RNase基因在3個分支上均有分布,其中歐洲李SSA、S6、S9、SSJ和S5的親緣關系較近。李亞科的杏、中國李、黑刺李等樹種的S-RNase基因均不能單獨聚為一類,而是彼此交錯分布在各個分支中。圖3

注:●表示研究中獲得的基因;SSA:女神;S6:總統;S9:理查德早生,斯泰勒;SSJ:總統,Decbrowice;S5:法蘭西,Silvia;S1:理查德早生,斯泰勒,法蘭西,Silvia,烏孜干1號,Decbrowice,塔城酸梅;S11:烏孜干1號,女神

3 討 論

關于S-RNase等位基因擴增時引物的選擇,目前大多數選用薔薇科通用引物直接進行PCR擴增[5-6],也有根據S等位基因的特異序列設計引物再結合薔薇科通用引物兩種方法進行PCR擴增[24],能擴增出理想條帶。試驗選用了2對薔薇科通用引物對9個供試歐洲李品種均擴增出了2個條帶,共檢測出13個大小不同的基因片段。也發現利用單對薔薇科通用引物進行PCR擴增,并不能檢測出所有供試歐洲李品種的S-RNase基因片段,姜新等[5]也發現過此類現象,并且選用了3對薔薇科通用引物成功鑒定出了供試新疆杏品種的S基因型。

鑒定9個供試歐洲李品種的S基因型發現,塔城酸梅品種的尚未鑒定出S基因型,僅鑒定出單條S1-RNase基因,而另1條S基因與NCBI中同物種相似度最高的S16基因相比,同源性僅為96%,該條S基因可能為新S基因。同時也發現法蘭西和Silvia品種的S基因型相同為S1S5,理查德和斯泰勒品種的S基因型也相同為S1S9,通過比較兩組疑似品種表型性狀發現,各組之間除果實大小和果皮色澤存在差異外,其它形態特征和部分生物學性狀相似度較高,很可能是它們的親緣關系很近或者屬于同物異名現象,后續需借助DNA分子標記可進行鑒定。此類現象在柚類資源[25]中也有過報道。梁梅[26]研究發現,S-RNase基因型相同的不同品種不能互作授粉樹,試驗鑒定出的女神與法蘭西、理查德早生、塔城酸梅、總統和Decbrowice品種基因型不同,可以互作授粉樹。王斐等[2]對法蘭西和女神授粉可以驗證S基因型鑒定的結果。法蘭西、理查德早生、烏孜干1號和塔城酸梅品種的S基因型中都共有1條S1-RNase基因,理論上它們之間不宜互作授粉樹。劉夢培[4]結合田間授粉對具有1條相同S-RNase基因的多個仁用杏品種進行了驗證。但也有例外,在個別品種如南雜和北雜兩個仁用杏中都共有1條S9-RNase基因,理論上應為雜交半親和,實際田間授粉表明二者雜交親和,但正反交的坐果率差異較大,杏品種間存在雜交不親和現象,并有單方不親和與相互不親和之分[27],是否在歐洲李中也有此現象,后續有待進一步研究。

植物S基因的遺傳特性對生殖方式是自交還是異交起著決定性作用[28]。研究發現,鑒定出的7條不同的S-RNase基因在供試歐洲李品種中分布頻率不均衡,其中S1-RNase等位基因出現的頻率最高,可能是該基因在品種間授粉時有較強的選擇優勢,也有可能是該基因與其它基因相互連鎖,可產生有利的經濟性狀,從而表現出有作為親本的選擇優勢[29-30]。總統和女神兩個栽培品種中的S6-RNase和SSA-RNase基因出現頻率最低,可能是因為供試歐洲李品種克隆出的S-RNase基因群體數量較少,后續需要克隆更多的S-RNase基因可進一步驗證。

在構建的系統進化樹中,歐洲李、中國李、杏等李亞科樹種的S-RNase基因并沒有單獨聚成1個亞類,而是彼此交錯、隨機分布在李亞科各樹種中,樹種之間親緣關系較近。薔薇科S-RNase基因的種間同源性往往大于種內同源性[6,31-32]。研究的系統進化分析結果也驗證了此觀點,從而說明李亞科植物S基因的分化早于各個種形成之前,而S基因種內的進化發生在各自單獨的系統中。

4 結 論

供試歐洲李品種的S基因型是由2種不同的S等位基因組成,檢測出了7個不同的S-RNase等位基因,確定了9個供試樣品中的8個歐洲李品種的S基因型,其中理查德早生和斯泰勒的S基因型相同為S1S9,法蘭西和Silvia的S基因型相同為S1S5,烏孜干1號、總統、Decbrowice 和女神的S基因型分別為S1S11、S6SSJ、S1SSJ和SSAS11,塔城酸梅僅確定具有1條S1-RNase基因,未能鑒定出其S基因型。S基因頻率分析顯示S1-RNase基因頻率最高,S6-RNase和SSA-RNase基因頻率最低。李亞科植物S基因的分化早于各個種形成之前,而S基因種內的進化發生在各自單獨的系統中。鑒定歐洲李品種自交不親和S-RNase基因型,可以豐富歐洲李品種S基因型信息。