新疆野生樺褐孔菌生物學特性及化學成分分析

華蘭蘭,林 青,時紅玲,王 娜,婁 愷,李金玉,霍向東

(1.新疆師范大學生命科學學院,烏魯木齊 830054;2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室,烏魯木齊 830091;3.新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是一種白腐真菌,屬于擔子菌綱銹革孔菌科,主要生長于樺樹的樹干上[1],可耐受 -40℃的低溫,主要分布于N 45～50°的寒冷地帶,包括北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯(西西伯利亞、東部、堪察加半島),以及中國東北部(黑龍江省的小興安嶺和吉林省的長白山)和日本(北海道)[2-3]。作為一種藥用真菌,樺褐孔菌含有多種生物活性成分,其提取物具有降血糖[2-4]、抗病毒[5]、抑菌[6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、保肝[11-12]等作用?！厩叭搜芯窟M展】當前,關于樺褐孔菌菌核、菌絲體和發酵液活性物質的成分報道雖多,如樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸等[3],但對樺褐孔菌總體化合物種類的研究甚少。真菌所含有的大量有機化合物,不僅有藥用價值,對真菌自身也起著重要的生態和生理作用[13]。液體發酵是一種快速、可行的替代方法,可以獲得質量一致的樺褐孔菌菌絲體[14]。【本研究切入點】樺褐孔菌資源稀少,藥用價值高,為加強該菌株的資源利用及相關產品的開發,需對樺褐孔菌的生物學特性及化學成分進行分析。【擬解決的關鍵問題】對新疆阿勒泰野生樺褐孔菌菌核進行培養物分離、純化及鑒定,使用Biolog FF微孔板對菌絲體進行碳源利用分析,經液體培養,獲得樺褐孔菌菌絲體和發酵液,采用氣相色譜-質譜(GC-MS)法確定樺褐孔菌菌核、發酵菌絲體和發酵液的化學成分組成。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材 料

樺褐孔菌菌核采自新疆阿勒泰小東溝林場(47°56′N, 88°07′E) ,實驗室分離獲得純菌株,菌株編號為HS819;植物凝膠和吐溫40均購自索萊寶(Solarbio)公司,其余試劑均為國藥分析純試劑。

1.1.2 儀器與設備

HVA-85高壓滅菌鍋(日本);SW-CJ-2FD凈化工作臺(上海博訊實業有限公司);ZWY-2102C恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司);Thermo Presco17臺式高速離心機(美國);DS-Ri2 Nikon顯微鏡(日本);GP306C-120-500電動組織研磨器(生工生物工程股份有限公司);Biostack Ready濁度儀 (美國);Microplate Reader讀數儀(美國);SONICS VC130超聲波破碎儀(美國);SHIMADZU SH-Rtx-Wax色譜柱(30 m*0.25 mm*0.25 μm),TQ8040NX三重四極桿型氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津)。

1.1.3 培養基

分離培養基(BA):樺樹皮粉末15 g/L,瓊脂20 g/L,水1 000 mL,121℃ 高壓滅菌20 min,使用前加入氨芐青霉素0.1 g;斜面培養基:PDA培養基;PDA加富培養基:馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖25.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、酵母粉3.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、瓊脂25.0 g/L;種子培養液:葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,MgSO40.5 g/L,KH2PO42 g/L,pH 自然;發酵培養液:葡萄糖20.0 g/L,蛋白胨4.0 g/L,MgSO41.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,pH 自然;FF-IF 接種液:植物凝膠0.25%,吐溫40 0.03%,121℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 分離純化

選取新鮮的樺褐孔菌菌核,去除表面雜質,75%酒精清洗其外表面3次。采用組織分離法進行分離。在無菌條件下,切取5 mm × 5 mm的菌核組織塊接入分離培養基, 置于28℃ 恒溫箱中培養培養5 d;挑取菌落邊緣,在PDA加富平板上進行純化培養10 d,并將分離、純化的菌株接種于PDA斜面,30℃遮光培養,待菌株長滿斜面后,放置4℃保存。

1.2.2 液體發酵

生長于PDA加富平板上的菌落用打孔器打取直徑1 cm的菌餅4塊轉置50 mL離心管中,研磨后,加入5 mL無菌水混勻,接入500 mL錐形瓶中(100 mL種子培養基),在30℃,150 r/min 條件下培養3.5 d后將種子液轉置250 mL錐形瓶(100 mL發酵培養基),接種量為10%,150 r/min,28℃培養10 d。

1.2.3 形態學

觀察菌株在固體平板上的生長特征,包括菌落形態、菌絲顏色、滲出物顏色。以30～45°斜插入無菌的蓋玻片,28℃避光培養,待菌絲體蔓上載玻片后,取出載玻片用尼康顯微鏡對菌絲體進行形態學拍照。

1.2.4 基于ITS序列的樺褐孔菌進化

上海生工生物工程股份有限公司利用真菌ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’)擴增并測序。ITS rDNA 序列提交至GenBank數據庫,登錄號為 OK586158;BLAST在線比對分析,利用MEGA 11.0軟件、以Neighbor-joining法(1000 bootstrap)構建系統進化樹,分析同源關系。

1.2.5 碳源譜

制備Biolog FF板接種液[15],采用95種碳源Biolog FF微孔板分析樺褐孔菌菌株碳源利用情況。從PDA平板生長菌落刮取菌絲體,轉置于含有500 μL FF-IF接種液的無菌EP管中,電動手持式研磨機破碎,收集的菌絲體10 000 r/min離心10 min,棄上清,再次加入FF-IF接種液,離心去上清,重復該步驟兩次,將最終獲取的菌絲體沉淀懸浮于裝有4 mL接種液離心管中,靜置去除菌絲團。用濁度儀將裝有10 mL FF-IF接種液的Biolog FF標準比濁管的濁度調至100%后,加入菌絲體懸浮液將其濁度范圍調至75%T左右,將此懸浮液倒入V型加樣槽,迅速接種至Biolog FF板(每孔100 μL),28℃培養。

碳源利用活性:菌株利用碳源的能力,可用平均吸光值(AWCD)表示,通過計算和繪制菌株的AWCD值隨時間的變化,得到菌株利用碳源的平均活性[16]。菌株代謝活性用590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值表示,其中數值小于0時按0處理,計算方法:AWCD=Σ(C-R)/n,C為每個碳源孔的兩波段吸光度差值,R為對照孔的吸光度值,n為培養基碳源種類數,研究中為95[17]。 碳源的平均吸光值(AWCD)能反映微生物代謝活性,是利用單一碳源的重要指標,能衡量菌株對于不同碳源的總體利用能力[18]。繪制AWCD隨時間變化的曲線,并通過方差分析不同時間點樣本間AWCD的差異。數據分析應用SPSS 24軟件,繪圖應用Origin 8.0軟件。

1.2.6 GC-MS

樣品前處理:取5 g樣品,加入50 mL石油醚(沸點30～60℃),振蕩混勻,超聲處理15 min,8000 rpm離心3 min,收集上清液,減壓濃縮至干,再加入1 mL石油醚溶解沉淀,經0.22 μm濾膜過濾后進行分析。

GC條件:分流進樣,分流比10∶1;進樣口溫度為250℃,程序升溫:初始溫度為30℃,保持1 min,以5℃/min升至220℃,保持3 min,再以10℃/min升至250℃,保持5 min。

MS條件:EI電離源;載氣為He;吹掃流量3 mL/min;電子能量70 eV;離子源溫度200℃,接口溫度250℃。全掃描模式,質量掃描范圍為 50～600 amu;溶劑延遲2 min。

2 結果與分析

2.1 菌株HS819的形態學特征

研究表明,菌株HS819菌核無柄,表面有不規則溝痕,內部黃色至黃褐色;經組織分離,在BA板上菌絲呈白色,匍匐在培養基上;菌落初期白色,后逐漸變為淺黃至黃褐色,而邊緣保持白色;菌絲在加富PDA平板上生長較緩慢,28℃培養15 d直徑8.3 cm左右;背面有環橫紋出現;在微分干涉學顯微鏡下(×400),菌絲粗壯,無可見孢子。圖1

注:A:菌核;B:BA生長菌落;C:PDA加富平板生長菌落(正面);D:PDA加富平板生長菌落(背面);E:菌絲體(標尺=20 μm)

2.2 系統發育分析

研究表明,菌株HS819的測序 ITS rDNA長度為778 bp,在 NCBI 上BLAST的比對結果顯示與GenBank 中OP019327、OP019325、KC312697、MZ484606等樺褐孔菌菌株的序列相似度達99% 以上,且系統發育樹也表明該菌株與以上四株菌聚為一類。確認菌株HS819為樺褐孔菌。圖2

圖2 基于ITS序列的系統發育

2.3 樺褐孔菌菌株HS819碳源譜特征

2.3.1 樺褐孔菌菌株HS819代謝碳源平均活性

研究表明,前7 d樺褐孔菌對碳源利用率低,隨著培養時間延長,呈逐漸增加趨勢,在第15 d利用率達到最高。圖3

圖3 樺褐孔菌菌株HS819利用 碳源平均吸光值變化

2.3.2 樺褐孔菌菌株HS819對碳源種類利用

研究表明,菌株HS819能代謝95種測試碳源中的33種,其中7種碳源能夠被有效利用,17種碳源適度利用;其余碳源完全不能代謝,包括環式糊精(B1孔)、α-D-葡萄糖-1-磷酸(C1孔)和D-甘露醇(D1孔),赤蘚糖醇(B4)等,孔內均無菌絲生長。表1

表1 樺褐孔菌菌株HS819在Biolog FF微孔板中的碳底物利用

2.4 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819發酵液及菌絲體化學成分(表2)

2.4.1 野生樺褐孔菌菌核中化學成分及分析

研究表明,樺褐孔菌菌核43種化學成分中含有酸類8種,烴類21種、酯類2種、醛類2種、醇類5種、其它5種。酸類化合物占整體化合物的比例最大,達到66.07%;其次是烴類占21.69%;醇類,醛類,酯類,分別占3.82%,2.03%,1.53%。酸類化合物主要有亞油酸(24.39%)、反油酸(21.15%)、棕櫚酸(7.4%)等;角鯊烯(4.53%)是烴類的主要化合物;醇類化合物主要有二十七烷醇(1.55%)、葉綠醇(1.32%);醛類化合物僅有順-7-十四烯醛和硬酯烷醛;脂類化合物主要為乙酸二十八脂(1.06%)和鄰苯二甲酸異丁基環己基甲酯(0.47%)。其它化合物中二十烷基壬基醚(2.7%)、2,4-二叔丁基-苯酚(0.85%)等含量相對較高。

2.4.2 樺褐孔菌菌株HS819菌絲體中化學成分及分析

研究表明,發酵菌絲體39種化合物中含有酯類6類,烴類18種,酸類6種,醇類2種。酸類化合物占整體化合物的比例最大,達到60.03%,其次是酯類占30.72%,烴類、醇類分別占4.59%、1.04%。酸類中含量較高的是油酸(28.76%)、棕櫚酸(18.51%)、反油酸(7.4%)等;脂類主要有 (Z)-十八碳-9-烯內酯(27.12%)、油酸乙酯(1.13%)、乙酸二十八烷基酯(1.06%)等;烴類主要有1-十九烯(0.42%)、α-衣蘭油烯(0.2%)、正二十四烷(0.41%)、1,2-環氧十六烷(0.77%)等;醇類有二十七烷醇(0.72%)、1-二十三烷醇(0.32%);其它化合物中依蘭酚(1.55%)的含量最高。

2.4.3 樺褐孔菌菌株HS819發酵液中化學成分及分析

研究表明,菌株HS819發酵液中38中化合物中含有烴類20種、醇類5種,酸類3種、酯類4種。烴類化合物占整體化合物的比例最大,達到54.01%;其次是醇類占8.24%,酯類與酸類分別占12.89%,7.72%。烴類中含量較高的是11-甲基二十烷(7.11%)、三十五烷(7.44%)、正三十六烷(6.58%)、正二十四烷(4.89%)等;醇類主要有二十七烷醇(3.05%)、葉綠醇(1.87%)、鯨蠟醇(0.78%)等;酯類有四十三烷基七氟丁酸酯(2.36%)、十八碳酸乙烯基酯(5.04%)、4-甲氧基乙酸十三烷基酯(4.43%);酸類主要有肉豆寇酸(3.06%)、棕櫚酸(3.3%)、油酸(1.36%)等;其他化合物中依蘭酚(8.39%)、2,4-二叔丁基-苯酚(2.16%)、十二烷基七聚乙二醇醚(2.57%)、肉豆蔻酰胺(2.1%)含量相對較高。

3 討 論

樺褐孔菌菌株HS819的碳代謝指紋圖譜表明,95種碳源中只有少量種類能被代謝,且這些碳源基本參與了生命體的三個重要的碳代謝途徑。琥珀酸、琥珀酸甲基酯、α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸參與三羧酸循環(TCA);戊糖磷酸途徑(PPP)相關的一些碳源樺褐孔菌也可以使用,包括D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和D-木糖;其余的碳源(D-葡萄糖醛酸、α-D-乳糖、麥芽糖醇、肝糖、D-果糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、α-D-葡萄糖等)主要參與糖酵解途徑。

碳源是微生物營養的基本組分,特定菌株同化某些碳源的能力可能與其在特定營養條件下的競爭力有關[17],例如與許多植物相關的真菌能分解并利用主要由纖維素和半纖維素組成的底物[19]。大型真菌的底物使用和代謝可表明其潛在的生態功能,了解菌株在自然界不同生態位條件下的營養適應性有助于選擇培養基成分,以優化次級代謝產物的生產,例如為提高金針菇菌株的漆酶活性,利用 Biolog FF微孔板來優化培養條件[20]。樺褐孔菌可利用碳源中的α-D-葡萄糖、D-纖維二糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸是纖維素或半纖維素的主要成分[21],這與樺褐孔菌主要生長于樺樹上相一致。

研究發現,野生樺褐孔菌菌核、菌絲體及其發酵液在化學成分種類和含量上的差異明顯,這可能是樺褐孔菌基因在自然環境下和液態發酵過程中差異性表達的結果[22]。例如1-碘-二十烷、1-碘癸烷及1,14-二溴十四烷僅存在于菌核中,其角鯊烯的含量是發酵液的1.1倍,而發酵液中的烴類相對含量遠多于菌核和菌絲體,α-衣蘭油烯則只在菌絲體中檢測到;菌絲體中的酯質含量分別是菌核的20倍,發酵液的2.4倍,油酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸三十烷酯、鄰苯二甲酸二丁酯、(Z)-十八碳-9-烯內酯僅存在于菌絲體中,而十八碳酸乙烯基酯、四十三烷基七氟丁酸酯,4-甲氧基乙酸十三烷基酯則只存在于發酵液中;菌核中有機酸的種類多于菌絲體及發酵液,亞油酸和亞麻酸是菌核特有成分,油酸在菌絲體中的含量高達28.76%;順-7-十四烯醛和硬脂烷醛則只在菌核中存在。

表2 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819 菌絲體、發酵液中化學成分的定性 和定量變化

續表2 野生樺褐孔菌菌核、菌株HS819 菌絲體、發酵液中化學成分的定性 和定量變化

擔子菌胞外酶酶解木質素所釋放的低聚物是真菌和細菌生長的合適底物,為獲取更多營養物質,真菌會抑制周圍細菌的生長[23],該現象也可能在樺褐孔菌中存在。例如:菌核中所特有的有機鹵素(1-碘二十烷、1,14-二溴十四烷及1-碘癸烷),有可能在木質素的降解中起到中介作用[24],也可能抑制相互競爭的真菌和細菌[23];菌核中所特有的醛類物質及其酸含量多于菌絲體,而這2類物質均有一定的抑菌活性[25],有研究表明高含量的油酸、亞油酸、棕櫚酸還能夠有效抑制腐生線蟲[26]。在未來可嘗試挖掘這些化合物的生態功能,為樺褐孔菌的生長和保護提供策略的同時也可開發新的化學植物保護劑[27]。

真菌在自然環境和液態發酵過程中基因的差異性表達可能與生物脅迫、生長環境等因素有關[28],如溫度會影響真菌的脂肪酸組成[29-30]。本研究結果顯示,野生菌核中不飽和脂肪的含量為49.6%,其中多不飽和脂肪酸的含量(亞麻酸、亞油酸)及單不飽和脂肪酸(油酸、棕櫚油酸)的含量分別占總不飽和脂肪酸含量的52.7%,47.29%;菌絲體及其發酵液中不飽和脂肪酸均為單不飽和脂肪酸,含量分別為36.64%,1.36%。樺褐孔菌菌核生長在低溫環境,菌絲發酵培養溫度為28℃,這與隨著培養溫度的降低,脂肪酸的不飽和度增加的觀點相一致[31-32],這些不飽和脂肪酸也可能通過脂質過氧化反應在降解木質素的過程中發揮作用[33]。此外,本研究菌核中反油酸的相對含量高達21.15%,是菌絲體的2.9倍,反式脂肪酸的增多與自然環境中菌株的營養缺乏有關[34]。在搖瓶培養過程中,菌絲體主要以菌塊、菌球形態存在,易于傳氧、傳質,菌絲體為營養生長階段,酶系活躍。菌核直接長于大氣中,靠菌托傳遞營養,為生殖生長階段,酶系相對單一[28]。

4 結 論

新疆樺褐孔菌菌株HS819對D-核糖、水楊苷、D-纖維二糖等7種碳源的代謝能力最強;酸類是野生菌核及菌絲體的主要成分,分別占總成分的66.07% 和60.03%,在發酵液中,烴類為主要成分,占54.01%。