小麥-十倍體長(zhǎng)穗偃麥草雙重異代換系的分子細(xì)胞遺傳學(xué)及抗條銹病鑒定

劉文豪,尚立輝,王斯文,楊曉瑩,程小方,趙繼新,鄧平川,陳春環(huán),吉萬(wàn)全,王長(zhǎng)有

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥葉部病害,是中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)發(fā)生最嚴(yán)重的小麥真菌病害之一,可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)甚至絕收[1]。培育抗病品種是防治小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的措施,但由于條銹菌致病小種的頻繁變異,導(dǎo)致抗條銹病品種的抗病性會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)喪失[2]。因此,挖掘和培育新的抗條銹病材料對(duì)于小麥抗病育種至關(guān)重要。

十倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumponticum(Popd.) Barkworth and Dewey)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)偃麥草屬(Elytrigia)的一種多年生小麥近緣種野生植物,起源于歐洲東南部、小亞細(xì)亞和俄羅斯南部[3]。研究表明,十倍體長(zhǎng)穗偃麥草具有許多優(yōu)良農(nóng)藝性狀,且高抗小麥條銹病[4]、葉銹病[5]、稈銹病[6]、白粉病[7]、赤霉病[8]等多種病害,是小麥遺傳改良的重要三級(jí)基因源[9]。目前已有大量攜帶長(zhǎng)穗偃麥草優(yōu)良性狀遺傳物質(zhì)的栽培小麥材料被創(chuàng)制出來(lái),并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[10-11]。

本課題組從普通小麥7182和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的雜交后代中篩選出一個(gè)高抗條銹病的衍生系CH18067,本研究利用細(xì)胞遺傳學(xué)、原位雜交、分子標(biāo)記、芯片檢測(cè)等技術(shù),結(jié)合形態(tài)學(xué)和條銹病抗性調(diào)查,對(duì)CH18067進(jìn)行綜合鑒定,以期為小麥條銹病抗性育種提供候選種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括十倍體長(zhǎng)穗偃麥草(2n=10x=70, EeEbExStSt或JJJJSJS),百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum, 2n=2x=14, EbEb或JJ),擬鵝觀草(Pseudoroegneriaspicata, 2n=2x=14, StSt),普通小麥7182、輝縣紅和中國(guó)春(2n=6x=42, AABBDD),以及普通小麥7182和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的F8代衍生系CH18067,以上材料均保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遠(yuǎn)緣雜交與染色體工程實(shí)驗(yàn)室;供試條銹菌CYR32和CYR33混合生理小種由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

分別于3月下旬和4月中旬在田間取CH18067的根尖和幼穗,參照Yang等[12]的方法,根尖采用卡諾氏固定液Ⅰ(V無(wú)水乙醇∶V醋酸=3∶1)在室溫下固定48 h,幼穗采用卡諾氏固定液Ⅱ(V無(wú)水乙醇∶V氯仿∶V醋酸=6∶3∶1)在室溫下固定48～72 h,二者均使用1.0%的醋酸洋紅進(jìn)行染色。根尖和幼穗的鏡檢均在Olympus BX-43相差顯微鏡下進(jìn)行,對(duì)CH18067體細(xì)胞有絲分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的構(gòu)型以及減數(shù)分裂后期Ⅰ同源染色體的分離情況進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 原位雜交鑒定

染色體制片:將種子浸泡至露白后置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,于23 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件下萌發(fā)2～3 d,待幼根長(zhǎng)至1.8～3.0 cm時(shí)切下,用笑氣(N2O)處理2 h,用90%醋酸(v/v)固定根尖10 min以上,然后置于70%酒精(v/v)中,-20 ℃保存。參照Yang等[13]的方法,將經(jīng)過(guò)處理的幼根取出后切下根尖分生區(qū),用1%的果膠酶(v/v)和2%的纖維素酶(v/v)于37 ℃處理 50～60 min(根據(jù)材料適度調(diào)整處理時(shí)間),根尖體細(xì)胞的染色體制片采用滴片法。

原位雜交:參照Han等[14]的方法,用寡聚核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對(duì)CH18067及其后代CA495-2的根尖體細(xì)胞染色體進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)分析。基因組原位雜交(genomicinsituhybridization, GISH)參照Wang等[15]和Fu等[16]的方法,使用CTAB法提取試驗(yàn)材料幼嫩葉片的全基因組DNA,以Fluorescein-12-dUPT標(biāo)記的十倍體長(zhǎng)穗偃麥草全基因組DNA為探針,以中國(guó)春全基因組DNA為封阻(封阻比例為1∶300),對(duì)CH18067和CA495-2進(jìn)行分析;以Fluorescein-12-dUPT(綠色)標(biāo)記的百薩偃麥草全基因組(J)DNA和Texas red-5-dUPT(紅色)標(biāo)記的擬鵝觀草全基因組(St)DNA為探針,以中國(guó)春全基因組DNA為封阻,對(duì)CH18067進(jìn)行多色基因組原位雜交(multicolor genomicinsituhybridization, mc-GISH)分析。使用Olympus BX-53熒光顯微鏡對(duì)原位雜交的結(jié)果進(jìn)行鏡檢,并用Adobe Photoshop CS6處理圖像。

1.2.3 分子標(biāo)記鑒定和液相芯片分析

利用分布于小麥第一至第七部分同源群上的EST、PLUG分子標(biāo)記和小麥-二倍體長(zhǎng)穗偃麥草液相芯片(GenoBaits○RWheatplusEE)對(duì)CH18067中的外源染色體同源群歸屬進(jìn)行分析。EST引物信息來(lái)自網(wǎng)站https://graingenes.org/cgi-bin/GG3/browse.cgi,PLUG引物來(lái)自Ishikawa等[17]發(fā)表的引物。引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR和電泳分析按照Z(yǔ)hu等[18]的方法進(jìn)行。芯片檢測(cè)由石家莊博瑞迪生物技術(shù)公司進(jìn)行,主要過(guò)程為DNA文庫(kù)制備、探針雜交、Illumina HiSeq X測(cè)序、BWA軟件比對(duì)和R軟件包制圖。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查和條銹病抗性鑒定

植株收獲后,對(duì)CH18067及其親本7182的株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)和千粒重進(jìn)行調(diào)查和記錄。

條銹病的接種鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行,鑒定材料于2021年10月上旬播種,每個(gè)材料播種2行,行長(zhǎng)1 m,每行播種10粒。于2022年3月中旬,以感病對(duì)照輝縣紅作誘發(fā)行,采用撒粉接種法將CYR32和CYR33的混合生理小種均勻地撒在噴濕的小麥植株上,待輝縣紅充分發(fā)病后,調(diào)查田間植株發(fā)病情況,3～5 d后復(fù)查1次。反應(yīng)型(IT)按照0～4級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載[19]:0級(jí)為免疫;0;級(jí)為近免疫;1 級(jí)為高抗;2級(jí)為中抗;3級(jí)為中感;4級(jí)為高感。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

根尖分生區(qū)體細(xì)胞染色體數(shù)目觀察結(jié)果(圖1a)顯示,CH18067的體細(xì)胞在有絲分裂中期含有42條染色體。花粉母細(xì)胞鏡檢結(jié)果(圖1b,圖1b)顯示,在減數(shù)分裂中期Ⅰ,CH18067的染色體構(gòu)型為2n=42=21Ⅱ,未觀察到單價(jià)體和多價(jià)體,染色體配對(duì)良好;在減數(shù)分裂后期Ⅰ,同源染色體可以均等分離,未觀察到落后染色體和染色體橋。這些結(jié)果表明,CH18067是一個(gè)細(xì)胞學(xué)遺傳穩(wěn)定的材料。

a:有絲分裂中期;b:減數(shù)分裂中期Ⅰ;c:減數(shù)分裂后期Ⅰ。a: Mitotic metaphase; b: Meiotic metaphase Ⅰ; c: Meiotic anaphase Ⅰ.圖1 CH18067的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Cytological observation of CH18067

2.2 原位雜交鑒定結(jié)果

根據(jù)Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麥中國(guó)春和7182的染色體FISH核型,以及Tang等[20]、Jiang等[22]和Wang[23]等公布的1R、1RS/1BL染色體的FISH核型,用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對(duì)CH18067進(jìn)行FISH分析,結(jié)果可鑒定出CH18067中普通小麥A基因組的7對(duì)染色體、B基因組的7對(duì)染色體(含一對(duì)1RS/1BL易位染色體)以及D基因組中的1D、3D、5D、6D和7D染色體,而D基因組中的2D和4D染色體無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別(圖2a)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CH18067中有兩對(duì)染色體顯示出特殊的FISH帶型,其中一對(duì)染色體在長(zhǎng)臂和短臂末端顯示Oligo-pTa535探針紅色帶型,另一對(duì)染色體在著絲粒位置和長(zhǎng)臂末端顯示Oligo-pTa535探針紅色帶型(圖2b)。隨后以十倍體長(zhǎng)穗偃麥草全基因組DNA為探針,以中國(guó)春全基因組DNA為封阻對(duì)CH18067進(jìn)行連續(xù)FISH-GISH,結(jié)果(圖2c)顯示,兩對(duì)特殊FISH帶型的染色體均能顯示出十倍體長(zhǎng)穗偃麥草基因組探針雜交信號(hào),說(shuō)明這兩對(duì)具有特殊FISH帶型的染色體來(lái)自于十倍體長(zhǎng)穗偃麥草。

a:用Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)探針對(duì)CH18067進(jìn)行FISH;b:CH18067的FISH核型圖;c:以十倍體長(zhǎng)穗偃麥草全基因組DNA(綠色)為探針對(duì)CH18067進(jìn)行FISH-GISH;d:以百薩偃麥草全基因組DNA(綠色)和擬鵝觀草全基因組DNA(紅色)為探針對(duì)CH18067進(jìn)行mc-GISH。白色箭頭指示外源染色體,紅色箭頭指示1RS/1BL染色體。a: FISH of CH18067 with Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) probes; b: FISH karyotype of CH18067; c: FISH-GISH of CH18067 with whole genome DNA(green) of Th.ponticum as probe; d: mc-GISH of CH18067 with genomic DNA of Th.bessarabicum(green) and Ps.strigosa (red) as probes. White arrows refer to the alien chromosome, and red arrows refer to the 1RS/1BL chromosome.圖2 CH18067的原位雜交鑒定結(jié)果Fig.2 In situ hybridization identification of CH18067

進(jìn)一步以Fluorescein-12-dUPT(綠色)標(biāo)記的百薩偃麥草全基因組(J)DNA和Texas red-5-dUPT標(biāo)記(紅色)的擬鵝觀草全基因組(St)DNA為探針,以中國(guó)春全基因組DNA為封阻,對(duì)CH18067進(jìn)行mc-GISH。結(jié)果(圖2d)顯示,CH18067中有一對(duì)染色體全部呈現(xiàn)出明亮的綠色雜交信號(hào),該信號(hào)符合J基因組染色體特征;另一對(duì)染色體在短臂和長(zhǎng)臂末端上顯示出綠色雜交信號(hào),且在著絲粒位置顯示出較強(qiáng)的紅色雜交信號(hào),符合JS基因組染色體的特征,表明CH18067中含有一對(duì)J基因組染色體和一對(duì)JS基因組染色體。結(jié)合FISH結(jié)果(圖2a),推斷CH18067中的2D染色體和4D染色體分別被十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的一對(duì)J染色體和一對(duì)JS染色體所代換。

2.3 芯片分析結(jié)果

二倍體長(zhǎng)穗偃麥草E(Ee)基因組與百薩偃麥草J(Eb)基因組的同源性較高[23],二者普遍被認(rèn)為是十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的供體基因組[12],因此采用小麥-二倍體長(zhǎng)穗偃麥草GenoBaits○RWheatplusEE液相芯片對(duì)CH18067進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖3)顯示,CH18067中普通小麥的2D和4D染色體上的檢測(cè)信號(hào)很弱,而在二倍體長(zhǎng)穗偃麥草的2E和4E染色體上信號(hào)顯著富集,且4E染色體上長(zhǎng)臂和短臂端部的信號(hào)比較密集,著絲粒位置附近信號(hào)較弱。在CH18067的mc-GISH鑒定中,有一對(duì)染色體整體呈現(xiàn)綠色雜交信號(hào),芯片檢測(cè)結(jié)果則顯示2E染色體上信號(hào)分布均勻,因此推斷其為2J染色體;另外一對(duì)染色體在短臂和長(zhǎng)臂末端顯示出綠色信號(hào),以及在著絲粒位置附近顯示出紅色信號(hào),而芯片檢測(cè)結(jié)果則發(fā)現(xiàn)4E染色體的短臂和長(zhǎng)臂末端顯示出密集信號(hào),以及著絲粒位置附近顯示出微弱信號(hào),由此推斷其為4JS染色體。根據(jù)Tang等[20]和Du等[21]公布的普通小麥中國(guó)春和7182的染色體核型,參考李懋學(xué)等[24]的方法對(duì)染色體的核型進(jìn)行進(jìn)一步FISH鑒定,發(fā)現(xiàn)CH18067中在長(zhǎng)臂和短臂末端顯示Oligo-pTa535紅色帶型的是2J染色體,在著絲粒位置和長(zhǎng)臂末端顯示Oligo-pTa535紅色帶型的是4JS染色體(圖2b)。此外,在芯片檢測(cè)結(jié)果中,還發(fā)現(xiàn)CH18067中普通小麥的1B染色體短臂上信號(hào)缺失,這與FISH鑒定觀察到其含有1RS/1BL易位染色體的情況相吻合。因此,CH18067中普通小麥的2D和4D染色體分別被十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的2J和4JS染色體所代換,其為小麥-十倍體長(zhǎng)穗偃麥草2J(2D)+4JS(4D)雙重異代換系。

2.4 分子標(biāo)記分析結(jié)果

利用57對(duì)EST引物和21對(duì)PLUG引物對(duì)CH18067及其親本7182、十倍體長(zhǎng)穗偃麥草進(jìn)行分子標(biāo)記分析,最終篩選出5個(gè)PLUG標(biāo)記和1個(gè)EST標(biāo)記(表1),且在CH18067和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草中均擴(kuò)增出特異性條帶(圖4)。其中,3個(gè)PLUG標(biāo)記位于小麥第二部分同源群染色體上,2個(gè)PLUG和1個(gè)EST標(biāo)記位于小麥第四部分同源群染色體上,驗(yàn)證了GenoBaits○RWheatplusEE芯片的分析結(jié)果。

表1 CH18067攜帶的十倍體長(zhǎng)穗偃麥草2J和4JS染色體連鎖的EST和PLUG多態(tài)性標(biāo)記Table 1 EST and PLUG polymorphic markers linked to 2J and 4JS chromosomes from Th. ponticum carried by CH18067

M:DL2000;1:7182;2:CH18067;3:十倍體長(zhǎng)穗偃麥草;a:TNAC1210-HaeⅢ;b:TNAC1140-Taq Ⅰ;c:TNAC1182-Hae Ⅲ;d:TANC1663-HAE Ⅲ;e:TANC1421-HAE Ⅲ;f:BG606980。箭頭所指為特異性條帶。M: DL2000; 1: 7182; 2: CH18067; 3: Th. ponticum; a: TNAC1210-Hae Ⅲ; b: TNAC1140-Taq Ⅰ; c: TNAC1182-Hae Ⅲ; d: TANC1663-HAE Ⅲ; e: TANC1421-HAE Ⅲ; f: BG606980. Arrows indicate specific bands.圖4 CH18067的多態(tài)性標(biāo)記分析結(jié)果Fig.4 Polymorphic marker analysis of CH18067

2.5 CH18067的農(nóng)藝性狀和條銹病抗性評(píng)價(jià)

CH18067及其親本7182的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果(圖5,表2)顯示,CH18067的株高、分蘗數(shù)和千粒重均顯著低于親本7182,而粒長(zhǎng)則顯著大于7182,在穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小穗粒數(shù)方面二者無(wú)顯著差異。成株期條銹病抗性鑒定結(jié)果(圖6)顯示,感病對(duì)照品種輝縣紅表現(xiàn)為高感(IT=4),親本7182表現(xiàn)為中感(IT=3),十倍體長(zhǎng)穗偃麥草表現(xiàn)為免疫(IT=0),CH18067表現(xiàn)為高抗(IT=1)。根據(jù)抗病性鑒定結(jié)果以及系譜分析,推測(cè)CH18067成株期的條銹病抗性來(lái)源于其所攜帶的十倍體長(zhǎng)穗偃麥草染色體。

表2 CH18067與7182的農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between CH18067 and its parent 7182

a:植株;b:穗子;c:小穗和籽粒;1:7182;2:CH18067。a: Plant; b: Spike; c: Spikelet and grain; 1: 7182; 2: CH18067.圖5 CH18067及其親本7182的農(nóng)藝性狀表型Fig.5 Agronomic traits phenotype of CH18067 and its parent 7182

1:7182;2:CH18067;3:輝縣紅;4:十倍體長(zhǎng)穗偃麥草。1: 7182; 2: CH18067; 3: Huixianhong; 4:Thinopyrum ponticum.圖6 CH18067及其親本的成株期條銹病抗性表現(xiàn)Fig.6 Stripe rust resistance at adult stage of CH18067 and its parents

3 討論

目前,關(guān)于十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的基因組組成尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。Zhang等[25]認(rèn)為E(Ee和Eb)基因組和St基因組是十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的兩個(gè)基本基因組,十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的基因組組成為StStEeEbEx;Chen等[26]認(rèn)為十倍體長(zhǎng)穗偃麥草中不含有完整的St基因組,十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的基因組組成為JJJJSJS,JS基因組是在著絲粒附近區(qū)域含有St染色體組DNA序列的J組染色體。Liu等[27]研究表明,十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的St基因組和E(Ee和Eb)基因組與普通小麥的D基因組關(guān)系密切,并認(rèn)為這是小麥-偃麥草D基因組頻繁發(fā)生代換和易位事件的原因。本研究中CH18067也是D基因組染色體與十倍體長(zhǎng)穗偃麥草基因組染色體之間發(fā)生了雙重代換。

本研究通過(guò)GISH技術(shù),精確鑒定出CH18067含有來(lái)自十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的染色體,用FISH-GISH技術(shù)在同一染色體制片上將外源染色體的FISH信號(hào)與GISH信號(hào)相對(duì)應(yīng),并結(jié)合液相芯片和分子標(biāo)記的分析結(jié)果,明確了十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的2J和4JS染色體與Oligo-pTa535探針?biāo)纬傻碾s交信號(hào),為今后揭示十倍體長(zhǎng)穗偃麥草染色體FISH核型奠定了基礎(chǔ)。此外,本研究篩選獲得了5個(gè)PLUG標(biāo)記和1個(gè)EST標(biāo)記,在CH18067和十倍體長(zhǎng)穗偃麥草中均擴(kuò)增出特異性條帶,其中3個(gè)PLUG標(biāo)記歸屬于小麥第二部分同源群,1個(gè)EST和2個(gè)PLUG標(biāo)記歸屬于小麥第四部分同源群,這些標(biāo)記可用于小麥遺傳背景下十倍體長(zhǎng)穗偃麥草2J與4JS染色體的檢測(cè)與追蹤。

條銹病嚴(yán)重威脅小麥安全生產(chǎn)。本研究中CH18067在成株期對(duì)條銹菌CYR32和CYR33的混合小種表現(xiàn)為高抗。CH18067含有1RS/1BL易位染色體,可能是其在育種過(guò)程中發(fā)生了異交授粉所致,1RS染色體雖攜帶抗條銹病基因,但其抗病性早已喪失。結(jié)合CH18067親本的抗病性鑒定,推測(cè)CH18067在成株期對(duì)條銹病的抗性來(lái)源于其攜帶的十倍體長(zhǎng)穗偃麥草染色體,但由于其同時(shí)攜帶了十倍體長(zhǎng)穗偃麥草的2J和4JS染色體,因此暫時(shí)無(wú)法確定其條銹病抗性的具體染色體。

小麥異代換系在小麥親緣種的基因定位、外源染色體在小麥背景下的遺傳分析、小麥及其親緣種間的進(jìn)化研究等方面均具有十分重要的作用,也可作為橋梁材料進(jìn)一步向小麥轉(zhuǎn)移外源有益基因,在小麥育種中具有巨大的應(yīng)用潛力。國(guó)內(nèi)外小麥遺傳育種學(xué)家已創(chuàng)制出大量的普通小麥及其近緣種的異代換系,將抗小麥銹病、白粉病、赤霉病的基因轉(zhuǎn)移到了普通小麥中,但由于外源染色體通常補(bǔ)償能力較差或攜帶不良基因,通常導(dǎo)致異代換系在小麥生產(chǎn)中不能直接應(yīng)用。因此,CH18067可以作為中間材料,進(jìn)一步利用電離輻射、殺配子效應(yīng)等手段,創(chuàng)制出含有抗條銹病基因的漸滲系或小片段易位系新種質(zhì),以用于抗條銹病小麥育種工作。