小麥-濱麥衍生系18DM134的分子細胞遺傳學及赤霉病抗性鑒定

尚立輝,劉文豪,王斯文,楊曉瑩,程小方,鄧平川,陳春環,趙繼新,王長有,吉萬全

(1.西北農林科技大學農學院,陜西楊凌 712100; 2.農業部作物基因資源與種質創制陜西科學觀測實驗站,陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的真菌性病害,是世界范圍內小麥生產的主要病害之一[1]。小麥赤霉病嚴重影響小麥產量,一般可導致小麥減產10%～30%,嚴重時甚至顆粒無收[2]。使用化學藥劑對赤霉病進行防治,對環境造成污染的同時,也會導致生產成本增加。選育抗病品種是防治赤霉病最經濟、有效的方法。目前世界范圍內的抗赤霉病種質資源較為匱乏,生產中使用的抗源主要局限于蘇麥3號、望水白、Frontana等少數幾個品種及其衍生系,嚴重阻礙了抗病品種的選育[3]。

挖掘新的抗赤霉病種質資源,是培育抗病品種的基礎。小麥野生近緣種含有豐富的抗病基因,利用染色體工程等技術可將外源種屬的有益基因導入到普通小麥中,創制新的抗病種質材料。濱麥(Leymusmollis(Trin.) Pilger, 2n=4x=28, NsNsXmXm)是賴草屬的一個多年生四倍體物種,具有抗寒、抗旱、耐鹽堿等優良特性,同時對小麥的多種真菌病害均具有良好的抗性,是普通小麥遺傳改良的重要基因資源[4-5]。國內關于普通小麥和濱麥的雜交研究開始于20世紀80年代,1985年陳漱陽等[6]通過對雜種F1進行幼胚培養和秋水仙素加倍,首次獲得了小麥-濱麥新種質八倍體小濱麥(Tritileymus);隨后傅 杰等[7-8]和王獻平等[9]對八倍體小濱麥的形成和染色體構型進行了詳細分析。目前育種學家通過染色體工程等方法獲得了一系列對條銹病具有良好抗性的小麥-濱麥衍生系材料[10-12],但有關抗赤霉病的小麥-濱麥衍生系報道較少。

本課題組前期從八倍體小濱麥M842和硬粒小麥D4286(Triticumturgidum)的雜交后代中篩選出一個抗赤霉病的衍生系18DM134,本研究運用細胞學、原位雜交、液相芯片、分子標記等技術對其染色體組成進行鑒定,并對其農藝性狀和赤霉病抗性進行調查,以期為小麥品種改良和赤霉病抗性育種提供候選種質。

1 材料與方法

1.1 材料

普通小麥7182和蘇麥3號(Triticumaestivum, 2n=6x=42,AABBDD),硬粒小麥 D4286(2n=4x=28, AABB),八倍體小濱麥M842(2n=8x=56, AABBDDNsNs)和小麥-濱麥衍生系18DM134均于2020-2022年種植于西北農林科技大學試驗田。M842是由普通小麥7182與濱麥雜交,經幼胚拯救和染色體加倍,又與7182回交、自交選育的不完全雙二倍體材料[6];18DM134是從八倍體小濱麥M842與D4286的雜交F6代中篩選獲得 。華山新麥草(PsathyrostachyshuashanicaKeng, 2n=2x=14, NsNs)全基因組DNA、濱麥全基因組DNA和大賴草(Leymusracemosus, 2n=4x=28, NsNsXmXm)全基因組DNA分別用于基因組原位雜交探針制備和分子標記分析。以上所有材料均保存于西北農林科技大學農學院小麥遠緣雜交與染色體工程實驗室。赤霉病菌生理小種PH-1由西北農林科技大學植物保護學院提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞學鑒定

于3月下旬和4月中旬,在田間取供試材料的根尖和幼穗,對根尖體細胞有絲分裂中期Ⅰ的染色體數目和花粉母細胞減數分裂中期Ⅰ和減數分裂后期Ⅰ的染色體構型進行觀察。根尖和幼穗的取樣、固定和鏡檢參照Wang等[13]的方法。使用Olympus BX-43(Japan)相差顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 原位雜交鑒定

根尖處理和染色體制片:將供試材料種子置于培養皿中浸泡至露白,在23 ℃恒溫培養箱中黑暗培養2～3 d,待根長為2～4 cm時取根尖分生區組織,根尖的處理與固定參照Pang等[14]的方法進行,染色體制片參照Han等[15]的方法。

原位雜交分析:參照李榮華等[16]的方法提取供試材料的全基因組DNA,稍作調整?；蚪M原位雜交(genomicinsituhybridization, GISH)參照Wang等[17]的方法,用Fluorescein-12-dUTP (綠)分別標記濱麥和華山新麥草全基因組DNA作為探針;熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)參照Yang等[18]的方法,用寡核苷酸Oligo-pSc119.2(綠)和Oligo-pTa535(紅)作為探針。參照楊曉菲等[19]報道的普通小麥7182 FISH帶型對供試材料的核型進行分析。用Olympus BX-53(Japan)熒光顯微鏡觀察并拍照,用cellSens(Olympus,Japan)和Photoshop 2021(Adobe, USA)分析處理圖像。

1.2.3 小麥-華山新麥草液相芯片分析

用本課題組聯合博瑞迪生物技術有限公司開發的小麥-華山新麥草液相芯片(GenoBaits○RWheatplusPh)對18DM134的染色體組成進行分析。由博瑞迪生物技術有限公司使用18DM134的全基因組DNA進行DNA文庫制備及探針雜交,用Illumina HiSeq X進行測序,并對測序數據質量進行檢測;用BWA軟件將測序數據與參考基因組進行比對,用bamdst (v.1.0.6)計算每個探針的測序深度,用R package進行繪圖。

1.2.4 分子標記分析

使用分布于小麥7個部分同源群上的SSR、EST和PLUG標記,對18DM134中所攜帶濱麥染色體的部分同源群歸屬進行鑒定。SSR標記信息參照網站http://wheat-urgi.versailles.inra.

fr和https://graingenes.org/cgi-bin/GG3/browse.cgi,EST標記信息參考網站https://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml,PLUG標記信息參照Ishikawa等[20]的報道。標記均由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成。按照Yin等[21]的方法進行PCR擴增和凝膠電泳分析。

1.2.5 農藝性狀調查

2022年6月收獲植株后,調查并記錄18DM134及其親本的株高、分蘗數、穗長、小穗數、小穗粒數和千粒重。使用SPSS 22(IBM, USA)對數據進行統計分析。

1.2.6 赤霉病抗性鑒定

分別于2021和2022年4月至5月在田間環境條件下,參照Yang[22]的方法采用單花滴注法進行接種,每個材料隨機接種 20 個單穗,套袋保濕 3 d。于2022年9月至10月在溫室中對供試材料的赤霉病抗性進行鑒定,方法與田間環境條件下相同。

接種28 d后,以蘇麥3號為抗病對照,參照《小麥區域試驗品種抗赤霉病鑒定技術規程:NY/T 2954—2016》的方法對材料接種穗的發病程度進行調查和記載,計算供試材料的平均嚴重度和病小穗率[23]。依據材料的平均嚴重度判斷其對赤霉病的抗性水平,劃分標準:平均嚴重度=0,免疫 (I);0<平均嚴重度<2.0,高抗 (HR);2.0≤平均嚴重度<3.0,中抗 (MR);3.0≤平均嚴重度<3.5,中感 (MS);平均嚴重度3.5,高感 (HS)。

平均嚴重度=Σ(各病級穗數×相應病級數)/總調查穗數;

病小穗率= 病小穗數/總小穗數×100%。

1.2.7 赤霉病抗性基因檢測

利用Qi等[24]報道的大賴草7Lr#1S染色體上與赤霉病抗性基因Fhb3連鎖的3個EST分子標記BE404728、BE585744和BE586111及其PCR擴增和凝膠電泳分析方法,檢測18DM134中是否含有Fhb3基因。所用標記的引物信息見表1。

表1 與Fhb3基因連鎖的特異分子標記Table 1 Specific molecular markers linked to Fhb3 gene

2 結果與分析

2.1 細胞學鑒定結果

根尖分生區細胞染色體數目觀察結果顯示,18DM134體細胞在有絲分裂中期含有42條染色體(圖1a)?；ǚ勰讣毎^察結果顯示,18DM134在減數分裂中期Ⅰ染色體配對構型為2n=21Ⅱ(圖1b),未觀察到多價體的形成;在減數分裂后期Ⅰ同源染色體可以均等分離,未觀察到落后染色體(圖1c)。這說明18DM134是一個在細胞學上具有穩定性的材料。

a:有絲分裂中期;b:減數分裂中期Ⅰ;c:減數分裂后期Ⅰ。a: Mitotic metaphase; b: Meiotic metaphase Ⅰ; c: Meiotic anaphase Ⅰ.圖1 18DM134的細胞學觀察結果Fig.1 Cytological observation of 18DM134

2.2 原位雜交鑒定結果

用濱麥全基因組DNA為GISH探針(綠色),對18DM134的根尖體細胞染色體進行鑒定,結果(圖2a)顯示,18DM134含有2條完整的外源染色體和2條易位染色體。進一步用華山新麥草全基因組DNA為GISH探針(綠色),對18DM134的根尖體細胞染色體進行鑒定,結果(圖2b)與用濱麥全基因組DNA為GISH探針的結果相同。這表明18DM134中的外源染色體為Ns染色體。

a:用濱麥全基因組DNA為探針(綠色)對18DM134根尖染色體進行GISH分析;b:用華山新麥草全基因組DNA為探針(綠色)對18DM134根尖染色體進行GISH分析。a: GISH analysis of 18DM134 root tip chromosomes using whole-genomic DNA of L. mollis as probes(green); b: GISH analysis of 18DM134 root tip chromosomes using whole-genomic DNA of P. huashanica as probes(green).圖2 18DM134的GISH結果Fig.2 GISH analysis of 18DM134

以寡核苷酸Oligo-pTa535(紅)和Oligo-pSc119.2(綠)為FISH探針,以華山新麥草全基因組DNA為GISH探針對18DM134進行FISH-GISH分析。結果(圖3a,圖3b)顯示,18DM134體細胞中含有38條小麥染色體、2條完整外源染色體和2條易位染色體。

a:18DM134的FISH分析;b:18DM134的GISH分析;c:18DM134的核型;d:7182的FISH分析;e:7182的核型;f:7182和18DM134中特殊染色體比較。a和b圖中*指示完整的外源染色體,箭頭指示易位染色體;c圖中T表示易位染色體。a: FISH analysis of 18DM134; b: GISH analysis of 18DM134; c: Karyotype of 18DM134; d: FISH analysis of 7182; e: Karyotype of 7182; f: Comparison of special chromosomes in common wheat 7182 and 18DM134. In figures a and b, * indicates the intact alien chromosome, and arrow indicates the translocation chromosome; In figure c, T represents the translocation chromosome.圖3 18DM134的FISH-GISH分析結果Fig.3 FISH-GISH analysis of 18DM134

參照楊曉菲等[21]報道的7182 FISH帶型,發現18DM134中除了6A、3D和5D染色體外,其他染色體均能被準確鑒別出來(圖3c、圖3d和圖3e)。2條完整外源染色體顯示出Oligo-pTa535探針的紅色帶型,分布在短臂端部和長臂的中部與端部,該帶型與6D染色體帶型相似;1條易位染色體只在短臂端部顯示出較強的Oligo-pTa535探針紅色帶型和較弱的Oligo-119.2探針綠色帶型,長臂端部不顯示帶型(圖3c),短臂端部帶型與3D染色體的短臂端部帶型相似,推測該易位染色體為3DS染色體與部分Ns染色體片段發生了易位;同時發現另一條易位染色體長度明顯增加,其短臂端部顯示出3DL染色體端部特異的Oligo-pTa535探針紅色帶型(圖3f),推測3DL染色體易位到5DL染色體上。

2.3 小麥-華山新麥草液相芯片分析結果

小麥-華山新麥草液相芯片檢測顯示,親本7182中,小麥21條小麥染色體上均具有明顯的檢測信號,華山新麥草7條Ns染色體上的檢測信號強度極弱(圖4a)。M842中,小麥21條染色體和華山新麥草7條Ns染色體上均具有明顯的檢測信號(圖4b)。在18DM134中,小麥6A染色體上的檢測信號強度極弱,5D染色體的部分區間強度很高;同時華山新麥草5Ns和6Ns染色體的部分區間的檢測信號強度較強,而在其余Ns染色體上強度很低(圖4c)。通過比較18DM134、7182和M842中小麥6A和5D染色體上檢測信號的分布情況,推測18DM134中小麥6A染色體全部缺失,5D染色體部分缺失(圖4d);同時通過比較18DM134和M842中5Ns和6Ns染色體上檢測信號的分布情況,推測18DM134中含有完整的6Ns染色體和部分5Ns染色體片段。

a:7182;b:M842;c:18DM134;d:7182、M842和18DM134中5D、6A、5Ns和6Ns染色體的信號比較。紫色表示外源Ns染色體的檢測信號。a: 7182; b: M842; c: 18DM134; d: Comparison of 5D, 6A, 5Ns and 6Ns chromosome signals in 7182, M842 and 18DM134. Purple represents the detection signal of alien Ns chromosome.圖4 18DM134的小麥-華山新麥草液相芯片分析結果Fig.4 Liquid array analysis results of wheat-P. huashanica for 18DM134

2.4 分子標記分析結果

使用分布于小麥7個部分同源群的 EST、SSR和PLUG分子標記,對18DM134及其親本7182、D4286和華山新麥草進行分析。從中篩選到位于第5部分同源群的3個SSR標記以及位于第6部分同源群的3個EST標記、1個EST-SSR標記和1個PLUG標記(表2),以上標記在18DM134中均可以擴增出與華山新麥草相同的特異條帶,而在親本7182、D4286中未擴增出目標條帶(圖5)。分子標記分析結果與小麥-華山新麥草液相芯片分析結果相一致,表明18DM134中外源染色體涉及5Ns和6Ns染色體。

M:DL2000;1:7182;2:D4286;3:華山新麥草;4:18DM134;a1:BQ159615;a2:CD453502;a3:BQ167073;a4:Swes123;a5:TNAC1748-Taq Ⅰ;b1:Xgpw8092;b2:Xcfd81;b3:Xgwm410。箭頭指示特異條帶。M: DL2000; 1: 7182; 2: D4286; 3: P. huashanica; 4: 18DM134; a1: BQ159615; a2: CD453502; a3: BQ167073; a4: Swes123; a5: TNAC1748-Taq Ⅰ; b1: Xgpw8092; b2: Xcfd81; b3: Xgwm410. Arrow indicates specific band.圖5 8個多態性標記對18DM134及其親本的凝膠電泳分析Fig.5 Electrophoresis analysis of 18DM134 and its parents using eight polymorphic markers

表2 18DM134中與濱麥染色體連鎖的特異分子標記Table 2 Specific molecular markers linked to L. mollis chromosomes in 18DM134

為確定18DM134中5D染色體部分片段缺失的位置,使用分布在5D染色體不同區間的標記進行分析。結果(表3)顯示,位于5DS染色體和著絲粒位置的標記只在普通小麥7182中表現出多態性,位于5DL染色體的標記在18DM134和7182中表現出相似的多態性,表明18DM134中5DS染色體缺失。推測18DM134的染色體組成為12A+14B+10D+2(6Ns)+2(T3DS-5Ns片段)+2(T3DL-5DL)。

表3 5D染色體不同區間標記在試驗材料中的多態性分析Table 3 Polymorphism analysis of marker in different bin of 5D chromosome in the test materials

2.5 農藝性狀調查和赤霉病抗性鑒定結果

農藝性狀調查結果顯示,18DM134的株高與親本D4286接近,但顯著低于親本M842和7182(表4,圖6a );18DM134的分蘗數、穗長和千粒重均顯著高于親本,而小穗數則顯著低于親本(表4);18DM134的芒長和芒色(圖6b)、粒形(圖6c)與親本D4286接近。赤霉病抗性鑒定結果顯示,18DM134和親本M842對赤霉病表現為高抗,而親本7182和D4286對赤霉病表現為高感(圖6d,表5),推測18DM134的赤霉病抗性來源于其攜帶的Ns染色體?？傮w來看,濱麥染色體的導入使18DM134的株高降低、分蘗增多以及千粒重提高,同時使其具有良好的赤霉病抗性。因此,18DM134可以作為中間橋梁材料用于抗赤霉病新材料的創制。

a:植株;b:小穗;c:籽粒;d:赤霉病抗性表型(接種后28 d);1:7182;2:M842;3:D4286;4:18DM134;5:蘇麥3號。a: Plants; b: Spikelets; c: Seeds; d: FHB resisttance phenotype(28 days after inoculation); 1: 7182; 2: M842; 3: D4286; 4: 18DM134; 5: Sumai 3.圖6 18DM134及其親本的農藝性狀和赤霉病抗性鑒定表型Fig.6 Evaluation of agronomic traits and FHB resistance phenotype of 18DM134 and its parents

表4 18DM134及其親本的主要農藝性狀比較Table 4 Comparison of the main agronomic traits of 18DM134 and its parents

表5 供試材料的赤霉病抗性鑒定統計結果Table 5 Statistical results of identification of FHB resistance in the test materials

2.6 赤霉病抗性基因檢測結果

利用大賴草中與赤霉病抗性基因Fhb3連鎖的3個標記BE404728、BE585744和BE586111對18DM134的抗性基因進行檢測。結果在18DM134中未擴增出與大賴草相同的目標條帶,推測18DM134中外源染色體上攜帶的赤霉病抗性基因不同于Fhb3,可能為新的赤霉病抗性基因(圖7)。

M:DL2000;1:大賴草;2:7182;3:D4286; 4: 濱麥;5:18DM134;a:BE404728;b:BE585744:c:BE586111。箭頭指示Fhb3基因的特異條帶。M: DL2000; 1: L. racemosus; 2: 7182; 3: D4286; 4: L. mollis; 5: 18DM134; a: BE404728; b: BE585744; c: BE586111. Arrow indicates the Fhb3 gene-specific band.圖7 8DM134中Fhb3基因的檢測結果Fig.7 Fhb3 gene detection result in l8DM134

3 討論

近年來隨著寡核苷酸探針的發展,FISH技術有了巨大進步,通過不同探針的組合,可以獲得高分辨率的染色體核型圖譜,在鑒定植物外源染色體和識別植物同源染色體方面具有重要作用[25]。本研究用寡核苷酸Oligo4-pTa535(紅)和Oligo-pSc119.2(綠)作為FISH探針,用華山新麥草全基因組DNA作為GISH探針對18DM134進行FISH-GISH分析。結果顯示,18DM134中6A染色體被來自濱麥的2條Ns染色體完全替換,2條Ns染色體片段易位到3DS染色體上,同時3DL染色體易位到5DL染色體上;此外,6Ns染色體短臂端部以及長臂中部與端部顯示出Oligo-pTa535探針的特異帶型,可用于小濱麥衍生系中6Ns染色體的鑒定。

分子標記技術在植物外源基因組成鑒定以及同源群歸屬分析等方面具有重要作用[26]。根據不同的檢測原理結合其在染色體上的特性,可以將分子標記劃分為不同的類型,如基于PCR和凝膠電泳技術的SSR和EST標記,基于限制性內切酶和PCR技術的RFLP、AFLP和PLUG標記,基于高通量測序或芯片雜交技術的SNP標記[27]。本研究利用小麥-華山新麥草液相芯片(GenoBaits○RWheatplusPh)以及分布于小麥7個部分同源群上的分子標記,對18DM134的染色體組成進行分析。結果顯示,18DM134中整條6A染色體和5DS染色體缺失,同時18DM134中含有的外源染色體涉及整條6Ns染色體和部分5Ns染色體片段。結合FISH-GISH結果,推測18DM134的染色體組成為12A+14B+10D+2(6Ns)+2(T3DS-5Ns片段)+2(T3DL-5DL)。

農藝性狀調查結果顯示,18DM134的植株較矮,且具有長穗、高千粒重等優良農藝性狀;赤霉病抗性鑒定結果顯示,18DM134在田間和溫室環境下均對小麥赤霉病表現出良好的抗性,根據系譜分析和Fhb3基因連鎖標記檢測結果,推測該衍生系攜帶的6Ns染色體和部分5Ns染色體片段可能攜帶新的赤霉病抗性基因。目前由于缺少6Ns和5Ns的代換系,暫時無法準確確定18DM134中赤霉病抗性基因所在的染色體位置。同時由于18DM134含有較多的外源染色體,染色體組成較為復雜,在遺傳過程中可能會由于染色體聯會配對錯誤,造成外源染色體丟失,導致其失去對赤霉病的抗性。易位系因僅導入外源染色體的片段,可減少不良基因的帶入以及外源染色體所引起的普通小麥遺傳背景的不協調,具有良好的遺傳穩定性[28]。因此,在小麥和近緣種屬雜交培育附加系和代換系的基礎上,需進一步利用組織培養、Ph1b基因突變體誘導部分同源重組、輻射誘變處理、殺配子等技術獲得臂間易位系或小片段易位系[29-30],其中60Co-γ電離輻射[31]和Ph1b誘導部分同源重組[32]產生易位系的效率最高,應用最為廣泛。在后續研究中可通過60Co-γ電離輻射和Ph1b誘導部分同源重組的方法對18DM134進行處理,誘導產生抗赤霉病的小片段易位系材料,然后通過連續的回交和自交,獲得新的抗赤霉病種質材料。