重離子束輻照阿維菌素菌種選育與發酵工藝優化

李榮祎

（核工業甘肅礦冶局，甘肅蘭州 730030）

0.引言

阿維菌素是一種生物農藥，符合世界農藥發展趨勢和我國產業政策。被廣泛用于動植物病害防治，是主要的生物農藥和獸藥品種之一，作為推薦使用的高效低毒的農藥產品，具有較好的市場前景。菌種選育常用的方法包括化學誘變、r-射線輻照誘變、基因重組等，重離子束輻照誘變具有周期短、穩定性好等優點，誘變選育阿維菌素菌種，不僅可以提高阿維菌素的產能，還使有效組分AVMB1a 組分比例顯著提高。

1.菌種選育

利用中國科學院近代物理研究所中重離子束輻照誘變的高產菌株。首先在實驗室對小 試基本條件進行驗證，分別從溫度、濕度、搖床轉速、振幅、搖瓶容積、裝液量等方面進行試驗，確保實驗室條件滿足小試需求，再對重離子束誘變獲得的菌株進一步分離純化及篩選，獲得性能相對穩定的高產菌株[1]。

1.1 分離純化

將出發菌種鏟取0.2cm2～0.5cm2大小菌苔制備單孢子菌懸液備用。用十倍稀釋法一次做10-2、10-3、10-4、10-5梯度。用吸管吸取稀釋液，滴加1 滴（約0.3ml ～0.5ml）于各個平板中，涂布10-3、10-4、10-5梯度。27.5℃±0.5℃恒溫培養6d ～7d 后保存備用。

1.2 初篩

挑選草帽型（如圖1 所示為菌落形態）、灰白色、飽滿、較圓、直徑0.25mm 以上形態較好的單菌落均勻涂于斜面。27.5 ℃±0.5 ℃，濕度30%～40%，6d ～7d后斜面具有如下特征：斜面表面全部長滿均勻一致、灰白色孢子，斜面背面有微黃色色素擴散至瓊脂中。培養成熟的斜面保存備用。

圖1 菌落形態

種子搖瓶培養：250ml 三角瓶，裝量40ml。鏟取F1代斜面0.5cm2～1cm2左右到種子搖瓶中，每支斜面接一支搖瓶。恒溫27.8℃～28.2℃，轉速260 轉/min，振幅2.5cm，培養28h 后摘下備用。

發酵瓶培養：為250ml 三角瓶，裝量為40ml。取一級種1.6ml（接種量為4%）至發酵瓶中，恒溫27.8℃～28.2℃，轉速250 轉/分，振幅3.0cm。發酵瓶培養256h 后測效價。

通過發酵過程中菌絲形態（如圖2 所示為菌絲形態）觀察，發酵效價檢測，篩選性能穩定的優良菌種。

圖2 斜面菌種、菌絲形態

1.3 復篩（方法同初篩）

F2 代斜面制備：將選出的初篩F1 代斜面涂抹于空白斜面上，每支F1 代斜面傳3 支F2 代斜面。

1.4 結果分析

研究表明，草帽型菌落的產抗能力均高于其他菌落。故以挑選草帽型菌落為最佳[1-2]。

對經誘變處理、分離篩選獲得的高產菌株進行產能及效價測定，與出發菌株對照，結果顯示：選育菌株性能明顯優于對照菌株，效價可達6000μg/ml 以上，主要活性成分AVMB1a 在產物中的所占比例明顯提高，以此作為試驗菌株傳代培養，阿維菌素產能及有效組分基本穩定。

2.發酵培養基及工藝條件優化試驗

根據菌種特性及生長營養要求，利用單因子試驗法、均勻設計原理，分析不同碳源、氮源及其配比對阿維菌素發酵單位的影響，以獲得適宜的種子培養基和發酵培養基配方，初步得出中試基本工藝控制參數，為放大中試及生產進一步優化工藝提供依據[2-3]。

2.1 種量及種齡關系研究

250ml 搖瓶裝量40ml，轉速250r/min，振幅2.5cm～3.0cm，接種量分別按3%、4%、5%、6% 4 個梯度做對照試驗，種齡按26h、28h、32h、36h 梯度做對比試驗，結果如表1 所示。

表1 種齡及種量試驗

種量及種齡試驗分析：采用較大的接種量有利于提前形成產物，可以有效縮短發酵周期。但是，如果接種量過大，菌絲往往生長過快，造成發酵液黏度增加、溶解氧不足，影響微生物正常代謝和產物的積累。而接種量過小，使得發酵周期延長。經試驗，發酵搖瓶接種量以4%～5%為最佳[2-3]，相應發酵罐接種量8%～10%為好。

種子種齡過短則接入發酵后生長過慢，菌種生長期延長，在生長期內營養物質消耗過快，導致產抗營養不足，最終效價偏低；過長則接入發酵后，菌絲生長過快，容易使料液變黏稠，中后期營養物質利用慢，最終效價低。故將種齡控制在28h ～32h 為最佳。

2.2 主要碳源、氮源、無機鹽及微量元素試驗

2.2.1 主要碳源對發酵影響分析

選擇不同的碳源類物質組成不同的培養基配方（總碳量保持一致），其他組成不變反復進行試驗發酵，與對照組比對，結果如表2 所示。

表2 不同碳源搖瓶發酵效價對比

碳源試驗結果分析：麥芽糊精作為主要碳源時發酵效價比對照組高5%～10%，而且高濃度有利于提高發酵產量。淀粉加葡萄糖作為碳源時，由于還原性糖濃度過高，發酵前期菌絲不結成菌球，料液黏度過大，導致氧的傳遞受阻，中后期發酵效價仍極低，只能提前放罐。淀粉液化液作為發酵的唯一碳源時，仍有大量分散菌絲，發酵效價受到一定影響。

綜合考慮原料的易得性、原料價格及對發酵產能的影響，選擇麥芽糊精作為發酵培養基碳源較佳。

2.2.2 主要氮源物質及微量元素對發酵的影響

各種濃度的有機氮源類物質互相搭配，組成不同的有機氮源配方進行對照試驗。測試了4 種有機氮源在同一水平上、不同配比形式對于阿維菌素產量的影響。按照不同比例配比一定量的無機氮源，分別進行對比試驗，結果如表3 所示。

表3 氮源及無機鹽均勻設計試驗

氮源物質及微量元素對發酵的試驗結果分析：結果顯示，熱榨黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉作為復合氮源時，其發酵單位比其他配方高10%～15%。幾種無機氮源在一定濃度范圍內，阿維菌素的產能均有一定的提升，其中以一定量的(NH4)2SO4作用最為明顯，可以使產量提高10%；硝酸銨作為無機氮源時對于發酵效果無明顯影響。

2.3 發酵工藝優化試驗研究

利用FUS-50L 發酵罐做控制工藝優化試驗，接種種子搖瓶，培養24h 左右，觀察菌絲為網狀分布時接入發酵罐，發酵罐投料30L，接種量為8%～10%。通過多批次試驗，對發酵過程溫度、碳氮比、轉速、通氣比等進行優化，確定最佳工藝控制參數[3-4]。

2.3.1 不同溫度條件下發酵效果對比

由于阿維菌素對溫度較為敏感，溫度過高或過低均會影響菌種正常產抗生素水平，故在發酵過程控制中必須確定最佳發酵溫度范圍。

表4 不同溫度發酵效價對比

發酵溫度的試驗結果分析：溫度在（28±0.5）℃時發酵效價最高，溫度在27℃以下時生長緩慢，效價相對較低，溫度在29℃以上時菌種生長較快，但發酵效價不高。

2.3.2 pH 值

經試驗發酵液的pH 調至6 ～7 為最佳，pH 過高或過低都會對發酵產能造成不利影響[4-5]。

為了使pH 滿足微生物生長及代謝產物積累，在培養基內加入(NH4)2SO4是一種有效方法。因(NH4)2SO4在培養液中可分解為NH4+和SO42-，NH4+可以供微生物利用，而SO42-又能使培養基pH 值相對保持穩定。

3.中試發酵生產

在1000L 發酵罐上進行多批次發酵試驗，對發酵配方、工藝參數持續優化的基礎上，用高產菌株在5000L 發酵罐上進行了放大試驗，連續生產3 批發酵液B1a 組份的含量分別為4664μg/ml、4664μg/ml 和4892μg/ml。先后完成中試連續生產10 個批次，平均發酵周期260h，放料體積4.0t，平均效價4600mg/L。

4.研究成果及應用前景

本項目研究了利用重離子輻照誘變阿維鏈霉菌菌株，通過大量篩選獲得了高產菌株，搖瓶發酵試驗結果顯示，獲取的正突變菌株產抗生素能力比出發菌株有一定程度的提高。對篩選出的高產菌株再進行反復考察和對發酵培養基進行優化，選擇出生產性能優良且穩定的高產菌株，使其搖瓶發酵效價達到了6000μg/ml，5m3發酵罐生產發酵效價有效組分B1a 含量可達到4600mg/L 以上。

該項目研究已經通過了甘肅省科技廳組織的成果鑒定鑒定委員會一致認為：該項目研究目標明確，技術路線先進，數據可靠，采用重離子束輻照誘變選育阿維菌素菌種具有先進性，所獲得的4600 以上發酵效價及相關工藝技術屬國內領先水平，同意通過科技成果鑒定。

重離子輻照誘變阿維鏈霉菌種為工業微生物生產菌種選育提供了參考依據。研究成果對提高阿維菌素發酵水平、節約資源具有重要參考價值、潛在的社會和經濟效益可觀，有較好的推廣前景。