裂殖壺藻SlMYB118基因的克隆及生物信息學分析

陳 菁，蘇永昌，孫化淼，陳由強，薛 婷*，代容春*

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.海洋生物醫藥與制品產業化開發技術公共服務平臺，福建 福州 350117；3.福建省特色海洋生物資源可持續利用重點實驗室，福建 福州 350117；4.福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

DHA(Docosahexaenoic acid)，即二十二碳六烯酸，是一種多不飽和脂肪酸，在人體內無法自行合成，具有促進大腦發育、保護視網膜、降低甘油三酯含量、改善血管功能和治療心腦血管疾病等重要作用[1-3]。DHA的主要來源是深海魚油和海洋微藻[4]，其中魚油是DHA的傳統來源，但受魚的品種、部位、季節、產地的影響而產生波動，DHA含量不穩定，此外魚油生產工藝較為復雜，產品多具有腥味，且易受海洋污染物的影響[5-8]；而可生成DHA的微藻能夠彌補魚油資源有限的缺陷，其培養具有不受季節、地域等條件的限制，培養周期短、產量高、不含有魚腥味、脂肪酸組成和提取純化工藝簡單、不破壞生態環境的特點和優勢，打破了傳統魚油應用的限制[9-10]。因此，利用海洋微藻生產DHA具有更加廣闊的應用前景。

裂殖壺藻(SchizochytriumlimacinumSR21)是一種單細胞海洋真菌[11]，同時又是一種富含DHA的海洋微藻。裂殖壺藻具有生長速度快、生物量高、發酵周期短且安全、易于提純等優勢[12]。根據《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規定，衛生部批準的新資源食品中包括DHA藻油，其中裂殖壺藻被列為DHA藻油的來源之一。鑒于其DHA藻油商業化應用的許可不存在行政障礙，且世界很多國家已有其藻油DHA商業生產的成功先例，商業化應用較為成熟，因此選擇裂殖壺藻為天然DHA的合成工具，作為DHA規模化、商業化應用的理想藻株。

目前，裂殖壺藻的研究還停留在結合DHA合成途徑菌株性能的改善、發酵過程的調節以及油脂的提取和純化[13]。而近年來，植物轉錄因子的研究已成為熱點之一，調控脂肪酸合成和油脂積累的轉錄因子更是備受青睞。轉錄因子并不單獨作用，而是形成代謝調控網絡，共同發揮調控脂肪酸合成的作用，這些轉錄因子分屬各個家族，包括AP2家族、B3家族、DOF家族、MYB家族、HAP3/CBP和CHD3等[14]。研究報道，擬南芥MYB118基因是與種子發育時胚胎建成、脂肪酸從頭合成和代謝及油脂積累相關的關鍵轉錄因子，過表達MYB118基因能夠正調控一系列與脂肪酸合成、糖酵解途徑相關的基因，從而調控種子中脂肪酸的生物合成和油脂的積累[15]，但該基因在其他物種中有關脂肪酸生物合成的調控研究尚未見報道。為了挖掘裂殖壺藻DHA合成相關的轉錄因子，本課題組前期利用氮源脅迫下不同培養時期的細胞RNA-Seq數據，通過加權基因共表達網絡分析(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法構建網絡，尋找到1個與DHA含量特異相關的模塊，且該模塊中的關鍵基因[包含SlMYB118基因(GenBank登錄號：OQ784160.1)]與脂肪酸的合成相關，由此推斷該模塊中SlMYB118基因是潛在的裂殖壺藻 DHA合成調控的轉錄因子[16]。因此，本文對裂殖壺藻的SlMYB118基因進行研究，經PCR實驗過程獲取該基因的cDNA全長，并對SlMYB118基因進行蛋白質理化性質分析，預測蛋白質的親/疏水性、保守結構域、結構預測以及系統進化等生物信息，為后續確定SlMYB118基因的結合位點在轉錄調控機制研究、DHA合成相關轉錄調控網絡的建立奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種

裂殖壺藻購買于美國馬里蘭洲洛克菲勒的美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

1.1.2 試劑

TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、Trans5α Chemically Competent Cell、EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit、X-gal(20 mg/mL)、IPTG(500 mmol/L)購自北京全式金生物技術有限公司；TIANgel Maxi Purification Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；克隆載體pMD19-T、DNA Marker購自Takara公司；Gloria Nova HS2X Master Mix、瓊脂粉購于ABclonal公司；蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素鈉購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖購自西隴科學股份有限公司。

1.1.3 培養基

采用YPD培養基培養裂殖壺藻，配方為1 L海水中加入5 g葡萄糖、1 g蛋白胨和1 g酵母粉，于115℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，pH為5。

1.1.4 設備

滅菌鍋[施都凱儀器設備(上海)有限公司]、新型迷你型恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)、小型臺式冷凍離心機(德國艾本德股份公司)、DYY-5型穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)、Mini PCR儀(美國Applied Biosystems)、凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)、電熱恒溫水槽(上海恒一科技有限公司)、電熱恒溫培養箱(福州科遠貿易有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂殖壺藻總RNA的提取

取2 mL、密度為5.58×107個/mL、處于對數生長期的藻液接種，加入裝有100 mL YPD培養基的錐形瓶中，振蕩培養箱的溫度設置為28°C、轉速設置為200 r/min。培養至對數生長期時，取50 mL裂殖壺藻，利用離心機8 000 r/min離心5 min。將藻泥裝入1.5 mL離心管中，用液氮速凍，取出后加入TransZol Up試劑1 mL，然后加入直徑為4 mm的鋼珠，利用自動研磨儀進行研磨，參數設置為60 Hz、3 min。之后的步驟按照TransZol Up Plus RNA Kit的說明書進行提取，提取結束后，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證該RNA的質量，以及利用NanoDrop-2000分光光度儀檢測RNA的濃度。利用所提的RNA為模板，遵循反轉錄試劑盒的要求，合成cDNA的第一鏈，并保存于-20°C以備用。

1.2.2SlMYB118基因的擴增

利用SnapGene軟件設計引物。依據本實驗室建立的裂殖壺藻基因組數據庫中的SlMYB118基因序列來設計一對引物：上游(F)、下游(R)(表1)，下劃線為EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點，并且送到福州尚亞生物技術有限公司進行合成。

表1 SlMYB118基因引物序列

以cDNA為模板擴增SlMYB118基因，采用Gloria Nova HS2X Master Mix，以F和R為引物進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：cDNA模板2 μL，F、R引物各1 μL，Gloria Nova HS2X Master Mix 25 μL，ddH2O 21 μL。在PCR儀中，首先94°C預變性5 min；其次94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸1 min，35個循環；再72°C終延伸7 min；最終4°C保存。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測并分離，之后利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 目的基因的克隆及測序

在16°C連接儀中，將回收的PCR產物與pMD19-T載體過夜連接，連接產物轉化至Trans5α Chemically Competent Cell，并涂布于藍白斑篩選平板培養基上，在37°C培養箱中倒置、過夜培養。挑單菌落進行培養，菌液進行抽提質粒驗證并送至杭州擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 裂殖壺藻SlMYB118蛋白質的生物信息學分析

裂殖壺藻SlMYB118蛋白質的生物信息學內容如表2所示。

表2 蛋白質結構與功能預測的相關軟件網站

2 結果與分析

2.1 裂殖壺藻總RNA的提取

圖1是裂殖壺藻總RNA的凝膠電泳結果。從圖1可以看出，有兩條清晰的條帶在凝膠上，條帶分別是28 S和18 S。圖像結果證實試驗所提取的總 RNA 較完整。RNA經超微量紫外分光光度計檢測，所提取的總RNA的濃度為220 ng/μL，OD260 /OD280 比值為1.81，表明所提取的總RNA符合反轉錄的實驗要求。

注：1、2、3為裂殖壺藻的總RNA。

2.2 以裂殖壺藻cDNA為模板的PCR擴增結果

以裂殖壺藻cDNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DL 2000 marker進行對比，可見擴增片段約為2 000 bp，與目的片段大小吻合(圖2)。

注：M為DL 2000 marker；1為cDNA擴增。

2.3 pMD19-T克隆目的片段的檢測結果

抽提質粒，電泳結果如圖3所示。電泳圖顯示，重組質粒片段約為5 026 bp，目的片段的大小與預期的相一致，表明SlMYB118基因的cDNA成功連接在PMD19-T質粒上。將成功克隆的質粒進行測序，經SnapGene軟件分析的測序結果與裂殖壺藻SlMYB118基因的cDNA序列比對一致(圖4)，表明重組質粒PMD-SlMYB118構建成功。

注：M為Supercoiled ladder；1為PMD-SlMYB118質粒。

2.4 裂殖壺藻SlMYB118基因的生物信息學分析

2.4.1 裂殖壺藻SlMYB118蛋白質的理化性質

經Bioedit軟件分析，裂殖壺藻SlMYB118基因的cDNA序列全長為2 280 bp，其中G+C含量為53.11%，A+T含量為46.89%。使用ProtParam Tool分析，SlMYB118蛋白質分子量為84.81 kDa，分子式為C3601H5604N1194O1155S22，理論等電點(pI)為8.75。該蛋白質的不穩定指數為70.54(<40為穩定蛋白質)，推測其為不穩定蛋白質。預測該蛋白質在大腸桿菌中表達的半衰期大于10 h，在酵母中表達的半衰期大于20 h，而在哺乳動物網狀細胞中體外培養表達的半衰期為30 h。SlMYB118蛋白質由20種基本氨基酸組成，氨基酸殘基較多的是谷氨酰胺(Gln，8.6%)、組氨酸(His，8.8%)和絲氨酸(Ser，12.9%)，氨基酸殘基較少是苯丙氨酸(Phe，1.7%)、酪氨酸(Tyr，1.4%)、色氨酸(Trp，1.1%)以及半胱氨酸(Cys，0.5%)。由表3可知，SlMYB118蛋白質帶有負電荷的氨基酸72個(Asp+ Glu)、正電荷的氨基酸76個(Arg+ Lys)。

表3 SlMYB118蛋白質的氨基酸組成

續表3

2.4.2 親/疏水性分析

經ProtScale在線程序分析，親/疏水性最大值為1.667(位于第754位氨基酸處)，最小值為-3.622(位于第190位氨基酸處)，總平均疏水性為-1.087，同時SlMYB118蛋白質含有較多的親水域，說明SlMYB118蛋白質為親水性蛋白質(圖5)，其脂肪系數為53.04。

2.4.3 結構預測

圖6中，根據NCBI保守結構域數據庫(CDD)的結果表明，該蛋白質具有Myb_DNA-binding結構域，同時該結構域同屬于SANT超家族。SANT超家族是Myb超家族蛋白質，包括轉錄因子和mRNA剪接因子(轉錄/RNA加工修飾/細胞分裂和染色體分割)，符合對該蛋白質的預期。DeepTMHMM預測SlMYB118蛋白質處于膜內，因此SlMYB118蛋白質不存在跨膜結構域；Hum-mPLoc 2.0預測該蛋白質定位于細胞核。經過SignalP5.0在線預測信號肽的可能性為0.001 2，顯然小于閾值0.500 0，因此SlMYB118蛋白質不存在信號肽序列。SlMYB118蛋白質磷酸化位點由NetPhos3.1在線軟件進行預測，結果如圖7所示，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，可能存在106個磷酸化位點在SlMYB118蛋白質中，其中包括3個酪氨酸(Tyr)位點、22個蘇氨酸(Thr)位點及81個絲氨酸(Ser)位點。

2.4.4 二級和三級結構預測

圖8中，SlMYB118蛋白質的二級結構由在線軟件SOPMA進行預測。SlMYB118蛋白質二級結構包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲。這些結構中所占比例最高的為無規則卷曲(56.92%)，其次為α-螺旋(25.96%)，所占比例最低的為β-轉角(5.67%)。由此可知，SlMYB118蛋白質二級結構主要是由無規則卷曲和α-螺旋組成，隸屬混合型蛋白質。圖9為SlMYB118蛋白質三級結構的預測結果，其是通過SWISS-MODEL對SlMYB118蛋白質三級結構的同源建模。

2.4.5 系統進化樹

將SlMYB118蛋白質序列提交至NCBI-Blastp進行比對，結果顯示裂殖壺藻SlMYB118蛋白質序列與HondaeafermentalgianaMYB98蛋白質序列相似度最高，為80.57%；與H.fermentalgianaMYB44蛋白質序列的相似度次之(48.60%)。在MEGA11軟件中，采取鄰接法(Neighbor-joining algorithm)、bootstrap重復次數為1 000次(圖10)，將其中15種與裂殖壺藻相似度較高的MYB蛋白質序列與目的蛋白質構建系統發育進化樹。結果顯示裂殖壺藻SlMYB118蛋白質與H.fermentalgianaMYB98蛋白質聚為一支，親緣關系最近。

3 討論

MYB類轉錄因子家族是指含有MYB結構域的一類轉錄因子，是植物中較大轉錄因子的家族之一。MYB轉錄因子的共同特征是具有保守的MYB結構域由N端1-4個R基序組成，根據R基序重復的數目可以分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB等 4種類型[17]。裂殖壺藻SlMYB118蛋白質通過保守結構域分析，表明該蛋白質具有2個Myb_DNA-binding結構域，屬于R2R3-MYB。在植物中，R2R3-MYB普遍數目較多，且發揮多種重要功能，包括形態建成、次級代謝調節和抗逆性等生理生化活動[18-24]。如擬南芥AtMYB37、AtMYB38和 AtMYB84能夠調控其側分生組織的形成[18]；月季RhMYB113c基因通過MYB-bHLH或MYB-bHLH-WD40復合物調節花青素苷的合成，從而影響月季紅色花瓣的著色[19]；三七PnMYB1基因能夠調控三七皂苷生物合成途徑中基因的表達，促進三七皂苷的合成[20]；Ye Z M等[21]的研究表明，CitMYB21基因負調控柑橘類類黃酮生物合成；在擬南芥中，過表達荷花的NnMYB4基因，使其AtC3H、At4CL1、AtF5H、AtCOMT1等木質素合成關鍵酶的表達量下調，從而負調控植物木質素的合成[22]；在干旱脅迫條件下，白羊草中的BiMYB142、BiMYB143和BiMYB35基因通過調控其靶基因的表達，增強了白羊草抗旱的能力[23]；在低溫脅迫下，番茄SlMYB102基因對6種外源激素的積累具有積極作用，推測其可能參與了這6種激素對抗寒性的調控通路[24]。本課題組前期利用氮源脅迫下不同培養時期的細胞RNA-Seq數據，通過WGCNA分析，證實SlMYB118基因與脂肪酸的合成相關，由此推測SlMYB118基因是裂殖壺藻DHA合成調控的潛在轉錄因子。本研究通過蛋白序列比對，表明SlMYB118蛋白序列與H.fermentalgianaMYB98蛋白質序列最為相似；系統進化樹顯示H.fermentalgiana的MYB98、MYB44及MYB118蛋白質序列與裂殖壺藻的SlMYB118蛋白質序列聚為一支，可見2個物種之間的親緣關系較近。裂殖壺藻與H.fermentalgiana均為破囊壺菌科，這與NCBI分類數據庫一致。

轉錄因子在動、植物的生長發育及其對外界環境的反應中起著重要的調控作用，一直以來都是研究內容之一，現也是生物學研究領域的熱點。多種微藻中調控DHA的機理已被研究[25-26]，而裂殖壺藻調控DHA的機理目前僅局限于在不同供氧條件下的轉錄組和基因表達的分析[27]。大量研究推測，裂殖壺藻多不飽和脂肪酸的合成可能存在2種途徑：一是以乙酰輔酶A為起點，經過一系列的碳鏈延長和脫飽和反應得到多不飽和脂肪酸(FAS途徑)；二是以乙酰輔酶A為起點，不經過一系列的碳鏈延長酶和脫飽和酶反應，而是形成多酮基與多羥基的化合物(PKS途徑)[28]。隨著測序技術的不斷發展，已開展利用基因組、轉錄組來揭示參與DHA合成途徑的關鍵功能基因(如延長酶、去飽和酶、聚酮合成酶等)，目前利用過量表達脂肪酸合成途徑中的單個關鍵酶/酶的亞基基因，或是通過同時過量表達代謝途徑中的多個酶基因的方法來提高DHA含量，但這些方法在一定程度上都無法突破脂肪酸合成通量的限制[29-30]。DHA合成受多個層面的調控，不僅涉及到脂肪酸合成途徑相關功能基因的表達，也與轉錄因子的導向作用密切相關，但參與DHA合成的關鍵轉錄因子還不清楚，且該信號通路激活的下游基因仍未知，及其參與調控裂殖壺藻DHA合成在國內、外也少有研究。因此，挖掘調控DHA合成的關鍵轉錄因子，并鑒定其下游靶基因，解析其參與DHA合成調控的分子機制是高產DHA裂殖壺藻藻種構建和選育亟需解決的關鍵科學問題。本研究為后續對裂殖壺藻SlMYB118基因的結構、功能及其對脂肪酸合成調控的研究提供了依據。