頂空固相微萃取和同時蒸餾萃取技術在肉制品風味分析中的應用

馬嘉晨，黃 迪，徐文思，龔葉春，劉懿漩，楊祺福，賀 江，王伯華

（湖南文理學院生命與環境科學學院，水產高效健康生產湖南省協同創新中心，環洞庭湖水產健康養殖及加工湖南省重點實驗室，常德市農業生物大分子研究中心，常德市人工智能與生物醫藥研究中心，湖南常德 415000）

隨著經濟水平的提高，消費成本降低，我國肉制品消費不斷升級，消費者對肉制品品質要求也不斷攀升，肉制品的風味成為了評價其品質優劣的重要感官指標之一。肉制品的脂肪中不飽和烴基鏈氧化分解后會產生氫過氧化物，在有裂解酶或酸性條件下，氫過氧化物進一步反應生成醇、醛、酸、酯、酮、呋喃等揮發性風味物質，這些物質對肉制品產生特征香味具有重要作用[1]。目前，萃取肉制品中的風味成分主要有固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）[2-3]、同時蒸餾萃取（Simultaneous distillation-extraction，SDE）[4]和超臨界流體萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）[5]等 方 法。其 中，SPME 是由加拿大學者Pawliszyn 及其合作者在1990 年提出[6]，在固相萃取技術基礎上發展起來的新型萃取分離技術。而SDE 在1964 年就發展起來了，是一種能收集揮發性與半揮發性成分的有效方法，可以實現蒸餾與萃取同時進行[7]。

將HS-SPME、SDE 技術及兩者在肉制品風味物質分析中的應用進行匯總分析，便于對肉制品風味研究有深入了解，為肉制品風味分析相關方面的研究提供一定參考。

1 頂空固相微萃取技術

1.1 HS-SPME 概述

SPME 作為一種新型高效的樣品前處理技術，已經被廣泛應用各種風味物質的檢測中[6，8-10]。而頂空固相微萃取（Headspace solid phase microextraction，HSSPME） 屬于其中一種，是一種簡單方便、經濟環保的綠色萃取技術。由于該技術可以同時實現采樣、萃取、濃縮、進樣的環節，所以很大程度上縮短了檢測和分析時間[11]。且常與氣相色譜- 質譜儀（Gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS） 聯 合 使用，用于分析待測物中的有機揮發性物質。

HS-SPME 裝置主要由萃取頭和手柄構成（圖1 所示），使用時主要由纖維萃取頭上的涂層發揮作用[12]。原理是將待測樣品放入一個密閉的容器中，纖維萃取頭頂空置于樣品上方，一段時間后，樣品中的揮發成分便從其中釋放出來進入容器的頂空，并且逐漸吸附于纖維萃取頭上，待吸附平衡后萃取完成。隨后將萃取頭置于GC-MS 進樣口進行熱解析，隨載氣進入色譜柱進行分離分析[13]。

圖1 SPME 萃取頭

SPME 萃取頭[14]見圖1。

1.2 HS-SPME 萃取條件優化

影響HS-SPME 的主要因素有樣品量、萃取溫度、萃取時間、NaCl 添加量及平衡時間等[15]。且因影響因素較多，使試驗結果誤差較大，因此一般需要進行條件優化，以探索最優的HS-SPME 萃取條件。常用的HS-SPME 優化方法為單因素試驗分析法。即分別分組進行試驗，比較分析不同平衡時間、鹽度、萃取時間和萃取溫度的萃取效果，選取一組最優參數作為萃取條件。

1.2.1 平衡時間的選擇

平衡時間在特定的范圍內時，揮發性風味物質達到相對平衡狀態，有利于萃取頭吸附。由于揮發性物質在空氣中擴散較快，萃取時很容易達到平衡狀態，因此隨著平衡時間的延長，萃取頭逐漸趨于飽和，影響其萃取效果[16]。

1.2.2 食鹽添加量的選擇

食鹽添加量對樣品中的揮發性物質含量影響也較大。適量的鹽離子可增加待測組分的離子強度，提高HS-SPME 分析法的靈敏度，但若NaCl 添加過量，一些揮發性組分的擴散速度可能會因此降低，可能與鹽離子表面的阻礙吸附有關[17]。

1.2.3 萃取時間的選擇

對揮發性風味成分的萃取也會受到萃取時長的影響，在一定萃取時間范圍內，揮發性成分的峰面積先明顯增大后減小，因為到達一定時間后，揮發性物質到達平衡狀態，萃取頭處于飽和[16]。若萃取時間過長，已經被吸附的組分可能出現吸附現象，從而降低萃取效果[18]。

1.2.4 萃取溫度的選擇

不同萃取溫度對萃取效果影響較大，溫度過低不能使樣品中風味物質完全揮發出來吸附于萃取頭上；而溫度過高則會使已經吸附于萃取頭上的揮發性物質解析，重新回到樣品頂空中去。因此，要對萃取溫度進行優化，選取最優的萃取溫度作為萃取條件。

1.3 揮發性風味成分分析

揮發性風味分析的定量方法主要有面積歸一法、內標法、外標法及標準加入法。歸一法特點是其簡單有效，可用來進行半定量以獲取大量數據，是一種相對定量方法。內標法是目前國外應用較為廣泛的，其優勢在于可消除試驗操作中的誤差，且檢測結果也更加準確可靠。而在選擇不到合適的內標物時，可以使用標準加入法。標準加入法就是將待測物的純物質當作標準物質加入待測樣品中，用相同色譜條件分別測定標準物質加入前后的峰面積，然后計算該標準物質在樣品中的含量[19]。外標法也稱標準曲線法或直接比較法，是使用待測物的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測物質的響應信號相比較而進行定量的方法，是一種簡便且快速的絕對定量方法[20]。

2 同時蒸餾萃取技術

2.1 SDE 概述

SDE 是集提取、分離和富集樣品中揮發性、半揮發性成分于一體的方法[21]，隨著人們對于食品安全的逐步關注，SDE 被人們所熟知。目前，其作為氣相色譜法、氣相色譜- 質譜聯用等技術的前處理技術，已經在各類食品中的揮發性和半揮發性風味物質萃取與分析中得以廣泛應用。

SDE 是將樣品液相與萃取溶劑同時加熱至沸騰狀態，含有待測樣品的水蒸氣與萃取溶劑蒸氣充分混合后，再經水冷凝，兩相充分接觸可以實現組分之間的相轉移（裝置如圖2 所示），是將樣品與水的混合液置于儀器右側燒瓶中，儀器左側燒瓶盛裝萃取溶劑，兩瓶同時加熱至沸騰，待測樣品蒸汽和萃取溶劑蒸汽同時在儀器頂部冷凝下來，樣品中的揮發性與半揮發性的風味成分被萃取溶劑捕集，帶有樣品的水相和溶劑相在裝置C 側的U 形管中分層。隨著萃取的進行，兩相分別回流至兩側燒瓶中，如此蒸餾萃取過程循環進行，樣品中的揮發性、半揮發性組分逐步經水相轉移入萃取溶劑中，且只需要少量溶劑就可提取大量樣品，風味成分就能夠得以濃縮。萃取結束之后，收集裝置A 側燒瓶和C 側U形管中的溶劑相，合并的溶劑相經脫水、濃縮后即可用于分析檢測。

圖2 SDE 萃取裝置

SDE 萃取裝置[22]見圖2。

2.2 SDE 萃取條件優化

影響SDE 萃取效率因素眾多，其中主要因素有萃取溶液的種類、水的添加量及蒸餾- 萃取時間等。試驗過程中通常會利用單因素試驗優化SDE 萃取參數，以得到最優的SDE 萃取條件。

2.2.1 萃取溶劑的選擇

SDE 是根據相似相溶原理，當揮發性成分或半揮發性成分在溶劑中的溶解度大于其在樣品中的溶解度時，樣品中的揮發性成分或半揮發性成分被萃取富集到溶劑中，故萃取溶劑的選擇要考慮溶劑的密度、極性、沸點等物理性質。常用的萃取溶劑有二氯甲烷、正戊烷、異戊烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯以及戊烷/二乙醚混合溶劑等。大部分相關研究多選擇二氯甲烷作為萃取溶劑，而對于某些特定類別的化合物，其他溶劑可能表現出更高的效率，但使用最廣泛的是二氯甲烷。趙健等人[23]利用SDE 法萃取黑豬肉中香氣物質時選擇二氯甲烷為萃取溶劑。

2.2.2 水添加量的選擇

SDE 萃取過程中，用于水蒸氣蒸餾的水添加量在一定程度上影響了萃取效果。在一定范圍內，當水添加量逐漸增多時，水蒸氣上升量增多，此時可攜帶更多的揮發性風味成分，增大了樣品與萃取溶劑接觸量，從而提高了萃取效率，使得測得的化合物總峰面積增多；而在此基礎上，繼續增加水添加量，使得樣品端蒸氣上升速度和冷凝速度加快，致使揮發性成分無法被溶劑充分萃取，從而化合物峰面積減少。師瑞等人[24]在萃取濃香葵花籽油香氣活性物質時選擇最佳的水添加量為200 mL。

2.2.3 萃取時間的選擇

對最佳萃取時間進行經驗性研究后發現，經過測試，最長達48 h 的SDE 可以從肥皂中提取出揮發性較低的化合物，如肉桂醇、2 - 苯乙醇等。當被萃取樣品中含有脂類物質時可能會大大增加萃取所需時間，而對于某些非脂肪類物質（如植物和非脂肪食物） 來說，1～2 h 就足夠了，但對于現在較復雜的樣品來說，萃取時間一般為2～4 h[25]，若時間過短，可能會導致回收率偏低，而時間過長，則有可能使樣品發生嚴重的熱反應而引入干擾物質。王蒙等人[26]在采用SDE 法分析豬肉燉煮過程產生的風味物質時，選取的萃取時間為3 h。

2.3 SDE 和HS-SPME 的比較

隨著精密分析儀器不斷迭代更新，為食品中揮發性與半揮發性風味成分的分析研究提供了越來越完善的技術和方法[27]。但單一的萃取方法并不能很全面地提取出食品中的所有風味物質，所以需要根據不同的樣品類型、研究目的和試驗條件來選擇合適的萃取方法，或者采用多種萃取方法，建議使用多種萃取技術。

SDE 將溶劑萃取與蒸汽蒸餾兩者相結合，利用少量溶劑就能萃取出大量的風味物質，操作簡便，定性定量分析效果很好[28]。而HS-SPME 則是將采樣、樣品凈化和預濃縮整合為一個試驗操作，無需溶劑就能簡單快速地萃取吸附揮發性風味物質，近幾年此項技術在食品烹飪過程中也有廣泛應用[29]。陳紅霞等人[30]采用HS-SPME 和SDE 這2 種方法提取“伊拉兔”腹部肌肉中的風味成分，并采用GC-MS進行分析鑒定，共檢測出47 種風味物質，而對比2 種方法提取相同樣品中的風味物質經GC-MS 檢驗結果明顯可看出，采用SDE 法能萃取到的揮發性物質更多，更適合用來萃取高沸點低揮發性物質，如烴類、酯類等；而HS-SPME 法處理樣品時間短暫、溫度低且操作步驟簡單，萃取到的揮發性物質幾乎沒有變化，更接近真實的揮發性風味，故更適合于檢測易揮發性物質。通常會同時采用SDE 與HS-SPME 這2 種方法去對同一個樣品中的風味成分進行萃取，將兩者的分析結果結合考慮可更全面地評價樣品中的風味物質。

3 HS-SPME 和SDE 技術在肉制品風味分析中的應用

3.1 鮮肉制品

生肉幾乎不產生風味物質，因此肉中風味生成的反應非常復雜，其中包括肉中各成分中的熱降解、脂質熱氧化、氨基酸與碳水化合物之間的反應，以及各種復雜反應之間的相互作用[27，31-34]。

鄒英子等人[35]通過HS-SPME 聯合GC-MS 對黑香豬后腿肉進行分析檢測，共檢出61 種揮發性風味物質，包括醛類、醇類、酮類、酯類、碳氫化合物及雜環化合物等。結果表明，黑香豬肉揮發性物質以醛類為主體，其相對含量約為69.989%；其次，分別為醇類、酮類、雜環化合物、碳氫化合物、酯類和其他化合物。根據其研究可知，對黑香豬肉揮發性風味物質貢獻較大的化合物主要有己醛、壬醛、（Z） - 2 - 庚烯醛、辛醛、庚醛、（E,E） - 2,4 - 癸二烯醛、1 - 辛烯- 3 - 醇和2 - 戊基呋喃。馬瑜璐等人[36]以新鮮豬肉為研究對象，采用HS-SPME 與GC-MS 聯用技術分別檢測豬肉在不同新鮮程度下揮發性成分的變化，想要建立一種可用于評價豬肉的新鮮度的檢測方法。結果表明，隨著新鮮程度的變化，豬肉樣中的揮發性成分會發生明顯的變化。在測定鮮肉中的風味成分時，多在萃取時對樣品進行加熱來模擬鮮肉烹飪的過程。

3.2 加工肉制品

3.2.1 煙熏肉、臘肉制品

煙熏是利用熏材不完全燃燒而產生的煙氣成分和熱量來加工肉制品一種常見方法，而其中最具有代表性的肉制品是臘肉。熏烤制品中的香氣成分來源有2 種[37]：一種是熏煙中的香氣成分，煙熏烤時被肉品吸附；另一種則是在熏烤時，肉中糖類、蛋白質及脂肪間的相互反應及其降解產物。臘肉風味的形成是一個極為復雜的過程，目前仍不知道是哪種或哪類化合物使其具有其獨特的風味[34]。

張寧等人[38]采用HS-SPME 法和SDE 法萃取“童家臘牛肉”樣品中的揮發性風味成分，共萃取分析出78 種風味物質，其中包括2 種烷烴化合物、26 種醛類化合物、25 種醇類化合物、8 種酮類化合物、3 種脂肪酸類化合物、4 種醚類化合物、1 種酯類化合物和9 種含硫含氮及雜環化合物。HS-SPME 法和SDE法分別萃取到了29 種和69 種揮發性風味成分，其中這2 種方法同時得到的風味成分有20 種。由其研究結果可看出，HS-SPME 對易揮發、低閾值的化合物萃取效果好，但萃取到的化合物比例并不能反映樣品頂空萃取時揮發性物質在頂空的比例，可能因為不同HS-SPME 萃取纖維不同的選擇性。相反，SDE 對半揮發性與閾值高的化合物萃取效果更好，但是SDE 的萃取條件為高溫長時間蒸煮，有可能使一些低沸點的物質揮發，形成一些非樣品成分的其他物質。因此，同時使用HS-SPME 法和SDE 法能夠更全面、客觀地分析肉制品中的風味成分。

3.2.2 烘烤肉制品

肉在烘烤制作過程中由于發生美拉德反應而使肉的色澤與氣味發生改變。誘人香味來源主要是羰基化合物與醛類物質，如丁二酮；金黃色與焦糖味的產生主要是發生了美拉德和焦糖化反應[39]。此外，加熱后的脂肪發生了氧化反應，也使肉制品在烘烤后產生了獨特的風味；氨基酸與糖類是烘烤肉制品形成誘人風味化合物的重要前體物質。

秦剛等人[40]用HS-SPME 法和SDE 法對“榮昌豬肉原料”樣品A 和3 個不同加工中心溫度點的樣品B，C，D 的揮發性風味物質進行萃取，其中HSSPME 萃取出樣品A 中的揮發性風味化合物126 種，樣品B 中的揮發性風味化合物116 種，樣品C 中的揮發性風味化合物131 種，樣品D 中揮發性風味化合物148 種；而SDE 萃取出樣品A，B，C，D 中的揮發性風味化合物分別為113 種、157 種、155 種、144 種。可見，不同萃取方式對風味化合物的提取效果存在一定差別，其中HS-SPME 法效率高，能夠一定程度上反映出樣品真實風味，SDE 法溶劑使用量小，萃取出的風味化合物較多，但長時間加熱會導致其他成分產生，制造出風味假象。劉源等人[41]應用HS-SPME-GC-MS 分析檢測了生鴨肉、烘烤鴨肉、水煮鴨脯肉、鴨腿肉樣品中的揮發性風味物質，并且 與WU Chung-may，Lesimlple S 等 人[42-43]采 用 的SDE 法所測得的揮發性風味物質相比較。結果表明，SDE 法采用溶劑萃取，對高沸點化合物提取效果好，但耗時較長且容易發生熱解；而HS-SPME 法中易揮發風味化合物較多，基本反映出了真實的鴨肉制品中揮發性風味成分。

3.2.3 醬鹵肉制品

醬鹵肉制品是將畜禽肉及其副產品，采用鹵煮等工藝的加工所制[44]。其具有濃厚的香味、獨特的風味和鮮亮的色澤，因此深受廣大消費者的喜愛。

王東杰[45]以豬后腿肉為原料制作醬肉，采用HSSPME-GC-MS 技術對其風味物質成分進行提取與鑒定，經GC-MS 分析檢測到8 類共65 種揮發性風味物質，主要風味化合物是醇、醛和烴類。對醬肉風味的形成起主要作用的是醇類和醛類化合物；對醬肉風味的呈現起協調平衡作用的是酯類化合物，如丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯和2 - 乙酰基呋喃等。此外，還比較了SDE 法和HS-SPME 法對醬肉中揮發性物質的提取效果，SDE 法檢測出風味物質61 種，HS-SPME 法檢測出風味物質65 種，降低醬肉腌制過程中的溫度，會產生一些低沸點的揮發性風味物質，采用HS-SPME 法比用SDE 法能更加客觀、真實地反映出醬肉中的風味揮發性物質。

3.2.4 油炸肉制品

油炸肉制品是肉制品在高溫油脂下進行熱加工的過程。油炸后的肉制品，表面發生脫水硬化并伴隨焦糖反應；蛋白質和脂質的降解伴隨著美拉德反應的發生進而產生芳香物質；脂質降解后便有大量揮發性化合物散發，從而使油脂肉制品產生出獨特的香氣與風味[39]。

孟祥忍等人[46]采用了HS-SPME-GC-MS 技術比較分析了傳統油炸、微波加熱和空氣炸鍋加工后對黃金豬排揮發性風味成分的影響。這3 種油炸方式都使黃金豬排生產了醛類化合物，其中在空氣炸鍋油炸的黃金豬排中檢測出了有烘烤香氣的2,3 - 二甲基吡嗪。根據文獻[46-48]中對不同工藝的油炸食物進行風味物質的萃取與分析比較，不僅可用來改善油炸肉制品的風味與口感，而且可用來控制肉制品中的不良風味與有害物質。

3.3 液體肉湯制品

目前，已報道的關于肉湯中風味成分分析方法有SDE-GC 或SDE-GC-MS 法[49]。袁華根等人[50]采用SDE 和HS-SPME 分別萃取了雞肉湯中的揮發性風味物質，再通過GC-MS 進行分析，共檢測出揮發性物質87 種。其中，HS-SPME 法檢測出55 種化合物，SDE 法鑒定出41 種化合物。對于液體肉湯制品中的揮發性風味物質來講，SDE 與HS-SPME 各有優缺點，可互補使用。但是低沸點、低閾值、易揮發、小分子量的化合物，對風味的貢獻更大，HS-SPME方便、快速、重復性好、靈敏度高，所以在萃取雞肉湯揮發性風味物質時HS-SPME 更勝一籌。

秦艷秀等人[51]在Lingxia Sun 等人[52]的基礎之上，采用了HS-SPME 法研究香葉在循環煮制過程中對豬里脊肉湯揮發性風味的影響，發現肉湯中共有45 種揮發性化合物，而且在香葉煮制1 次時，豬里脊肉湯中揮發性風味成分的種類和含量最多，其總量隨著煮制次數的增加而減少。隨著煮制次數的增加，來自于香葉中的醇、醚、酚和酯類化合物的含量明顯減少，而且是在煮制2 次后含量驟減，來自于豬肉中的醛、酮類化合物的含量沒有明顯變化。

4 結語

綜述了HS-SPME 技術、SDE 技術及兩者在肉制品風味分析中的應用。HS-SPME 和SDE 作為主要的風味分析方法，在肉制品風味分析方面應用已十分廣泛。由于HS-SPME 和SDE 技術各具優缺點，SDE法萃取時間較長，但能萃取到更多的揮發性化合物，適合對高沸點、低揮發性物質的分離；HS-SP-ME 法出峰少，但快速簡便、更接近真實揮發風味，適合檢測易揮發性的化合物。因此，建議對同一個樣品分別采用HS-SPME 法和SDE 法萃取其中的風味成分，更能客觀、全面、綜合地做出評價。

肉制品風味組成復雜，成分也較多，HS-SPME和SDE 技術聯合使用分析還需加強。隨著經濟的發展，人們對食品品質要求越來越高，HS-SPME 與SDE 技術聯用以綜合評價肉制品中的風味，為肉制品風味形成機理和產生途徑等方面的研究提供更多的依據。相信隨著研究的不斷深入，2 種技術將在肉制品新鮮度評價、品質預測及肉制品的不良風味等方面具有廣闊的應用前景。