三疣梭子蟹IAG基因結構及不同剪切體時空表達

蘭偉康，李 光，高保全，劉 萍，呂建建

（1.水產科學國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，海水養殖生物育種與可持續產出全國重點實驗室，山東 青島 266071；3.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266235）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬于甲殼綱十足目梭子蟹科梭子蟹屬[1]，其生長性狀呈現性二態型，且雌雄蟹的市場價格差異較大，實現單性養殖將有效提高養殖效益。甲殼動物性別決定類型復雜多樣且性別決定機制尚不明確，但普遍認為促雄性腺（androgenic gland，AG）分泌的胰島素樣促雄腺激素（insulin-like androgenic gland hormone，IAG）可以調控雄性的性別分化[2]。

促雄性腺為雄性甲殼動物特有的內分泌器官，首次發現于藍蟹（Callinectes sapidus）的輸精管附近[3]。通過在跳溝蝦（Orchestia gammarella）中的驗證，發現促雄性腺具有調節雄性初級和次級性別特征分化的功能[4]。向雌性普通卷甲蟲（Armadillidium νulgare）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中植入促雄性腺導致其發生雄性化[5,6]。此外，向雌性普通卷甲蟲中注射促雄性腺活性提取物質同樣可以導致其發生雄性化[7]，推測促雄性腺的某種分泌物在雄性甲殼動物的性別分化中發揮關鍵作用。后續發現該分泌物為胰島素樣促雄腺激素（IAG）[8]，并在普通卷甲蟲中獲得首個IAG基因的cDNA 序列[9]。隨后，在紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）中鑒定到了IAG基因，其編碼的氨基酸包括信號肽、B鏈、C 鏈和A 鏈[10]。之后IAG基因在包括羅氏沼蝦、斑節對蝦（Penaeus monodon）和擬穴青蟹（Scylla paramamosain）等十足目動物中得到鑒定和研究[11-21]。其中干擾羅氏沼蝦IAG基因的表達會抑制初級精母細胞的發生和雄性第二性征的生長[11]。在此基礎上，通過長期敲降IAG基因獲得了偽雌蝦，成功研發了羅氏沼蝦性別控制技術[15]，這是目前為止在養殖甲殼動物中建立性別控制技術并成功應用于產業的唯一案例。

目前有關三疣梭子蟹IAG（PtIAG）基因研究報道，分析了PtIAG基因在組織中的表達模式，并驗證了其參與胰島素家族的信號傳導系統，且受眼柄負調控[19]。但并未涉及PtIAG基因的結構以及啟動子序列等分析，且該基因在幼體時期的表達模式也尚不清楚。本研究通過解析PtIAG基因的結構，分析其上游區域核心啟動子的位置和潛在的轉錄因子結合位點。通過對PtIAG基因的轉錄本進行分析，發現其存在不同的剪切體，并系統分析其在幼體發育時期以及成體各組織中的表達模式，期望能為解析PtIAG基因在性別分化中的功能提供幫助，同時為建立三疣梭子蟹性控技術提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三疣梭子蟹，養殖于山東省昌邑海豐水產養殖有限責任公司，實驗材料包括不同發育時期的幼體和不同的成體組織，其中不同發育階段的幼體材料7 個（溞狀幼體4 個時期、大眼幼體和幼蟹2 個時期），不同成體組織材料9 個（腦、眼柄、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、精巢、輸精管和促雄性腺）。上述材料獲取后立即置于液氮保存，用于后續的RNA 和DNA提取。

1.2 基因組DNA、總RNA提取和cDNA合成

使用Steady Pure 通用型RNA 提取試劑盒（AG21017，艾科瑞生物）對單個幼體進行DNA/RNA 共提取，詳細操作步驟參考說明書。以幼體基因組DNA 為模板，使用三疣梭子蟹的性別標記[22]鑒定雌雄，隨后每個時期均制備雌性和雄性高質量RNA 混合池各一個（每個混合池包含3 只個體）。使用Trizol 提取組織樣品的總RNA，每種組織同樣制備雌性和雄性高質量RNA混合池各一個（每個混合池包含3 只個體）。制備好的RNA 材料使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒（TaKaRa，日本）進行cDNA 合成，利用核酸定量儀（NanoDrop 2000 Thermo Scientific）測定cDNA濃度。

1.3 甲殼動物IAG基因多序列比對和系統進化分析

為構建比較完整的甲殼類IAG基因系統進化樹，利用NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索甲殼動物IAG基因序列，并整理為氨基酸序列。使用MEGA 7 軟件（https://megasoftware.net）對氨基酸序列進行多重比對分析，并構建ML 系統進化樹，檢驗參數設置Bootstrap，檢驗重復頻率為500次，置信區間為95%，其他參數為默認值。

1.4 PtIAG基因的結構、可變剪切及啟動子分析

基于PtIAG基因mRNA 序列（KX168425.1）與本課題組組裝的三疣梭子蟹參考基因組，錨定PtIAG基因在基因組序列中的位置，進一步明確外顯子和內含子區域。利用Primer Premier 5.0軟件在PtIAG基因的外顯子和內含子上設計特異性引物（表1），以三疣梭子蟹雌雄組織混合cDNA 為模板，采用普通PCR 和瓊脂糖凝膠電泳檢測是否存在不同剪切體。截取PtIAG基因上游3 000 bp 的序列，利用在線軟件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/nnppHelp.html）預測核心啟動子和轉錄起始位點（TSS），利用在線軟件https://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi? dirDB=TF_8.3）和（https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/）預測轉錄因子識別位點。

表1 實驗所用的引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.5 PtIAG基因表達模式分析

根據已知的PtIAG基因和三疣梭子蟹管家基因β-actin，利用Primer Premier 5.0 軟件設計熒光定量特異性引物和內參引物（表1）。利用qPCR 技術對PtIAG基因進行相對表達量分析，每個樣品設置3 次平行，反應體系為：Template cDNA 1 μL，ROXReference Dye II 0.2 μL，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，RNase-free H2O 4 μL；程序參照TaKaRa TB Green?Premix Ex Taq?II 進行。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算[23]，利用SPSS19.0 軟件對數據進行方差分析，使用Origin軟件進行柱狀圖繪制。

2 結果

2.1 甲殼動物IAG基因多序列比對和系統進化

從NCBI 數據庫中檢索到29 種甲殼動物的IAG基因，其中包括4 種等足目動物和25 種十足目動物（表2）。氨基酸序列多重比對分析結果顯示，在所有物種中存在6 個保守的半胱氨酸殘基和1 個保守的絡氨酸殘基（圖1）。為分析PtIAG基因與其他甲殼動物IAG基因之間的進化關系，構建了ML 系統進化樹（圖2），結果表明IAG基因的進化分類與物種的進化分類高度一致，十足目與等足目動物的IAG 基因分別聚為一支。在十足目中，蝦類和蟹類的IAG基因又分別聚類在一起，PtIAG基因與其他蟹類IAG基因聚為1 支，表明親緣關系越近的物種其IAG基因的進化關系也相對較近。

圖1 甲殼動物IAG基因氨基酸序列多重比對Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of IAG genes in Crustaceans

圖2 IAG氨基酸序列ML系統進化樹Fig.2 ML phylogenetic tree of IAG amino acid sequences

表2 甲殼類物種的IAG基因Table 2 IAG genes in crustacean species

2.2 PtIAG基因序列結構及啟動子序列

通過錨定PtIAG基因在參考基因組上的位置，確定PtIAG基因的DNA 序列全長2 615 bp，包括4個外顯子和3 個內含子，遵循GT-AG 剪切規律。截取PtIAG基因上游3 000 bp 的序列進行啟動子序列分析，結果顯示轉錄起始位點位于翻譯起始密碼子（ATG）上游第2 834 核苷酸(A)；核心啟動子區域位于-2 710～-2 660 bp，A/T 含量為60%；在PtIAG基因啟動子區域存在多個轉錄因子作用元件，包括SOX-5、SOX-9、GATA-1、FOXJ2、DSX、AP-1、STAT等識別位點（圖3）。

圖3 PtIAG基因及其啟動子序列Fig.3 The gene and promoter sequence of PtIAG

2.3 PtIAG基因可變剪切分析

以雌雄混合組織cDNA 為模板，通過位于第1和第4外顯子區域的引物進行PCR擴增和電泳進行可變剪切分析。結果顯示電泳產物中存在兩條目的條帶，分別命名為PtIAG1和PtIAG2（圖4）。將兩種產物進行單克隆測序，序列比對發現PtIAG2比PtIAG1多254 bp 的插入，插入序列與內含子1 的序列相同，表明PtIAG2是通過內含子保留的可變剪切方式形成的（圖5）。

圖4 PCR產物Fig.4 PCR product

圖5 PtIAG基因結構Fig.5 Gene structure of PtIAG

2.4 PtIAG基因表達模式

表達模式分析結果顯示，在幼體發育時期，PtIAG基因在溞狀幼體時期表達量最高，且呈現明顯的雌雄差異。PtIAG1在溞狀幼體Ⅰ期的相對表達量雌雄差異顯著（P＜0.05），雄性的表達量是雌性的22.01 倍；PtIAG2在溞狀幼體Ⅰ期和溞狀幼體Ⅱ期的表達量雌雄差異顯著（P＜0.05），雄性的表達量分別是雌性的3.71倍和2.38倍（圖6）。由圖7可知，在成體組織中，PtIAG基因呈現多組織表達模式，其中在促雄性腺中表達量最高，尤其是PtIAG1，表達量為其余組織的千倍；此外，PtIAG基因在其他組織中的表達也存在雌雄差異的情況，比如PtIAG1在雌性眼柄和肝胰腺中的表達量分別是雄性的57.21 倍和3.53 倍，PtIAG2在雄性的腦、肝胰腺中的表達量分別是雌性的2.72倍、3.34倍。

圖6 PtIAG基因在不同幼體發育時期的相對表達量Fig.6 Relative expression levels of PtIAG gene at different developmental stages

圖7 PtIAG基因在不同組織的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of PtIAG gene in different tissues

3 討論

促雄性腺作為甲殼類動物特有的器官，在性別分化等多種生理過程中具有重要功能[24-26]，而這些生理過程主要由IAG基因進行調節[15,27,28]。有關甲殼動物IAG基因系統進化樹之前已有報道，當時可用于建樹的IAG基因較少，一般僅包含10 余個基因[17]。本研究用于建樹的甲殼動物IAG基因多達29個，數量顯著高于之前的研究，能夠更具體地了解不同物種IAG基因間的進化關系。氨基酸序列比對結果顯示這些基因均存在6 個保守的半胱氨酸殘基，該區域為形成二硫鍵的關鍵區域[14]，表明其在維持IAG基因的基本功能中具重要作用。

在一些甲殼動物中有關IAG基因結構的研究中，中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）和墨吉 明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）中IAG基因由5 個外顯子和4 個內含子構成[14,20,29,30]。本研究發現PtIAG基因由4 個外顯子和3 個內含子組成，這與擬穴青蟹和美洲龍紋鰲蝦（Procambarus νirginalis）中的IAG基因結構相同[17,31]。然而，PtIAG基因和SpIAG基因的長度更為接近，它們外顯子2 和外顯子3 的長度均相同，分別為133 bp和80 bp[17]。這一結果暗示著親緣關系相近的甲殼動物其IAG基因的結構也可能更為相似。

轉錄因子可以與基因啟動子區域上特定的位點相結合，從而調控基因的表達。在擬穴青蟹IAG基因的啟動子區域預測到SOX-5、AP-1 和STAT 等轉錄因子的結合位點，經過雙熒光素酶驗證，發現轉錄因子SOX-5、AP-1 和STAT 均可以增強IAG基因的啟動子活性[19]。其中SOX-5 是SOX轉錄因子家族的成員之一，該家族成員在性別決定與分化中具有重要功能[32]。本研究在PtIAG基因的啟動子區域同樣預測到了轉錄因子SOX-5、AP-1和STAT的結合位點，意味著這些轉錄因子有可能會調控PtIAG基因的表達。在三疣梭子蟹中敲降Dmrt家族的基因導致IAG基因的表達量顯著下調[33,34]，而Dmrt家族的成員在哺乳動物的性別決定及分化過程中通常作為轉錄因子發揮調控作用[35]。本研究在PtIAG基因的啟動子區域也預測到Dmrt基因家族的結合位點（DSX），表明三疣梭子蟹Dmrt家族可能通過與該位點結合，從而正向調控PtIAG基因的表達。

本研究通過對PtIAG基因進行可變剪切分析，發現其存在2 種轉錄本，其中PtIAG2為保留了內含子1 的可變剪切轉錄本。在其它甲殼動物中關于IAG基因可變剪切的研究已有報道，在中國明對蝦中的IAG基因存在相同類型可變剪切，其保留了內含子4[14]。本研究對PtIAG基因的2 種轉錄本進行了組織表達模式分析，其主要表達于雄性的促雄性腺。然而，2 種轉錄本在促雄性腺中的表達量存在極顯著差異，非內含子保留型的PtIAG1表達量較高，推測可能由其發揮主要功能。而在中國明對蝦中內含子保留型的可變剪切轉錄本起主導作用[14]。此外，本研究開展了2 種轉錄本在溞狀幼體至幼蟹共7 個發育時期的表達模式分析，發現PtIAG1和PtIAG2均顯現雄性高表達的趨勢，主要在溞狀幼體時期表達。且2個轉錄本在幼體發育時期的表達模式相似，但在組織中的表達模式不盡相同。比如PtIAG1在雌性的眼柄、肝胰腺和卵巢中表達量較高，而PtIAG2僅在雌性眼柄中有較高表達量，暗示了2種轉錄本可能存在某些功能上的差異。整體而言，PtIAG1和PtIAG2無論在幼體發育時期還是成體時期，均顯現明顯的雄性偏向表達趨勢，表明其在雄性分化及維持中發揮了重要作用。

4 結論

本研究明確了PtIAG基因的結構，其由4 個外顯子和3 個內含子組成；預測了其啟動子區域核心順式作用元件，發現其啟動子區域存在許多與性別分化相關的轉錄因子結合位點，包括DSX 和SOX-5等；發現PtIAG基因存在2 種不同轉錄本，其中非內含子保留型的轉錄本發揮主導作用，并且兩種轉錄本可能存在某些功能上的差異；在溞狀幼體至幼蟹共7 個發育時期的表達模式分析中發現，在幼體發育時期，PtIAG基因主要在溞狀幼體Ⅰ期的雄蟹中表達；在成體組織中，PtIAG基因主要在促雄性腺中表達。綜上所述，PtIAG在三疣梭子蟹雄性分化及維持中具有重要作用。