不同鹽度下雙酚F對海洋青鳉胚胎的毒性效應

陳祖椿，張建樺，陳月碧，張 寧，郭昱嵩，王中鐸，董忠典,2

（1.廣東海洋大學水產學院/南海水產經濟動物增養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088）

鹽度是水生生物生存的重要影響因素，水體鹽度可能會影響污染物的理化性質或生物富集污染物的能力[10]，因而環境污染物在不同鹽度水體中對生物的毒性效應可能不同。目前，雙酚類物質的水生生態風險研究主要集中在BPA 對斑馬魚等淡水物種的毒性方面[11-12]，缺乏關于BPA 類似物BPF 等對廣鹽性魚類的毒性研究。海洋青鳉（Oryzias melastigma）是一種鹽度適應性強的新興海洋生態毒理學模式生物[13]，本研究在鹽度15（模擬半咸水環境）和30（模擬海水環境）條件下，將海洋青鳉胚胎暴露于不同濃度BPF，分析BPF對胚胎的毒性效應，為科學評估BPF對海洋環境的生態風險提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗生物

海洋青鳉親本由廣東海洋大學南海水產經濟動物增養殖重點實驗室飼養培育，培養的光暗周期為14 h/10 h，水溫（26±1）℃。實驗用胚胎均產自同一批性成熟、健康無病的海洋青鳉親本。每日10:00用撈網撈起抱卵雌魚，用手指輕推，剝離并收集受精卵，操作過程中避免雌魚損傷。

1.2 雙酚F胚胎暴露實驗

挑選卵徑基本一致、形態正常的胚胎進行暴露實驗。暴露鹽度設為15和30，每個鹽度下BPF質量濃度分別為0、1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L。BPF 助溶劑為二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），所有組DMSO 體積分數為0.01%[14]。每個處理設置4 個平行，每個平行中放置10 枚受精4 h左右的胚胎。當日產胚胎于體式顯微鏡下人工剔除未受精胚胎和死亡胚胎，隨機置于12孔板的孔洞中，10枚/孔，將不同濃度暴露液轉移至相應孔洞中。孔板置于（28±1）℃恒溫、光照培養箱內培養15 d，每24 h 更換1 次暴露液，照度1 745 lx，光暗周期為14 h/10 h。

每日在顯微鏡下觀察并記錄胚胎孵化和死亡情況，統計畸形數量和畸形類型，及時清除死亡胚胎[15]。在胚胎發育過程中陸續有仔魚孵化出膜，每日更換暴露液時將各組孵化仔魚收集到新24 孔板中，用與該處理組相同的暴露液處理仔魚，暴露液每24 h更換1次。實驗過程中及時發現和清除死亡仔魚，計算仔魚出膜后7 d內的存活率。

1.3 胚胎心跳速率檢測

在實驗6 d（受精后144 h）和9 d（受精后216 h）時統計胚胎心跳速率（下稱“心率”）。將裝有胚胎的孔板置于體式顯微鏡下觀察胚胎心臟跳動，用顯微鏡配套觀察軟件錄制成時長1 min 的AⅤI 視頻文件，觀察視頻中的心跳，用計數器計數。每個平行選取5 枚心臟跳動明顯的胚胎進行計數，計算各濃度處理組胚胎心率。

1.4 雙酚F暴露下仔魚行為分析

在胚胎孵化出仔魚后，在出膜后48 h 用小型魚類行為學分析系統（ⅤiewPoint，法國）分析其行為。將待測仔魚放入新的24 孔板中，每個孔洞僅1 尾仔魚。先依次在軟件上對每個孔根據其處理組進行命名，再設定分析程序，分析時長為15 min，記錄其游動總距離，軟件每3 min 輸出1 次數據，其中前3 min 為仔魚適應階段，不計入結果。在測定過程中保持光照穩定，避免噪音等其他外界環境因素干擾。每個處理組測定20尾仔魚的行為數據。

1.5 數據處理

使用Excel 2018統計數據，數據以平均值±標準差表示，使用SPSS Statistics 26、GraphPad Prism9 軟件進行分析和繪圖。用雙因素方差分析（Two-way ANOⅤA）檢驗鹽度和BPF對海洋青鳉胚胎的影響。

2 結果

2.1 不同鹽度下雙酚F 對海洋青鳉胚胎畸形率、孵化率和死亡率的影響

本研究中產生部分畸形胚胎，但數量較少。15鹽度下1 μg/L 處理組畸形率為13.3% ± 4.5%，包括4 個卵黃囊水腫和1 個卵膜破裂的胚胎；100 μg/L 處理組畸形率為5.0%±5.8%，包括2 個卵黃囊水腫的胚胎。在30 鹽度下10 μg/L 處理組的畸形率為2.8% ± 5.6%；10 mg/L 處理組的畸形率為3.6% ±7.2%。兩個處理組均發現1 個卵黃囊水腫的胚胎。其余處理組均未發現畸形胚胎。

曾經有人指出，課堂教學是一個向著未知方向不斷深入的探索歷程，意外而美麗的風景隨時都可能出現在路邊，因此我們的教學不能循著固定的路徑來進行，否則課堂將缺乏意外的生成，也就無法激起學生創造的熱情.所以，教師應該意識到高中化學的教學不應該是一個預約的過程，而應該是一個學生與教師、學生與教材碰撞和溝通的過程，只有將這一思想貫徹在化學教學中，學生才能看到那些意外而美麗的風景.

表1可見，在15鹽度下，隨著BPF暴露濃度的增加，海洋青鳉胚胎的孵化率雖與對照組無顯著差異，但有下降趨勢。在30鹽度下，隨著BPF暴露濃度的增加，胚胎孵化率呈降低趨勢，100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L 處理組顯著低于對照組（P＜0.05），其中10 mg/L處理組顯著低于10 μg/L處理組（P＜0.05）。對比相同BPF 濃度下不同鹽度的處理組，當BPF 在100 μg/L 和10 mg/L 時，30 鹽度下的孵化率顯著低于15鹽度，其余BPF處理濃度下雖無顯著差異，但也表現出30鹽度下孵化率低于15鹽度的趨勢。15鹽度下10 μg/L處理組較1 μg/L處理組出現了一定的孵化率回升趨勢。在30 鹽度下，10 μg/L 處理組較1 μg/L處理組也顯示出孵化率回升趨勢，10 μg/L BPF處理組的孵化率平均值均高于其他BPF處理組。

表1 各處理組海洋青鳉胚胎孵化率和死亡率Table 1 Hatching rate and mortality rate of marine medaka in each treatment group

15 鹽度下，BPF 各濃度的胚胎死亡率與對照組均無顯著性差異。30 鹽度下，10 mg/L 處理組的死亡率平均值與對照組差異相對較大，在30鹽度下高濃度的BPF 具有明顯的胚胎致死效應。在相同的BPF 處理濃度下，30 鹽度組的死亡率平均值均高于15鹽度組，在BPF濃度為10 mg/L時，30鹽度組的死亡率顯著高于15鹽度組（P＜0.05）。

2.2 不同鹽度下雙酚F對海洋青鳉胚胎心率的影響

在BPF 處理6 d 時，15 鹽度下的1 mg/L 處理組心率最高，顯著高于對照組（DMSO 處理組）和其他濃度處理組（P＜0.05）；30 鹽度下隨著BPF 濃度的升高，海洋青鳉心率有降低趨勢，10 mg/L 處理組心率最低，顯著低于對照組和其他濃度處理組，1 μg/L處理組心率平均值最高，1 mg/L 處理組心率顯著低于對照組和1 μg/L 處理組，10 μg/L 處理組心率也顯著低于1 μg/L 處理組（P＜0.05）。當BPF 處理濃度在1 μg/L 時，30 鹽度組的心率顯著高于15 鹽度組（P＜0.001）。而當BPF 處理濃度在1 mg/L 及以上時，30 鹽度組的心率顯著低于15 鹽度組（P＜0.001），且BPF處理濃度越高，心率就越低（表2）。

表2 6 d和9 d時各處理組海洋青鳉胚胎心率Table 2 Heart rate of marine medaka embryos in each treatment group on day 6 and 9 次/min

在BPF處理9 d時，15鹽度下10 mg/L處理組心率最低，顯著低于對照組和其他濃度處理組，1 mg/L處理組心率顯著低于對照組（P＜0.05）。當BPF 處理濃度在1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L 和1 mg/L 時，30鹽度組的心率顯著低于15 鹽度組（P＜0.001）。在對照組，30 鹽度時的心率同樣顯著低于15 鹽度時（P＜0.000 1）。而當BPF處理濃度在1 mg/L及以上時，無論何種鹽度，心率均較低（表2）。

2.3 不同鹽度下雙酚F 對海洋青鳉仔魚出膜后7 d內存活率的影響

仔魚出膜7 d 內死亡數量較少，各濃度下基本無死亡。15 鹽度下，100 μg/L 處理組死亡1 尾，死亡率為2.5%±5.0%，10 mg/L 處理組死亡2 尾，死亡率達到8.6%±10.2%。30鹽度下，DMSO和10 μg/L處理組均有1 尾死亡，死亡率分別為2.5% ± 5.0%、3.1% ± 6.3%。1 μg/L 和1 mg/L 處理組均有2 尾死亡，死亡率為7.7%±9.0%。

2.4 不同鹽度下雙酚F對海洋青鳉仔魚行為的影響

各處理組海洋青鳉仔魚運動平均總距離呈現一定波動，但在統計學上無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。在DMSO、1 μg/L、10 μg/L 處理組中，隨BPF 濃度上升，出膜48 h 的仔魚在12 min 內運動總距離（由于10 mg/L 處理組出膜數量較少，故不參與行為學分析）有增加趨勢。在相同濃度下，鹽度30 的仔魚運動總距離平均值均高于鹽度15。

圖1 各處理組海洋青鳉仔魚運動總距離Fig.1 Total distance of movement of fries in each treatment group

3 討論

3.1 不同鹽度下雙酚F 對海洋青鳉胚胎畸形率、孵化率和死亡率的影響

畸形率、孵化率和死亡率是評價化學物質對魚類發育毒性和安全性的重要指標。有研究指出，BPA 對斑馬魚胚胎的畸形率隨BPA 濃度的升高而增大[16]；BPF 會對斑馬魚早期生命階段的內分泌產生干擾，BPF 暴露下產生的畸形率會隨BPF 濃度的升高而增大[17]；在對日本青鳉（Oryzias latipes）的研究中也發現，BPA 在環境相關濃度下會引起青鳉的短暫性胚胎畸形[18]。本實驗中產生的畸形胚胎數量較少，在15 鹽度下畸形總數和畸形率略多于30 鹽度，畸形類型普遍為卵黃囊水腫，但未得出BPF 濃度和鹽度對海洋青鳉胚胎的畸形效應。

在孵化率方面，任文娟等[19]研究顯示，斑馬魚孵化率隨著BPF 暴露濃度的升高而呈現階梯式下降。黃乾生等[20]在探究鹽度影響PFOS 對海洋青鳉的毒性時發現，在30 鹽度下，對照組、1 mg/L、4 mg/L 和16 mg/L PFOS暴露組的孵化率均低于5鹽度條件下的同濃度組孵化率，本研究有類似結果，較高的BPF暴露濃度對海洋青鳉胚胎孵化率也產生一定影響；鹽度對孵化率也存在影響，各處理組30鹽度下孵化率均有低于15 鹽度的趨勢，說明在較高鹽度環境下，污染物對海洋青鳉胚胎的孵化有更強的抑制作用。胚胎的成功孵化依賴于孵化酶的正常表達。高卵殼裂解酶(High choriolytic enzyme，HCE)和低卵殼裂解酶(Low choriolytic enzyme，LCE) 等兩種重要孵化酶的協同作用可催化絨毛膜的降解，促進胚胎孵化[21]。有機污染物PFOS會造成HCE 和LCE的mRNA 表達異常，影響其活性[22]。海洋青鳉暴露于0.2和0.8 mg/L的四氯雙酚A（TCBPA）后，孵化酶HCE 和LCE 的表達水平均受顯著抑制[23]。本研究的高鹽度對海洋青鳉胚胎孵化率的影響可能是高鹽度導致HCE和LCE表達水平受抑制所致。

在非適宜鹽度環境下，污染物對生物的毒性往往增強。陸彬[24]在研究鹽度及兩種手性擬除蟲菊酯對斑馬魚胚胎毒性的影響時發現，順式聯苯菊酯外消旋體（cis-BF）對斑馬魚胚胎的急性毒性隨水體鹽度的升高而增強，高鹽度增強了cis-BF 的毒性和斑馬魚胚胎對cis-BF的富集作用。本研究亦有類似結果，在鹽度15 條件下，BPF 暴露濃度的上升并未顯著提升海洋青鳉的死亡率，但在30 鹽度條件下，10 mg/L BPF濃度暴露下的存活率比對照組出現較大程度下降，且顯著低于15鹽度下同BPF濃度暴露組，這表明高鹽度使BPF對海洋青鳉胚胎的毒性增強。

3.2 不同鹽度下雙酚F對海洋青鳉胚胎心跳速率的影響

胚胎心率可判斷魚卵胚胎在毒性環境下的毒性效應，也是評價和分析毒性物質的重要指標之一[25]。Moreman[26]在研究雙酚類化學品對斑馬魚的分子機制和健康影響時發現，BPA、BPF、雙酚S和雙酚AF 均優先靶向作用于斑馬魚的心臟，較高濃度BPA（2 500 μg/ L）暴露會誘導心房、心室不穩定的搏動配給，使心率降低；BPA 在暴露濃度為150 μg/L時，會導致與離子轉運和細胞間通訊相關的許多基因下調，這些功能對于維持規律的心率至關重要。Mu 等[27]研究發現，斑馬魚胚胎暴露于0.000 5、0.5、5.0 mg/L的BPF時，會導致心率下降；通過轉錄組學分析，心臟發育相關基因（klf2a）在暴露于0.000 5或0.5 mg/L BPF 后下調。本研究中，BPF 對海洋青鳉胚胎心率也有類似影響，處理6 d 時的30 鹽度組和處理9 d 時的15 鹽度組，高濃度BPF（≥1 mg/L）也會導致心率下降，表明一定濃度的BPF 暴露對海洋青鳉胚胎心臟發育具有毒性效應，影響其心率。

鹽度對硬骨魚的心臟存在一定影響。海洋青鳉胚胎出膜前后（孵化后8、11 d）的平均心率隨著鹽度的增加而顯著增加[28]，而在鹽度30、15、5 條件下，隨著鹽度的降低，全氟辛烷磺酸（PFOS）顯著上調了海洋青鳉胚胎中PPARα、PPARβ、COX-2和SMYD1等心臟發育相關基因的表達[20]。但本研究中，相對于鹽度15，鹽度30 條件下海洋青鳉心率往往較低。這可能是由不同鹽度下BPF 對心臟發育相關基因表達的影響不同所致[29-30]。此外，在部分低BPF 濃度（1 μg/L）處理6 d 時，鹽度30 心率比15 有升高趨勢，這是由于在6 d 及以前，是機體器官的形成時期[31]，較高的心率有利于心臟泵血，維持滲透壓平衡、為器官形成提供保障[32]。

3.3 不同鹽度下雙酚F 對海洋青鳉仔魚出膜后7 d內存活率和仔魚行為的影響

魚類仔魚出膜后7 d 內存活率是評估污染物對其幼體毒性的重要參數。任文娟等[33]研究發現，BPF 對斑馬魚成魚和胚胎有高度相近的致死率，成魚死亡率隨濃度升高而升高。本實驗中仔魚死亡數和死亡率較小，未發現濃度和鹽度對仔魚死亡率的顯著影響，可能與海洋青鳉是廣鹽性魚類，出膜后各種調節機制日趨完善，對外界環境適應性相對較強有關[34]。

污染物對仔魚行為往往有一定影響，Mu等[35]研究表明，斑馬魚胚胎暴露于一定濃度的BPF中，會抑制自發運動。顧杰等[36]在探索BPF對斑馬魚的早期神經毒性時發現，BPF暴露會顯著抑制斑馬魚仔魚的運動距離和平均速度，對斑馬魚仔魚的運動行為能力產生影響。陳將飛[37]在研究TBBPA對斑馬魚的毒性效應時發現，低劑量TBBPA暴露可引起受精后5 d仔魚運動速度顯著上調。本研究中并未發現仔魚總運動距離與BPF濃度的明顯線性關系，且在各濃度BPF處理組中仔魚平均總運動距離多高于對照組，表明雙酚類物質對不同魚類的行為影響存在差異。

3.4 鹽度和BPF對海洋青鳉的復合效應

不同鹽度下生物體對化學物質蓄積能力不同，鹽度的增加導致部分污染物的生物蓄積量變化。海洋青鳉卵內PFOS 濃度均隨鹽度升高呈上升趨勢[20]，而日本青鳉體內五氯苯酚累積量隨著鹽度的增加而減少[38]。Borrirukwisitsak 等[39]在探究鹽度等對BPA辛醇-水分配系數（Kow）的影響時發現，隨著鹽度的增加，25 ℃時BPA 的Kow 對數從3.44 增加到3.55，他們由此認為海洋環境中的BPA 可能有更強的生物蓄積性。Onaizi[40]在探究酚類廢水處理時發現，鹽的存在嚴重降低了BPA 的降解率和去除率。因此，鹽度和BPF 對生物的毒性存在復合作用。總之，鹽度對污染物生物累積的影響因物種和污染物而異，結合本研究結果，推測鹽度的增加會導致BPF在海洋青鳉胚胎內蓄積量增加。

鹽度在魚類胚胎發育過程中起重要作用，鹽度過高或過低均造成受精卵卵膜滲透壓改變[41-42]。鈉鉀泵Na+/K+-ATPase（NKP）調節是維持細胞滲透壓穩態的重要機制，有假說認為，對于非洄游廣鹽性硬骨魚，NKP 活性在其最適宜的鹽度環境中表達量最低[43]。萬磊[10]在探究海洋青鳉魚最適的鹽度環境時發現，海洋青鳉NKP基因轉錄水平在15鹽度條件下低于30鹽度，即相對于30的鹽度而言，鹽度15可能是海洋青鳉更適宜的鹽度環境。高鹽度需要利用ATP調節滲透壓，進而減少用于解毒或消除異生物質的能源[44]。結合本研究結果，雖然海洋青鳉是廣鹽性魚類，在高鹽度下需要消耗部分能量維持細胞滲透壓穩態，導致海洋青鳉胚胎用于消除BPF影響的能源減少，從而增強了BPF對海洋青鳉胚胎的毒性效應。

4 結論

BPF對海洋青鳉胚胎有一定的毒性效應，對其孵化率、死亡率、心率均有顯著影響。鹽度對BPF的毒性有復合效應，不同鹽度（30和15）下，BPF對海洋青鳉胚胎心率、孵化率和死亡率的影響存在顯著差異，高濃度BPF在鹽度30條件下對胚胎有明顯的致死效應，說明鹽度影響了海洋青鳉胚胎對BPF的敏感性。