臭氧污染和EDU噴施對小麥葉際細菌群落的影響

蘇熠，程誠，王琪，劉園園，徐彥森，馮兆忠

（南京信息工程大學應用氣象學院，南京 210044）

植物的地上部分被大量微生物定殖，Partida-Martínez 等[1]認為不存在沒有微生物的植物。據Vorholt[2]估計，全球葉表面積約6.4×108km2，能定殖1×1026個細菌細胞，每平方米約1×1016~1×1018個細菌細胞，數量遠超植物本身細胞數量。已有的研究表明，植物葉際細菌群落對植物生長與健康及生態系統功能有重要作用。這些細菌能通過產生吲哚乙酸、鐵載體等促生物質來促進植物對養分的吸收，提高植物生物量；通過產生抗氧化酶、抗生素等物質來抑制病原菌對植物的侵襲，提高植物對多種環境脅迫的適應性；甚至部分細菌還具有降解污染物的功能[3-5]。

臭氧（O3）作為最具植物毒性的空氣污染物之一，其環境效應已經成為公眾密切關注的問題。盡管1995—2014 年間歐洲和北美洲的大部分地區地表O3濃度有所下降，但是近年來東亞地區地表O3濃度仍呈現出普遍上升趨勢，尤其是中國和印度[6-7]。O3濃度升高會對植物造成一系列損害，包括葉片肉眼可見受損、光合作用受抑制、產量和品質下降等[8-9]，O3已成為全球作物生產和食品安全的主要威脅之一[10]。小麥較其他農作物對O3濃度升高更為敏感[11]。2010—2012 年間O3污染對印度和中國的小麥產量影響最嚴重，印度北部和中國西北部的大片地區產量損失超過15%[12]。Feng等[11]基于最新的O3劑量反應規律，發現O3污染使中國小麥產量下降了28.2%~36.9%。長三角作為農作物主產區之一，也是我國O3主要污染區之一。2014—2019 年間O3濃度升高致使該區域冬小麥年減產20.4%，年經濟損失約7億美元[13]。

O3主要通過引起氧化應激反應對農作物產生損害[14]；植物通過氣孔將O3吸收到質外體內后，O3迅速降解并產生活性氧，進而干擾各種生理和酶促過程[15]。迄今，科研工作者已從生理、產量與品質等方面系統研究了O3濃度升高對小麥的影響[16]，但是鮮有研究關注O3濃度升高對小麥葉際微生物群落的影響。

亞乙基二脲（N-[2-（2-氧代-1-咪唑烷基）乙基]-N'-苯基脲，EDU）作為一種抗O3劑被廣泛用于評價O3濃度升高對植被的影響[17]和篩選O3抗性品種[18-19]。EDU 常以葉面噴施、莖稈注射或土壤淋濕的方式施用于植物，其能有效增加植物光合色素含量、提高光合能力、改變抗氧化酶活性和抗氧化劑的濃度[20-24]?；贛eta 分析，Feng 等[25]發現，與對照相比，EDU 使O3引起的小麥葉片可見損傷降低76%，光合速率提高8%，地上生物量和小麥產量分別提高7%和15%。盡管大量研究表明EDU 可以保護植物免受O3傷害并抑制植物過早衰老，但其保護機制尚不清楚[26]。目前關于EDU 的作用機制主要包括：（1）可能通過降低氣孔導度來降低O3氣孔吸收通量[27]；（2）通過增加酶促或非酶促抗氧化劑去除葉片活性氧[20]；（3）作為氮肥[28]；（4）作為異生物質，破壞激素穩態[26]。然而EDU 對農作物葉際微生物群落的調控研究尚未見報道。

植物根系微生物組相關研究表明植物會召集“脅迫微生物”來應對各種生物和非生物脅迫，且這種選擇性的富集受植物代謝和免疫相關性狀的差異驅動[29-30]。以上發現表明小麥也可能通過召集葉際“脅迫微生物”來應對O3脅迫。本研究利用完全開放式O3熏蒸系統（O3-FACE）對長三角地區廣泛種植的小麥品種（農麥88）進行O3熏蒸，同時配以EDU 葉面噴施處理，于灌漿后期采集小麥葉片樣品，利用細菌16S rRNA 基因高通量測序技術解析O3濃度升高和EDU 噴施處理對小麥葉際細菌群落結構與多樣性的影響。本研究假設：（1）O3熏蒸會改變小麥葉際細菌群落alpha和beta多樣性；（2）葉面噴施EDU也改變了葉際細菌群落alpha 和beta 多樣性，且提高葉際有益菌群豐度可能是其增強小麥O3耐受性的作用方式。預期結果能進一步豐富小麥適應O3濃度升高及EDU緩解小麥O3脅迫的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

本試驗于2020年11月至2021年5月在江蘇省揚州市江都區的南京信息工程大學揚州綠色農業研究與示范基地（32°44'N，119°25'E）開展，該試驗區地處長江中下游平原，屬于典型的亞熱帶濕潤氣候。2020 年，該地區年均氣溫和年均降水總量分別為16.6 ℃和1 337.8 mm，年日照時數為1 455.4 h。該地區長期實行稻麥輪作，屬于典型的農田生態系統[31]。0~15 cm 根層土壤的基本理化性質為pH 6.8、有機質2.06%、總氮1.1 g·kg-1、速效鉀61 mg·kg-1、有效態磷30 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗以農麥88 作為供試植物，于2020 年11 月播種，2021年3月1日開始利用O3-FACE 進行兩個O3濃度的熏蒸處理，包括環境O3濃度（濃度約為40.9 mg·L-1·h-1，A 處理）和1.5 倍環境O3濃度[濃度為（59.9±2.5）mg·L-1·h-1，E 處理]，每個O3濃度設置4 個FACE圈重復，每個FACE 圈為直徑14 m 的正八邊形，各圈之間間隔大于50 m，以避免相互干擾。O3發生器（HY003，濟南創成科技有限公司）產生的O3與空氣混合后通過置于冠層上方的布氣管釋放到FACE 圈內，并利用自動化控制中心對FACE 圈內O3濃度進行實時檢測，確保FACE 圈內O3濃度維持在正常范圍內。晴朗天氣每日熏蒸10 h（8：00—18：00），陰雨天則停止熏蒸，實際熏蒸49 d，O3濃度控制偏差率基本在15%以內（圖1）。每個FACE圈設有3 m×3 m的亞區，熏蒸10 d 后開始對小麥進行葉面噴施450 mg·L-1EDU[32]，以澆等量的水作為對照（水）處理，在噴施時，每株小麥的葉片能掛住溶液即可。每隔10 d 葉面噴施EDU溶液一次，如果噴施后的第二天遇上雨天則需要進行補噴，試驗期間共噴施EDU 6次。

圖1 O3-FACE平臺10 h（8：00—18：00）O3濃度平均值的動態變化Figure 1 Variations of mean O3 concentrations in 10 h（8：00—18：00）

各圈播種時間、種植密度和日常管理均與周圍大田相同。其中，肥料按氮肥220 kg·hm-2，磷肥（P2O5）和鉀肥（K2O）均75 kg·hm-2的標準分別施入各圈，氮肥為尿素，磷肥和鉀肥均為復合肥。

1.3 葉片樣品收集與葉際微生物提取

于2021 年5 月13 日（即小麥灌漿期）采集葉片樣品，用卷尺測定株高。雙手用75%酒精消毒后，用表面消毒過的剪刀取各FACE 圈內小麥倒二葉（每個FACE 圈內每個小麥品種各取兩穴，20 株左右），每穴葉片樣品混合后放入無菌的牛皮紙袋帶回實驗室備用。參考Wang等[33]的方法收集葉際微生物，取5片小麥葉片，浸入裝有300 mL無菌PBS緩沖液（0.02 mmol·L-1，pH 7.0，0.1%Tween 80）的1 L 三角瓶中，搖床28 ℃振蕩1 h后，再超聲振蕩20 min。利用孔徑為0.22 μm的濾膜抽真空富集葉際微生物，然后置于-80 ℃備用。按Fast DNA spin 試劑盒（MP Biomedicals LLC，美國）的使用說明書提取葉際微生物基因組總DNA，DNA經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，采用NanoDrop?2000分光光度計（Thermo Scientific，美國）測定其濃度。

1.4 PCR擴增及高通量測序

利用引物799R/1993F 對葉際細菌16S rRNA 基因序列進行擴增[34]。每個引物上都連接了12 bp的獨特的barcode 以區分不同樣品。PCR 在50 μL 擴增體系中進行，包括25 μL PrimeSTAR Max Premix（2×）（TAKARA，大連）、正反向引物（Invitrogen，上海）各0.5 μL、1 μL DNA 模板（含DNA 10 ng）和23 μL 雙蒸水。PCR 擴增程序：95 ℃預變性2 min 后，擴增20 個循環（95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸3 min[35]。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，使用AxyPre PCR 清潔系統（Axygen，杭州）對其進行純化。將純化后的PCR 產物等摩爾質量混合后，利用Illumina MiSeq 測序儀進行高通量測序。原始數據已于NCBI數據庫獲得登錄號（SRP375487）。

1.5 數據統計

參照Wang等[36]的方法，利用i-Sanger（http：//www.i-sanger.com）云數據分析平臺處理高通量測序獲得的細菌16S rRNA 基因序列。原始數據質控處理后，利用UCLST 將高質量序列聚類成OTU（相似性不低于97%）[37]。利用RDP 數據對每個OTU 進行鑒定，置信閾值為0.80[38]。為避免不同測序深度對結果分析產生干擾，從每份樣本中隨機抽取15 000條序列進行后續alpha和beta多樣性分析。

以香農指數（Shannon）[39]和辛普森指數（Simp?son）[40]來表征細菌群落的alpha 多樣性?；贐ray-Curtis 距離計算方法，采用非度量多維尺度（NMDS）和主坐標分析（PCoA）對不同處理樣品細菌群落結構進行聚類分析。利用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗檢查數據的正態分布和方差齊性后，用JMP 10.0軟件中的雙因素方差分析（ANOVA）來解析O3、EDU 及其相互作用對株高、葉際細菌群落alpha 多樣性及優勢種群相對豐度的影響。利用Tukey-Kramer HSD 檢驗不同處理間的顯著差異性[31]。

2 結果與分析

2.1 對小麥生長的影響

如圖2所示，在對照處理條件下，E處理顯著降低了小麥株高（較A處理降低了9.4%）。A處理條件下，噴施EDU對小麥株高沒有產生顯著影響。E處理條件下，噴施EDU 使小麥株高提高了11.0%（P<0.05）。O3和EDU的交互作用對小麥株高沒有產生顯著影響。

圖2 O3濃度升高和EDU葉面噴施對灌漿期小麥株高的影響Figure 2 Effects of O3 and EDU leaf spraying on plant height

2.2 對小麥葉際細菌群落alpha多樣性的影響

如表1 所示，不同處理樣品細菌群落的覆蓋度（在序列97%的相似度的水平上）均高于0.97，表明本試驗的測序深度包含了大多數細菌群落，能滿足后續序列分析的需要。不同處理條件下Shannon 指數和Simpson 指數沒有發生顯著變化，說明O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用均對小麥葉際細菌群落alpha多樣性沒有顯著影響。

表1 不同試驗處理條件下小麥葉際細菌群落alpha多樣性指數Table 1 Alpha-diversity indices of phyllosphere bacterial community of NM88 under different treatments

2.3 對小麥葉際細菌群落結構的影響

基于不同樣品間的Braye-Curtis 相似距離計算，采用NMDS和PCoA 對不同樣品葉際細菌群落進行聚類分析。結果發現在NMDS圖和PCoA圖上A-水、AEDU、E-水、E-EDU 4 種處理的試驗樣品分別聚成了不同的圈（圖3），這表明O3濃度升高和EDU噴施均改變了小麥葉際細菌群落結構。

圖3 不同處理條件下細菌群落的非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標分析（PCoA）Figure 3 Nonmetric multidimensional scaling（NMDS）analysis and principal coordinates analysis（PCoA）plot depicts the Bray–Curtis distance of bacterial communities in different treatments

2.4 對小麥葉際細菌優勢菌門的影響

門水平上，小麥葉際細菌優勢菌門為Proteobac?teria（84.7%~94.8%）、Bacteroidota（1.3%~13.1%）、Fir?micutes（1.6%~5.4%）。其中，Proteobacteria 中最優勢綱為Gammaproteobacteria，占總細菌群落的75.2%~94.3%。如圖4所示，水處理條件下，O3濃度升高提高了Gammaproteobacteria 和Alphaproteobacteria 的相對豐度，但是未達到顯著水平。EDU 處理條件下，O3濃度升高使葉際Gammaproteobacteria 的相對豐度降低了14.3%（P<0.05），同時顯著提高了Alphaproteobacte?ria 和Bacteroidetes 的相對豐度（與對照相比分別提高了1.4倍和8.7倍）。

圖4 O3濃度升高、EDU噴施及其交互作用對小麥葉際優勢細菌門相對豐度的影響Figure 4 Effects of O3，EDU and their interaction on the relative abundance of dominant bacterial phyla inhabiting phyllosphere and endosphere of rice leaves

A 處理中，EDU 噴施使Gammaproteobacteria 的相對豐度增加了9.7%（P<0.05），并使Bacteroidetes 的相對豐度降低了65.8%（P<0.05）。E 處理中，EDU 噴施卻使Gammaproteobacteria 的相對豐度降低了12.3%，使Bacteroidetes 的相對豐度增加了1.9 倍。O3和EDU的交互作用對Gammaproteobacteria 和Bacteroidetes 的相對豐度產生了顯著影響（P<0.001）。

2.5 對小麥葉際細菌優勢種屬的影響

將總的葉際細菌群落中相對豐度高于1%的屬定義為優勢屬，發現所有樣品中農麥88 的優勢屬相對豐度由高到低依次為Pseudomonas（21.8%）、Pan?toea（17.1%）、Duganella（9.7%）、Serratia（7.2%）、Er?winia（5.0%）、Sphingomonas（3.5%）、Paenibacillus（3.0%）、Massilia（2.6%）。

如 表2 所示，O3濃 度升高 對Massilia、Pantoea、Pseudomonas和Serratia的相對豐度產生了顯著影響。水和EDU 處理條件下，O3濃度升高使Pseudomonas和Serratia相對豐度均較A 處理分別顯著下降了50.6%~57.2%和41.4%~65.5%。EDU 處理條件下，O3濃度升高使Massilia相對豐度顯著下降了25.8%，而水處理下O3濃度升高對其相對豐度則無顯著影響。O3濃度升高僅在水處理條件下使Pantoea相對豐度顯著提高了5.7倍。

表2 O3濃度升高、EDU葉片噴施及其相互作用對葉際優勢屬（占比1%以上）相對豐度的影響Table 2 Main effects of elevated O3，EDU leaf spraying，and their interaction on the relative abundance of abundant genus（more than 1%）

EDU噴施對Erwinia、Massilia和Pseudomonas的相對豐度產生了顯著影響。如表2 所示，E 處理下EDU使Erwinia相對豐度顯著下降了73.0%，而A 處理下EDU 對其相對豐度則無顯著影響。EDU 在A 處理條件下使Massilia和Pantoea相對豐度分別顯著提高了46.7%和274.0%。A 和E 處理下EDU 均降低了Pseu?domonas的相對豐度，但未達到顯著水平。O3和EDU的 交 互 作 用 對Duganella、Paenibacillus、Pantoea和Sphingomonas的相對豐度產生了顯著影響。

3 討論

本研究發現，環境O3濃度由40.9 mg·L-1·h-1升高至（59.9±2.5）mg·L-1·h-1對小麥的生長有抑制作用，具體表現為降低了小麥的株高（圖2）。之前的研究通過盆栽和田間試驗也發現O3濃度升高顯著降低了小麥的生物量[41-42]。其主要作用機制為具有強氧化性的O3通過氣孔進入植物體內后經一系列生化反應產生活性氧自由基（ROS），ROS 進一步破壞細胞結構，造成植物生理代謝混亂，進而減弱光合作用并抑制生長[43]。而EDU 處理能使小麥保持較高的抗氧化酶活性和較高濃度的抗氧化劑，以保護細胞免受O3誘導的ROS 的傷害，維持葉片中較高的光合色素和蛋白質水平[27]，并將更多的光合作用物質轉移到生殖部位，從而提高產量。Tiwari 等[44]發現葉面噴施300 mg·L-1EDU 顯著提高了印度小麥（品種M533）的株高；本研究也發現在環境O3濃度和1.5 倍環境O3濃度條件下噴施EDU 均提高了小麥株高，尤其是1.5 倍環境O3濃度條件下噴施EDU 對小麥的促生作用更明顯（圖2）。Shang 等[45]利用開頂箱式O3熏蒸系統（OTC）通過盆栽試驗發現在環境O3濃度[（39.6±1.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 能完全緩解水稻的O3脅迫，而在高濃度O3[（87.3±0.9）mg·L-1·h-1]下葉面噴施EDU 則部分緩解了O3脅迫。由此可知，葉面噴施EDU 對O3脅迫的緩解效果可能因品種和試驗條件的不同而異。

生態系統多樣性越豐富，其對環境變化的耐受性也越高[46]。Wang 等[47]利用OTC 熏蒸系統發現，較之于炭過濾大氣，環境O3濃度升高40 mg·L-1·h-1時顯著提高了雜交稻南粳5055 葉際細菌生物多樣性，這可能是南粳5055對O3脅迫的一種積極應對策略。本研究中1.5 倍環境O3濃度與葉片EDU 噴施處理及其相互作用，均沒有顯著影響葉際細菌群落的alpha 多樣性（表1）。研究結論的不一致可能與作物品種、O3熏蒸濃度及熏蒸方式相關。

本研究中葉際細菌群落的優勢菌門按相對豐度由高到低排列依次是Proteobacteria、Bacteroidota 和Firmicutes，根據已有的報道可知這3個菌門為植物葉際優勢菌門[2，8，48]，與韓筱璇[49]和Xu等[50]的研究結果一致，本研究也發現Gammaproteobacteria 是小麥葉際最優勢的種群?；诤昊蚪M研究，Sessitsch 等[51]發現在植物葉際占絕對優勢的Gammaproteobacteria 參與了氮循環。氮是所有活細胞中尿素、氨基酸（蛋白質）、核酸（DNA和RNA）、三磷酸腺苷（ATP）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的基本成分[52]，另外氮也是植物光合作用所必需的葉綠素的重要成分[53]。由微生物介導的氨化作用、硝化作用等氮循環過程能為植物提供速效和豐富的氮源，因此對植物生長與產量具有重要意義。由此可知Gammaproteobacteria 可能在維持植物生長與健康中起重要作用。另外Gammapro?teobacteria 也被報道能幫助植物抵御外部生物、非生物因子的干擾[54]。

PCoA 結果表明O3濃度升高和葉面噴施EDU 均顯著改變了小麥葉際細菌群落結構（圖3）。本研究發現水處理條件下O3濃度升高對Gammaproteobacte?ria 沒有顯著影響（圖4），這表明Gammaproteobacteria在維持小麥葉際細菌群落穩定性中扮演了重要角色。另外在環境O3濃度條件下EDU 的噴施顯著提高了Gammaproteobacteria 的相對豐度，這可能是由于EDU為葉際細菌提供了豐富的氮源，而Gammaproteobacte?ria 是葉際氮循環的重要參與者。另外在本研究中，在O3濃度升高條件下葉面噴施EDU 顯著提高了Bac?teroidetes 的相對豐度，而在環境O3濃度下EDU 反而降低了Bacteroidetes的相對豐度（圖4）。Bacteroidetes從人類腸道到海洋水環境等各種環境都有著較高的豐度，盡管數據庫中儲存的屬于Bacteroidetes 的菌株序列并不多[55]。長期以來，滑動運動被認為是Bacte?roidetes 的一個標志性特征，它允許菌株主動運動到葉片表面具有更多水分和養分的有利位置，并可能通過對養分或植物信號分子的趨化作用來輔助完成該過程[56]。Bacteroidetes 在進化過程中還保留了高效節能的ACIIIcaa3COX 呼吸超復合體，這提高了它們競爭高分子量碳水化合物的適應性[56]。另外，Bacte?roidetes 可以利用柔紅素家族色素作為紫外線保護劑[57]。綜上說明Bacteroidetes 對脅迫環境具有更強的適應性。因此，環境O3濃度下噴施EDU 為葉際細菌提供了豐富的氮源，從而降低了Bacteroidetes 的相對豐度；而1.5 倍環境O3濃度下小麥生長受到脅迫，葉面噴施EDU 可能通過提高Bacteroidetes 的相對豐度來增強小麥對O3脅迫的適應性；但該結論仍需要后續試驗進一步驗證。

相對于棲息在植物地下部的微生物，葉際微生物在更開放的生境中面臨更多環境壓力[2]，葉際微生物勢必需要采取不同的策略應對環境壓力以便在小麥葉片定殖。研究表明，Pantoea作為葉際細菌群落的優勢屬，在固氮、促進植物生長和抵御病原菌侵害中起重要作用[5]。本研究中水處理條件下O3濃度升高顯著提高了葉際Pantoea的相對豐度（表2），這可能是小麥自主適應O3脅迫而提高葉際細菌氮素利用效率的一種適應性策略。另外，葉際的優勢菌屬Pseu?domonas和Sphingomonas也具有通過色素沉著來避免紫外線輻射的功能。優勢屬Massilia在植物表面的定殖能力很強，能通過產生吲哚乙酸、鐵載體有效促進植物的生長，且其對微生境中養分的可用性與競爭也非常敏感，能通過產鐵載體和纖維素酶等途徑有效抵御包括Pythium等在內的植物病原菌的侵襲[58]。綜上可知，葉際細菌從葉片表面獲得穩定的微生境的同時也對植物生長有利。

了解葉際微生物的驅動因素是制定植物管理策略的第一步，能促進形成健康的葉際微生物群落結構，從而有利于植物的健康和生態功能[59]。一般來說，植物微生物群落結構由植物基因型、土壤、植物發育階段、植物組織、氣候和人類活動等因素決定[60-61]。作為一個開放的生境，葉際微生物比內生菌對非生物因素（包括輻射、干旱、風速等）更為敏感[2]。Ueda等[62]認為O3脅迫下不同程度的碳源有效性（如揮發性有機物VOCs 利用率）可能會影響水稻葉際微生物養分的有效性，從而影響微生物群落的組成。植物VOCs 排放對植物表面微生物群落的形成起重要作用[63]，然而這一觀點仍需通過進一步的試驗來驗證。Yan 等[64]發現葉片的形貌特征在葉際細菌群落的形成過程中發揮了重要作用。此外，電解質滲漏、葉片表面脂質轉化和蠟質也可能對葉際微生物產生影響。這些生理參數將在今后的研究中進一步探討。

另外，盡管本試驗為O3濃度升高、EDU 噴施及其交互作用對小麥葉際微生物群落的影響提供了新的見解和重要視角，但還需要更多的試驗數據來闡明O3濃度升高和EDU 噴施對不同小麥品種的不同生長階段葉際微生物菌群的持續影響與重演性。特別是葉際微生物群落alpha多樣性和群落結構與小麥產量之間的關系仍有待進一步研究。

4 結論

（1）O3濃度升高降低了農麥88 的株高，葉面噴施EDU能有效緩解O3脅迫對小麥生長的抑制。

（2）O3濃度升高、EDU葉面噴施顯著改變了農麥88葉際細菌群落結構，但對alpha多樣性沒有顯著影響。

（3）農麥88 葉際優勢細菌門相對豐度由高到低依次為Proteobacteria、Bacteroidotes 和Firmicutes，其中Gammaproteobacteria 為最優勢綱；O3濃度升高條件下EDU 顯著降低了Gammaproteobacteria 的相對豐度，同時提高了Bacteroidetes 的相對豐度；EDU 可能通過提高逆境適應性強的Bacteroidetes 的相對豐度來增強小麥對O3脅迫的適應性。