鎘脅迫下鈍化劑對菠菜生理特征及鎘累積的影響

王麗，蔡景行，羅沐欣鍵，吳道明，范洪黎，秦松，范成五*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，貴陽 550006；2.貴陽市鄉(xiāng)村振興服務中心，貴陽 550081；3.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地保護國家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，大量工業(yè)活動產(chǎn)生的鎘（Cd）被排放到環(huán)境中，加上人類不合理的施肥和灌溉等，導致土壤Cd 污染越來越嚴重。據(jù)2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，全國土壤總點位超標率達16.1%，其中土壤Cd 點位超標率為7.0%。土壤Cd 污染不僅會破壞生態(tài)平衡，而且還會危害人類生命健康。相關研究表明，農(nóng)田土壤中的Cd 通過食物鏈進入人體，并與含有羥基、氨基和巰基的蛋白質(zhì)分子結合，從而抑制酶系統(tǒng)，最終損害肝臟、腎臟和脾臟等，引發(fā)多種疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、貧血和肺炎等[1]。因此，減輕農(nóng)田土壤中的Cd 污染，保障農(nóng)作物的安全生產(chǎn)非常必要。

當前，Cd 污染土壤治理和修復的方法可分為物理法、化學法、生物學法、農(nóng)藝調(diào)控等，或幾種方法聯(lián)合使用[2]。其中，化學法中的原位鈍化修復技術由于操作簡便、價格低廉、起效快等優(yōu)點，常被用于修復中輕度污染農(nóng)田[3]。原位鈍化修復技術是通過溶解沉淀、離子交換吸附、氧化還原、有機絡合、螯合等反應來改變Cd 在土壤中的賦存狀態(tài)，從而降低土壤中Cd的遷移性和生物有效性[4]。此外，相關研究表明，無機鈍化劑的施用還可以有效提高土壤pH[5]，而土壤pH 是影響土壤重金屬Cd 溶解度、形態(tài)變化、遷移和生物有效性的主要因子之一[6]。王展等[7]的研究指出，土壤pH 越高，土壤中Cd生物有效性越低，植物所受到的Cd 脅迫程度也會越低。可見，通過施加鈍化劑降低土壤Cd 含量是有效的。目前，用于Cd 污染土壤修復的無機鈍化材料主要有石灰、石灰石等，但這些材料具有用量過大、吸附效果差、不具備選擇性吸附等缺點，因此研究新型鈍化材料非常必要。

生物炭內(nèi)部疏松多孔，比表面積大，吸附能力、氧化能力和陽離子交換能力強，具有修復重金屬污染土壤的潛力，另外生物炭可通過生物廢棄物制備，在修復土壤的同時還可提高廢棄物資源合理利用率[8]，因此受到越來越多學者的關注。相關研究表明，生物炭用于重金屬污染土壤的原位鈍化修復，可減少作物對重金屬的吸收和累積[9]。但由于生物炭吸附穩(wěn)定效果弱，被吸附的重金屬有再次析出的風險，因此需要對生物炭進行改性。現(xiàn)有研究表明，通過巰丙基三甲氧基硅烷制備的巰基生物炭可有效地與Cd2+結合形成結合態(tài)，降低土壤Cd 含量[10]。但當前對改性巰基生物炭與無機鈍化材料的治理效果的對比研究較少。

蔬菜是人類生活中必不可少的食物，能提供人體所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)。我國蔬菜種植面積和產(chǎn)量均排在世界首位。但近十幾年來，我國蔬菜Cd 含量超標問題時有發(fā)生，廣西、貴州等南方部分地區(qū)蔬菜Cd超標率達到了21.10%[11]，嚴重威脅到農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)安全。目前，南方地區(qū)針對鈍化劑對Cd 污染土壤修復的研究較多，但大部分研究主要側重于土壤Cd 的鈍化效果，少有研究將土壤修復效果和植物生理效應等結合起來，綜合分析原位鈍化修復對土壤環(huán)境和作物的影響。因此，綜合分析有機和無機原位鈍化修復對土壤環(huán)境和作物的影響意義較大。

基于此，本研究以我國南方地區(qū)典型蔬菜——菠菜為研究對象，通過設置有機、無機鈍化劑單施和配施溫室盆栽試驗，測定土壤pH、有效態(tài)Cd 含量及菠菜抗氧化酶活性，闡明施用不同鈍化劑對Cd 脅迫下菠菜生理特征及Cd 累積的影響，為我國南方地區(qū)Cd污染土壤治理措施的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自貴州省安順市，利用多點采樣法采集0~20 cm 的污染農(nóng)田土樣，去除表層腐殖質(zhì)和雜物后，自然風干、混勻、磨碎過篩備用。供試土壤重金屬Cd 含量及基本理化性質(zhì)見表1。供試菠菜（Spinacia oleraceaL.）品種為日本大葉菠菜。供試納米羥基磷灰石（Nano-hydroxyapatite）購自南京埃普瑞納米材料有限公司，巰基生物炭通過鹽酸催化浸泡法制備：將玉米秸稈生物炭加入到100 mL 濃度為20%的鹽酸中，80 ℃條件下攪拌反應4 h，過濾、烘干、研碎，制成氫型生物炭。取所制備的氫型生物炭和巰丙基三甲氧基硅烷按質(zhì)量比1∶1 混合，常溫下反應6 h，過濾、漂洗、烘干，將產(chǎn)物研磨過100 目篩后得到粉末狀的巰基改性生物炭備用[12]。試劑盒購自北京太陽生物科技有限公司，測定步驟按照說明書進行。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical-chemical properties of tested soil

1.2 試驗設計

采用溫室土培盆栽試驗，以菠菜為研究對象，設置不施鈍化劑（CK）和施加納米羥基磷灰石（nHAP）、巰基生物炭（TMB）、納米羥基磷灰石+巰基生物炭（HPTB）4個處理，每個處理3次重復。

育苗方法：將大小均勻的完整種子經(jīng)5%（V/V）NaClO 表面消毒15 min，再用去離子水洗滌數(shù)次后放入25 ℃的去離子水中浸泡12 h，浸泡完成后，放入營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)至4片真葉時移栽。

培養(yǎng)條件：單施鈍化劑處理各鈍化劑按照2%（m∶m）的比例與土壤混合，配施鈍化劑處理各鈍化劑按照1%（m∶m）的比例與土壤混合，樣品混合均勻后稱取5 kg 裝入深色PVC 方盆（規(guī)格為長44 cm、寬20 cm、高11 cm），同時施入底肥，分別為N 0.30 g·kg-1、P2O50.20 g·kg-1、K2O 0.30 g·kg-1，施入形態(tài)分別為（NH4）2SO4、KH2PO4、K2SO4。填裝好的方盆放于溫室中穩(wěn)定1 周后，將長勢均勻的菠菜移栽到方盆中，每盆等距定植4 株。菠菜移栽完成后，在貴州省農(nóng)業(yè)科學院溫室自然光條件下培養(yǎng)，溫度為25 ℃/20 ℃（晝/夜），相對濕度為65%~75%，植物培養(yǎng)期間每1~2 d澆水1次，土壤濕度保持在田間持水量的60%~70%。

1.3 樣品采集及測定

植物樣品采集與處理：在移栽后的第72 天采集方盆中的菠菜植株樣品，將菠菜按照地上部和地下部分開，根部浸入20 mmol·L-1Na2-EDTA 中15 min以除去附著在根表面的Cd2+，然后用自來水和去離子水沖洗。地下部和部分地上部植株樣品在105 ℃下殺青30 min 后，在70 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，然后用球磨儀磨碎裝袋備用。準備稱取處理后的樣品0.500 0 g 于凱氏定氮瓶中，并加入4 mL HNO3-HClO4混合酸（優(yōu)級純，體積比4∶1）10 mL 混勻，冷消化過夜。將消煮管置于消煮爐上，120 ℃加熱60 min，再在180 ℃下消化至溶液變?yōu)闊o色透明，稍冷卻后，用超純水轉移并定容至50 mL，同時做試劑空白。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，7700x，Agilent，美國）測定植株的Cd含量，測定方法參照《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》（GB 5009.268—2016）。部分植株葉片在-20 ℃保存，用于測定過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。測定步驟按照相應試劑盒的說明書進行。

土壤pH 測定采用玻璃電極法，水土比為2.5∶1。土樣經(jīng)王水+H2O2微波消解冷卻后用超純水定容至50 mL 用于測定全Cd 含量，土樣經(jīng)0.1 mol·L-1CaCl2浸提液浸提后用于測定有效態(tài)Cd含量。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進行土壤Cd含量的測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010 對試驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計；利用SPSS 22軟件中的LSD 法進行單向方差分析（ANO?VA），比較基于ANOVA 得出的最小顯著差異值的結果，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義；采用Pearson 相關性分析法對數(shù)據(jù)進行相關性分析；利用GraphPad Prism 6、Origin 2022軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同鈍化劑處理對菠菜生物量的影響

由圖1 可知，不同處理下菠菜地上部生物量為5.91~19.81 g·盆-1，地下部生物量為0.66~1.59 g·盆-1，各處理菠菜不同部位生物量均為HPTB>nHAP>TMB>CK，HPTB、nHAP、TMB 處理地上部生物量分別較CK增加了143.75%、90.27%、7.28%，地下部生物量分別增加了91.71%、72.50%、4.81%。HPTB 和nHAP 處理下菠菜生物量顯著高于CK。結果表明，施用nHAP、TMB、HPTB均能增加菠菜地上部和地下部生物量，其中，HPTB的菠菜生物量最大，nHAP次之。

圖1 不同處理對菠菜生物量的影響Figure 1 Effects of different treatments on the biomass of Spinacia oleracea L.

2.2 不同鈍化劑處理對菠菜Cd含量的影響

由圖2 可知，不同處理下菠菜地上部Cd 含量為0.29~1.46 mg·kg-1，地下部Cd 含量為0.44~1.52 mg·kg-1，各處理菠菜不同部位Cd 含量均為CK>TMB>HPTB>nHAP，與CK 相比，TMB、HPTB、nHAP 處理下地上部Cd 含量分別降低了6.94%、65.49%、78.19%，地下部Cd 含量分別降低了39.34%、52.31%、65.98%，nHAP、HPTB 處理下菠菜地上部Cd 含量顯著低于CK和TMB，nHAP、TMB、HPTB 處理下菠菜地下部Cd 含量均顯著低于CK。結果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能降低菠菜地上部和地下部Cd 含量，其中nHAP 的菠菜Cd含量最低。

圖2 不同處理對菠菜Cd含量的影響Figure 2 Effects of different treatments on the Cd content of Spinacia oleracea L.

2.3 不同鈍化劑處理對土壤pH 和有效態(tài)Cd 含量的影響

如圖3 所示，nHAP、TMB、HPTB 處理下土壤pH較CK 分別提高了1.36、0.08、0.76 個單位，nHAP 和HPTB 與CK 存在顯著差異，TMB 與CK 無顯著差異。相較于CK，nHAP、TMB、HPTB 的土壤有效態(tài)Cd 含量分別顯著降低了83.22%、22.57%、73.70%。結果表明，不同鈍化劑處理均能提高土壤pH、降低土壤有效態(tài)Cd含量，其中nHAP效果最為明顯。

圖3 不同處理對土壤pH和有效態(tài)Cd的影響Figure 3 Effects of different treatments on the pH and available Cd content of soil

2.4 不同鈍化劑處理對菠菜抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4 可知，nHAP、TMB、HPTB 處理下菠菜CAT活性與CK 無顯著差異。CK、nHAP、HPTB 處理下菠菜POD 活性無顯著差異，但均顯著高于TMB，分別增加了21.56%、33.51%和16.00%。nHAP 處理下SOD活性顯著高于其他處理，MDA 含量顯著低于其他處理。結果表明，施用nHAP 可以提高菠菜葉片抗氧化酶的活性，緩解Cd脅迫下脂膜過氧化傷害。

圖4 不同處理對菠菜抗氧化系統(tǒng)的影響Figure 4 Effects of different treatments on the antioxidant system of Spinacia oleracea L.

2.5 相關性分析

由圖5 可知，CAT、POD、SOD 活性均與MDA 含量呈負相關，其中POD活性與MDA含量呈顯著負相關，相關系數(shù)為-0.66，SOD 活性與MDA 含量呈極顯著負相關，相關系數(shù)為-0.79。CAT、POD、SOD 活性均與pH 呈正相關，其中，POD 活性與pH 呈顯著正相關，相關系數(shù)為0.64，SOD 活性與pH 呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.73。有效態(tài)Cd 含量與pH 呈極顯著負相關，與地上部Cd含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.97。

圖5 相關性分析Figure 5 Correlation analysis

3 討論

鈍化劑可通過降低土壤中重金屬的活性來減輕其對作物的毒害[13]。本研究結果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能增加菠菜地上部和地下部生物量。土壤pH 是影響Cd 活性最重要的因素之一[14]，本研究結果表明，鈍化劑的施加可有效提高土壤pH，降低土壤Cd 含量，這與徐萬強等[15]的研究結果一致，這是由于經(jīng)鈍化劑處理后，土壤pH 上升增加了土壤表面負電荷，提高了對Cd2+的吸附，同時產(chǎn)生的碳酸鹽沉淀[16]有效降低了土壤中CaCl2提取態(tài)的Cd 含量，進而降低了菠菜對Cd 的吸收。此外，Cao 等[17]的研究也指出，在Cd 污染酸性農(nóng)田中施入海泡石可有效提高土壤pH，降低土壤中CaCl2提取態(tài)的Cd 含量，從而減少了小白菜對Cd的吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，nHAP處理的菠菜Cd含量最低，這一方面是由于nHAP的添加提高了土壤pH，從而改變了Cd 的存在形態(tài)，降低了土壤中Cd的可遷移性，進而達到降低菠菜Cd 含量的效果[18]。另一方面是由于納米級的羥基磷灰石具有高比表面積、組織相容性、多孔性、吸附性等理化性質(zhì)，本身晶格中的Ca2+可以更好地與土壤中的Cd2+進行離子交換或表面吸附反應等，形成更穩(wěn)定的Cd 磷灰石[19-20]，進而降低菠菜對Cd 累積。而TMB 鈍化效果不如nHAP的原因可能是巰基改性處理為生物炭嫁接了巰基，使得生物炭在酸性條件下仍能有效地吸附重金屬Cd，但是巰基改性處理會減少生物炭孔隙[21]。

當植物受到重金屬脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），CAT、POD 和SOD 等可以通過清除ROS 來抵御ROS 對細胞膜造成的傷害[22]。當ROS含量增加時會引起脂質(zhì)過氧化，MDA 是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低反映了脂質(zhì)過氧化的強弱程度[23]。植物體在Cd 污染下會加強葉片的膜脂過氧化產(chǎn)生MDA，提高植物細胞膜通透性[24]。本試驗中，不同鈍化劑處理對抗氧化酶活性和MDA 含量的影響不同，nHAP 處理下菠菜CAT、POD 和SOD 活性均提高，MDA 含量降低，這與張偉等[25]的研究結果一致，可能是因為nHAP 的應用誘導了H2O2的升高，從而激活了抗氧化酶合成的代謝途徑[26]，加入nHAP后能夠有效地緩解Cd 污染對菠菜的傷害，降低MDA的含量。

分析發(fā)現(xiàn)，CAT、POD、SOD 均與pH 呈正相關，其中POD 與pH 呈顯著正相關，SOD 與pH 呈極顯著正相關，這與杜志敏等[27]的研究結果相似。首先，這可能是因為隨著土壤pH 的增加，重金屬活性降低，減少了重金屬對土壤酶活性中心的占據(jù)及與酶分子基團的結合，進而降低了重金屬對酶活性基團空間結構的破壞以及對酶催化能力及其對酶合成的抑制作用；其次，重金屬活性的降低使得土壤微生物群落結構發(fā)生變化，且微生物生長繁殖增強，間接提高了土壤酶活性[28]；由于菠菜的不斷生長，菠菜的根系分泌物、凋落物、腐爛根系等增多，這也間接促進了土壤酶活性的提高。相關性分析表明，土壤有效態(tài)Cd 和土壤pH 呈極顯著負相關關系，這與武琳等[29]的研究結果一致。這可能是由于施用鈍化劑后土壤pH 升高，一方面使土壤中黏土礦物、水合氧化物和有機質(zhì)表面的負電荷增加，從而對Cd2+的吸附力增強，促進了CdCO3和Cd（OH）2沉淀的生成[30]，生成的Cd沉淀也是施入生物炭使土壤碳酸鹽結合態(tài)Cd 含量升高的原因。另一方面，土壤pH 升高時H+濃度減小，從而降低了H+和Cd2+在吸附位點上的競爭，使得土壤中的有機質(zhì)、鐵錳氧化物等與重金屬的結合更緊密[31]。

4 結論

（1）施用納米羥基磷灰石、巰基生物炭、納米羥基磷灰石+巰基生物炭均可緩解Cd脅迫對菠菜的影響，促進菠菜生長，納米羥基磷灰石+巰基生物炭的促生效果最好，納米羥基磷灰石次之。

（2）不同鈍化劑均能提高土壤pH，降低土壤有效態(tài)Cd 含量，減少菠菜地上部和地下部對Cd 的吸收；施用納米羥基磷灰石能夠增加抗氧化酶活性，降低MDA含量，修復損傷細胞膜，緩解脂膜過氧化傷害。

（3）綜上，納米羥基磷灰石在一定程度上緩解了Cd 污染對菠菜葉片細胞的傷害，增強了菠菜對Cd 脅迫的抵抗能力，可作為緩解Cd 污染對菠菜產(chǎn)生生理影響的鈍化劑。