腐植酸對(duì)漆酶誘導(dǎo)雌激素自聚合動(dòng)力學(xué)的影響

高曦，陳美驊，孫凱*

（1.蘇州中晟環(huán)境修復(fù)有限公司，江蘇 蘇州 215104；2.農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

近30 年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)化和城鎮(zhèn)化進(jìn)程的快速發(fā)展，環(huán)境雌激素污染問(wèn)題日益凸顯[1]。環(huán)境中的17β-雌二醇（E2）、17α-炔雌醇（EE2）和雙酚A（BPA）等雌激素主要通過(guò)城市污水排放、畜禽養(yǎng)殖廢水釋放和地表徑流等途徑進(jìn)入水生態(tài)系統(tǒng)[2-3]。目前，在世界各地的水土介質(zhì)中已頻繁檢測(cè)到雌激素[4]。雌激素在環(huán)境中具有分布廣、濃度低、毒性高和多態(tài)性等特征，它們可破壞有機(jī)體的生殖基因和激素平衡，從而造成生物體內(nèi)分泌失調(diào)、生殖障礙、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等危害[5]。例如，低劑量（nmol?L-1）的環(huán)境雌激素長(zhǎng)期暴露即可導(dǎo)致雄魚(yú)的雌性化[6]。雌激素通過(guò)皮膚接觸、飲食攝取等路徑被人體吸收和積累后，會(huì)對(duì)人體的生殖、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生一系列的干擾和毒害作用[7]。因此，環(huán)境雌激素已嚴(yán)重威脅到生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類(lèi)的健康安全。

腐植酸（HA）普遍存在于天然水生態(tài)環(huán)境中，其濃度范圍一般為10~30 mg?L-1，占水中總有機(jī)物的50%~90%[8]。已有研究證實(shí)，HA 是一種含有大量酚羥基、羧基、氨基和芳香基等功能團(tuán)的超分子聚合物[9]。該聚合物能夠顯著影響雌激素的生物毒性、遷移轉(zhuǎn)化、生物地球化學(xué)循環(huán)和歸趨等環(huán)境行為[10-11]。例如，Bedard 等[12]研究指出，HA 可以與E2 的芳香環(huán)相互作用，從而降低母體化合物的雌激素活性。明確HA與雌激素的相互作用已成為環(huán)境污染控制與修復(fù)的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。物理化學(xué)吸附、高級(jí)氧化、微生物降解、植物吸收等常規(guī)水處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于規(guī)避雌激素污染，但這些技術(shù)無(wú)法有效去除痕量濃度的雌激素，且存在處理費(fèi)用高、降解周期長(zhǎng)等缺陷[13-17]。與之相比，真菌漆酶具有催化效率高、操作條件溫和、能量損耗低、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。漆酶屬于一類(lèi)藍(lán)色的胞外含銅多酚氧化還原酶，該綠色生物催化劑可用于處理多種有機(jī)污染物[20]。漆酶以水中溶解氧作為最終電子受體，催化酚類(lèi)污染物的單電子氧化，生成復(fù)雜多樣的聚合物[21-22]。盡管如此，國(guó)內(nèi)外關(guān)于HA 對(duì)漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物分布和作用機(jī)制影響的研究仍幾近空白。

本文選擇氧化還原電位較高的變色栓菌（Tram?etes versicolor）漆酶作為供試生物酶，采用批量平衡試驗(yàn)方法研究HA 對(duì)漆酶誘導(dǎo)E2、EE2 和BPA 3 種雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的影響，利用高分辨質(zhì)譜（HRMS）篩選方法識(shí)別酶促反應(yīng)中雌激素的自聚物，并定性分析自聚物隨時(shí)間變化的分布特征，綜合地揭示HA 影響漆酶誘導(dǎo)雌激素自由基聚合的作用機(jī)制。研究結(jié)果不僅有望利用酶促聚合反應(yīng)規(guī)避雌激素污染風(fēng)險(xiǎn)，而且也可以增加環(huán)境中有機(jī)碳含量。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

漆 酶（來(lái) 源于Trametes versicolor，≥0.5 U·mg-1，CAS：80498-15-3）、E2（C18H24O2，CAS：50-28-2）、EE2（C20H24O2，CAS：57-63-6）、BPA（C15H16O2，CAS：80-05-7）、2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP，C8H10O3，CAS：91-10-1）、HA（CAS：1415-93-6）均購(gòu)自Sigma-Al?drich 化學(xué)公司；檸檬酸（C6H8O7，CAS：77-92-9）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4，CAS：7558-79-4）購(gòu)自J.T.Baker化學(xué)公司；色譜純甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1）和乙腈（C2H3N，CAS：75-05-8）購(gòu)自Fisher Scientific 公司。采用超純水（18.2 MΩ?cm）配制10 mmol?L-1檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液（C-PBS，pH 5.0），作為漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系。

1.2 漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)

采用批量平衡試驗(yàn)方法，研究HA 對(duì)漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的影響。酶促反應(yīng)體系包含20 mL 10 mmol?L-1C-PBS（pH 5.0）、10 μmol?L-1雌激素、0 或20 mg?L-1HA[23]。添加1 U·mL-1漆酶，在25 ℃室溫環(huán)境下啟動(dòng)反應(yīng)。以雌激素和高溫滅活的漆酶作為空白對(duì)照組。在預(yù)先選擇的時(shí)間間隔內(nèi)（5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 min），用移液槍準(zhǔn)確吸取0.5 mL 反應(yīng)液，并立即加入等體積（0.5 mL）甲醇淬滅反應(yīng)。將混合液過(guò)0.22 μm 纖維濾膜后，置于液相小瓶中4 ℃冰箱保存待測(cè)。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）測(cè)定溶液中雌激素的殘留濃度。所有試驗(yàn)均設(shè)置3 組平行。擬合假一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，分別通過(guò)公式（1）和公式（2）計(jì)算雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)常數(shù)（k，h-1）和半衰期（t1/2，h）：

式中：t表示反應(yīng)時(shí)間，h；C0表示雌激素的初始濃度，μmol?L-1；Ct表 示 雌 激 素 在t時(shí) 刻 的 殘 留 濃 度，μmol?L-1。

1.3 漆酶活性測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2550，Shimad?zu，日本）比色法，通過(guò)氧化1 mmol·L-12，6-DMP檢測(cè)反應(yīng)體系中漆酶的活性變化[14]。在比色皿中添加20 μL 含有漆酶的反應(yīng)液、3.4 mL 含有1 mmol·L-12，6-DMP 的C-PBS（pH 3.8），充分混合均勻后，于468 nm處測(cè)定溶液吸光度變化。試驗(yàn)每隔30 s讀數(shù)一次，測(cè)定5 min。漆酶活性單位定義為每分鐘氧化1 mmol·L-1底物所需的酶量。所有試驗(yàn)均設(shè)置3 組平行。分別利用公式（3）和公式（4）計(jì)算漆酶活性（A，U·mL-1）和相對(duì)酶活（Er，%）：

式中：r表示5 min 內(nèi)吸光度隨時(shí)間的變化速率，U；20為添加的含有漆酶反應(yīng)液的體積，μL；A0表示漆酶的初始酶活，U·mL-1；At表示漆酶在t時(shí)刻的酶活，U·mL-1。

1.4 HPLC定量測(cè)定雌激素殘留濃度

采用HPLC（Shimadzu LC 20TA）分析法，檢測(cè)溶液中雌激素的殘留濃度。HPLC色譜柱型為Agilent HCC18（4.6 mm×250 mm，5 μm 填料粒徑，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；流動(dòng)相為乙腈∶純水=30%∶70%，流速1.0 mL?min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，檢測(cè)時(shí)間10 min。標(biāo)準(zhǔn)樣品中3種雌激素的回收率范圍為98.8%~103.2%（n=5）。

1.5 雌激素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定

利用高分辨質(zhì)譜（HRMS）鑒定漆酶誘導(dǎo)雌激素的 轉(zhuǎn) 化 產(chǎn) 物。在 含 有10 μmol?L-1雌 激素、0 或20 mg?L-1HA 的20 mL 10 mmol?L-1C-PBS（pH 5.0）中添加1 U·mL-1漆酶，25 ℃室溫條件下啟動(dòng)酶促反應(yīng)。反應(yīng)1 h 后向體系中加入1 mol?L-1鹽酸，將pH 調(diào)節(jié)至1.5（淬滅反應(yīng)）。隨后，加入20 mL 乙酸乙酯劇烈振蕩，并用超聲儀萃取30 min（每隔5 min 充分混勻溶液），該過(guò)程重復(fù)3 次，以充分提取有機(jī)相。采用分液漏斗分離上層乙酸乙酯萃取液，萃取液通過(guò)氮吹儀濃縮干燥后，甲醇定容至1 mL，置于4 ℃冰箱保存。設(shè)置添加高溫滅活的漆酶處理組作為空白對(duì)照。HRMS 鑒定采用Triple TOFTM 5600+質(zhì)譜儀（AB SCI?EX，美國(guó)）完成，在質(zhì)荷比（m/z）為150~1 500 范圍內(nèi)掃描雌激素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。該系統(tǒng)提供了質(zhì)量誤差小于5.0×10-6的高精度分辨能力。在流速為5 μL?min-1的條件下，采用電噴霧電離源（ESI：-3.5 kV），超純度氮?dú)猓?99.999%）用于干燥或輔助氣體，超純度氦氣（>99.999%）作為載氣。離子傳輸毛細(xì)管溫度設(shè)置為550 ℃并接地（0 V）。HRMS 分析后，運(yùn)用Xcalibur 軟件（V3.0，Thermo Scientific）推導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的可能化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

1.6 雌激素聚合產(chǎn)物微觀形貌

通過(guò)大規(guī)模試驗(yàn)方法，收集漆酶誘導(dǎo)雌激素聚合沉淀產(chǎn)物。酶促反應(yīng)3 d后，添加1 mol?L-1鹽酸，將溶液pH 調(diào)節(jié)至1.5并過(guò)夜靜置12 h，使聚合物充分析出并沉淀。利用高速冷凍離心機(jī)，于9 000 r?min-1離心30 min。將聚合沉淀產(chǎn)物用超純水沖洗3 次，去除殘留的C-PBS 和漆酶。聚合沉淀產(chǎn)物經(jīng)過(guò)冷凍干燥、研磨、過(guò)100 目篩后，利用掃描電子顯微鏡（SEM）表征聚合物的微觀形貌特征。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA影響漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)

HA 分子中含有大量的活性官能團(tuán)，它們能夠影響漆酶誘導(dǎo)雌激素的去除和轉(zhuǎn)化。如圖1 所示，酶促反應(yīng)3 h 內(nèi)，水體中E2 和EE2 的去除率分別高達(dá)99.9%和99.7%。漆酶催化E2 和EE2 轉(zhuǎn)化符合假一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（R2>0.95），它們的k值分別為2.48 h-1和2.03 h-1，t1/2值 分 別 為0.28 h 和0.34 h。添 加20 mg?L-1HA 有效抑制了E2 和EE2 的轉(zhuǎn)化，其去除率分別降低至94.9%和79.6%，t1/2值分別延長(zhǎng)至0.67 h 和1.09 h。在添加滅活的漆酶處理組中，E2 和EE2 的濃度沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。Sun 等[23]研究指出，來(lái)源于云芝（Pleurotus Ostreatus）的漆酶（1 U·mL-1）在25 ℃、pH 5.8 條件下，3 h 內(nèi)對(duì)E2 的去除率在99%以上，而添加HA則明顯降低了E2的去除率。HA阻礙漆酶催化E2 和EE2 轉(zhuǎn)化的原因可能有3 種：一是HA 可結(jié)合游離態(tài)的雌激素，因此降低了雌激素的表觀濃度；二是HA 參與漆酶誘導(dǎo)雌激素的氧化，從而競(jìng)爭(zhēng)漆酶的催化活性位點(diǎn)[23]；三是漆酶催化雌激素-HA 發(fā)生自由基共聚合反應(yīng)，所形成的產(chǎn)物干擾了漆酶的催化活性和穩(wěn)定性[24-25]。本研究中無(wú)論是否添加HA，漆酶活性無(wú)顯著性變化，證實(shí)HA 可能參與酶促反應(yīng)并結(jié)合E2和EE2。

圖1 HA對(duì)漆酶誘導(dǎo)E2和EE2轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的影響Figure 1 Influence of HA on laccase-induced E2 and EE2 transformation kinetics

圖2 展示了HA對(duì)漆酶誘導(dǎo)BPA轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的影響。在未添加HA 處理組中，酶促反應(yīng)3 h 后BPA 的去除率為96.5%，而添加HA 處理組中BPA 的去除率高達(dá)100%。通過(guò)擬合動(dòng)力學(xué)模型計(jì)算出未添加HA和添加HA 處理組中BPA 的k值分別為1.45 h-1和3.13 h-1，t1/2值分別為0.48 h 和0.22 h，R2>0.93（圖2a）。可見(jiàn)，HA 有效促進(jìn)了漆酶誘導(dǎo)BPA 的氧化和去除，該結(jié)果與漆酶誘導(dǎo)E2 和EE2 轉(zhuǎn)化的結(jié)果（圖1）截然相反。分析原因主要是由于漆酶誘導(dǎo)BPA 轉(zhuǎn)化的過(guò)程中酶催化活性逐漸降低，而添加HA 可以維持漆酶的催化活性和穩(wěn)定性，從而確保BPA的持續(xù)氧化和高效去除（圖2b）。Li 等[3]的報(bào)道表明，漆酶催化氧化BPA生成長(zhǎng)鏈BPA自聚物，這些長(zhǎng)鏈聚合物能夠誘捕和封存漆酶分子，從而限制漆酶與底物的接觸。添加HA 可以快速結(jié)合長(zhǎng)鏈BPA 自聚物、消除高分子自聚物對(duì)漆酶的抑制作用，實(shí)現(xiàn)BPA的高效轉(zhuǎn)化和去除[26]。

圖2 HA對(duì)漆酶誘導(dǎo)BPA轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的影響Figure 2 Influence of HA on laccase-induced BPA transformation kinetics

2.2 漆酶誘導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

采用HRMS 結(jié)合Xcalibur 軟件的分析方法，推導(dǎo)漆酶誘導(dǎo)雌激素的轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物。由表1 可知，E2、EE2和BPA的主要酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均為二聚體、三聚體和四聚體等低聚物。這些高分子聚合物的質(zhì)量誤差均小于5.0×10-6，表明HRMS具有較高的精確度，可用于篩選漆酶誘導(dǎo)雌激素形成的大分子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。例如，通過(guò)HRMS 測(cè)定的3 種E2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的m/z分別為541.332 0、811.493 3和1 081.656 6，隨后運(yùn)用Xcalibur軟件的分析方法，推測(cè)這些產(chǎn)物的化學(xué)式分別為C36H46O4、C54H68O6和C72H90O8，它們可能是E2 的二聚體、三聚體和四聚體（質(zhì)量誤差<1.0×10-6）。先前的研究結(jié)果也證實(shí)，漆酶能夠催化雌激素氧化生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子聚合物[27-28]。這些產(chǎn)物是由雌激素單體通過(guò)自由基脫除2 個(gè)氫原子形成的C—C 或C—O—C共價(jià)聚合物。本研究并未檢測(cè)到雌激素高聚物，可能是因?yàn)樗鼈兎肿恿枯^大，無(wú)法溶于提取劑[29]。此外，由于空間位阻效應(yīng)，高分子底物難以進(jìn)入漆酶催化中心[20]。所有聚合產(chǎn)物也在添加HA 處理組中被檢測(cè)到。基于上述分析結(jié)果，可通過(guò)公式（5）計(jì)算雌激素及其自聚物的m/z：

表1 漆酶誘導(dǎo)水溶液中E2、EE2和BPA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Table 1 Transformation products of E2,EE2,and BPA measured by HRMS

式中：m雌表示雌激素分子質(zhì)量，g·mol-1；1.007 8 表示1個(gè)氫原子質(zhì)量，u；n表示雌激素單體數(shù)量（n=1，2，3，4等），個(gè)。

通過(guò)大規(guī)模試驗(yàn)方法，酶促反應(yīng)3 d 后收集雌激素聚合沉淀物。如圖3 所示，漆酶誘導(dǎo)E2、EE2 和BPA 自聚合形成的沉淀產(chǎn)物均為球狀結(jié)構(gòu)，其中E2自聚物的分子尺寸較大。因此，可以采用高速離心或膜過(guò)濾的方法去除大分子雌激素自聚物。這些聚合物具有高度疏水性，它們?cè)诿复倬酆戏磻?yīng)中可以被擠壓濃縮成沉淀顆粒物[30]。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，漆酶能夠誘導(dǎo)雌激素的單電子氧化和聚合，生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子C—C或C—O—C共價(jià)聚合沉淀產(chǎn)物。

圖3 E2、EE2和BPA自聚物的微觀形貌Figure 3 Morphological characteristics of E2,EE2,and BPA self-polymerization products observed by scanning electron microscope

2.3 HA對(duì)雌激素自聚合產(chǎn)物分布的影響

由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)參考樣品，本研究采用相對(duì)豐度值，探索HA 對(duì)雌激素自聚物時(shí)間分布的影響。HA對(duì)E2 二聚體、三聚體和四聚體產(chǎn)量相對(duì)豐度的影響如圖4 所示。在添加HA 條件下，E2 單體的酶促聚合反應(yīng)速率低于缺乏HA體系（圖4a），該結(jié)果與圖1a類(lèi)似，進(jìn)一步證實(shí)HA能夠抑制漆酶誘導(dǎo)E2的氧化和聚合。E2 二聚體和三聚體的產(chǎn)量在聚合反應(yīng)前期逐漸增加，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且添加HA 處理組中E2 二聚體和三聚體的產(chǎn)量下降較明顯（圖4b 和圖4c），主要是由于E2 二聚體仍具有酚羥基官能團(tuán)，它們可繼續(xù)作為酶促反應(yīng)底物被轉(zhuǎn)化為E2三聚體、四聚體、低聚物和高聚物。E2 四聚體的產(chǎn)量變化如圖4d 所示，在缺乏HA 的反應(yīng)體系中，3 h 內(nèi)E2 四聚體的產(chǎn)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，而存在HA時(shí)E2四聚體的產(chǎn)量先增加后迅速下降。同理，圖5 和圖6 分別展示了HA對(duì)漆酶誘導(dǎo)聚合反應(yīng)中EE2 自聚物和BPA 自聚物相對(duì)豐度的影響，結(jié)果類(lèi)似于E2 自聚物的產(chǎn)量變化。Qin 等[29]報(bào)道指出，F(xiàn)e3+飽和的蒙脫土能夠催化E2 生成低聚物，其生物有效性和流動(dòng)性顯著低于E2，所形成的低聚物的產(chǎn)量在2 h內(nèi)迅速增加，之后緩慢下降。可見(jiàn)，添加HA 有效降低了漆酶誘導(dǎo)雌激素自聚物的產(chǎn)量，這可能是因?yàn)镠A 與雌激素及其自聚物發(fā)生共聚合反應(yīng)，形成雌激素-HA共聚合產(chǎn)物。

圖4 漆酶誘導(dǎo)聚合反應(yīng)中E2低聚物的形成動(dòng)力學(xué)Figure 4 Formation kinetics of E2 self-oligomers in the absence and presence of HA during laccase-induced polymerization

圖5 漆酶誘導(dǎo)聚合反應(yīng)中EE2低聚物的形成動(dòng)力學(xué)Figure 5 Formation kinetics of EE2 self-oligomers in the absence and presence of HA during laccase-induced polymerization

圖6 漆酶誘導(dǎo)聚合反應(yīng)中BPA低聚物的形成動(dòng)力學(xué)Figure 6 Formation kinetics of BPA self-oligomers in the absence and presence of HA during laccase-induced polymerization

2.4 漆酶誘導(dǎo)雌激素-HA共聚合的作用機(jī)制

漆酶催化雌激素-HA 聚合反應(yīng)的作用機(jī)理如圖7所示（以E2作為代表性雌激素）。首先，漆酶能夠誘導(dǎo)雌激素和HA 發(fā)生單電子氧化，形成不穩(wěn)定的活性自由基中間體，與此同時(shí)將1 個(gè)分子氧還原成2 個(gè)分子水[20]。隨后，這些不穩(wěn)定的活性中間體在酶促反應(yīng)位點(diǎn)之外通過(guò)C—C、C—O—C 或C—N—C 鍵共價(jià)結(jié)合，生成大分子的雌激素二聚體或HA 二聚體[31]。由于二聚體仍保留著酚羥基官能團(tuán)，它們可繼續(xù)作為漆酶的催化底物，被進(jìn)一步氧化聚合成三聚體、四聚體、低聚物和高聚物等[29]。此外，雌激素也會(huì)與HA 發(fā)生共聚合反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的雌激素-HA共聚合產(chǎn)物[32-33]。雌激素聚合物的形成不僅有效降低了母體化合物的生物毒性，也增加了環(huán)境中有機(jī)碳的儲(chǔ)備[18，21，26]。

圖7 漆酶誘導(dǎo)E2-HA共聚合的作用機(jī)制Figure 7 Laccase-started the co-polymerization mechanisms of E2 and HA

3 結(jié)論

（1）變色栓菌漆酶能夠高效氧化和去除雌激素，添加HA抑制了17β-雌二醇（E2）和17α-炔雌醇（EE2）的轉(zhuǎn)化，但促進(jìn)了雙酚A（BPA）的去除。

（2）漆酶誘導(dǎo)雌激素單電子氧化形成二聚體、三聚體和四聚體等低聚物，腐植酸（HA）能夠與長(zhǎng)鏈BPA自聚物快速發(fā)生共聚合反應(yīng)，從而維持漆酶催化活性和穩(wěn)定性。

（3）雌激素自聚物的產(chǎn)量隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，添加HA 有效降低了雌激素自聚物的產(chǎn)量。

（4）漆酶誘導(dǎo)雌激素-HA 發(fā)生共聚合反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的C—C、C—O—C 或C—N—C 共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物；所形成的聚合產(chǎn)物顯著降低了母體化合物的生物毒性。