腐植酸淋洗對重金屬污染土壤微生物群落結構影響研究

方明智，唐思琪，孫煜璨，陳坦，張冰，劉翼飛，楊婷*

（1.中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081；2.生態環境部土壤與農業農村生態環境監管技術中心，北京 100012）

隨著工業化和城市化進程加快，我國土壤重金屬污染形式日益嚴峻并引發廣泛關注[1]。2014 年《全國土壤污染狀況調查公報》指出，我國土壤總超標率為16.1%，重金屬是引發土壤污染的典型污染物[2]。土壤中的重金屬不能生物降解，可對土壤理化性質和微生物群落結構產生危害，還可以進入食物鏈并最終在人體中積累，對人類健康和環境構成巨大威脅[3-4]。

常用的土壤重金屬修復技術主要包括土壤淋洗、化學鈍化、植物修復和微生物修復等，其中土壤淋洗被認為是最有效、快速且經濟的技術之一[5]。土壤淋洗可通過溶解、絡合、離子交換等作用，將土壤中的重金屬污染物轉移到淋洗液中，從而降低土壤中重金屬污染物含量[6]。常用的淋洗劑主要有以下類型：無機酸（如鹽酸、硫酸、硝酸等）；合成有機螯合劑（如EDTA、DTPA、EDDS等）；天然螯合劑（如腐植酸、檸檬酸、酒石酸等）[7]。無機酸和合成有機螯合劑具有較高的金屬去除效率，但無機酸會酸化土壤，改變土壤結構，降低土壤肥力和微生物活性；合成有機螯合劑具有較低的生物降解性，可能對地下水質量和土壤微生物健康產生不利影響[8]。因此，使用環境友好型且淋洗效率高的淋洗劑對淋洗技術的工程實踐具有重要意義。

腐植酸是一種天然有機大分子，其富含多種活性官能團，如羧基、酚羥基、羰基和酮基等，可以通過絡合、離子交換、氧化還原及靜電作用等與重金屬發生相互作用[9]。多位研究者已將腐植酸作為天然螯合劑用于重金屬污染土壤淋洗并取得了良好的淋洗效果，如Yang 等[10]發現人工合成腐植酸可以將土壤中的Cu、Zn、Ni 和Pb 分別去除45.2%、34.6%、42.2%和15.6%；Meng 等[11]用腐殖質淋洗土壤后降低了36.8%的Cd 濃度。此外，腐植酸作為土壤有機質的主要組成物質，其作為淋洗劑施用被認為不會引入二次污染，因此，腐植酸被認為是一種環境友好型土壤淋洗劑[12]。

土壤微生物在陸地生態系統中的幾乎所有生物地球化學循環過程中都發揮著關鍵作用[13]，其群落數量、結構和多樣性易受到環境因素影響，被認為是衡量土壤環境質量與生態功能的重要指標。土壤淋洗技術雖然可以去除部分重金屬，但是可能會帶來重金屬的活化、養分的流失、淋洗劑的殘留等一系列問題，進而可能影響土壤的微生物群落結構[14]。但是目前針對淋洗技術的研究主要側重淋洗效果、重金屬形態變化與其對土壤理化性質的影響，針對淋洗后土壤微生物群落結構變化及其對環境因子的響應機制研究較少，無法在微觀尺度評價淋洗技術的環境效應[15-16]。基于此，本文研究了腐植酸淋洗Cd、Pb、Zn復合污染土壤后重金屬的形態和活性變化，探究了淋洗對土壤微生物群落多樣性和組成結構的影響，闡明了微生物群落的變化對土壤環境因子的響應機制，以期為化學淋洗修復重金屬污染土壤的生態安全性評價提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試劑

供試土壤取自石嘴山市某農田的表層（0~20 cm）土壤，經自然風干后過2 mm 篩保存備用。該土壤基本性質如下：pH 為8.54±0.02，土壤有機碳（SOC）含量為6.10%±0.29%，土壤氨氮（NH+4-N）含量為5.69±0.36 mg·kg-1，總Cd含量為6.71±0.26 mg·kg-1，總Pb含量為265.44±4.77 mg·kg-1，總Zn 含量為856.81±5.49 mg·kg-1。依據《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018），供試土壤中Cd含量是風險篩選值的11.18 倍，Zn 含量是風險篩選值的2.86倍，Pb含量是風險篩選值的1.56倍。

實驗所用腐植酸購自廣東翁江化學試劑有限公司（該腐植酸為煤基腐植酸，純度為98%，C、H、N、O含量分別為37.13%±0.47%、2.40%±0.04%、1.07%±0.01%、59.40%±0.52%），其余試劑購自上海麥克林生化科技股份有限公司，均為分析純。

1.2 土壤淋洗與培養

基于課題組前期研究，淋洗條件設置為液固比為40∶1，淋洗劑濃度為1 500 mg·L-1，腐植酸用0.5 mol·L-1NaOH 充分溶解后將其pH 調節為9，淋洗溫度為25 ℃，淋洗時間為6 h[10]。淋洗結束后，將離心后土壤放入恒溫振蕩培養箱（25 ℃）中培養，培養時間為30 d，期間每3 d 向土壤中添加適量高純水，使土壤含水率保持在田間持水量的70%左右（土壤田間持水量為16.7%±1.7%）。對照組土壤為不進行淋洗操作的原始土壤。在淋洗結束當天、培養期第3、7、15、30 天采集土壤鮮樣進行DNA 提取用于微生物群落結構信息分析，其余土壤自然風干并通過2 mm 篩用于測定重金屬形態與土壤理化性質。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 土壤重金屬形態與基本理化性質

采用改進BCR 連續提取法提取對照組，土壤淋洗當天及其淋洗后第3、7、15、30 天測定土壤重金屬不同形態含量。提取順序為酸提取態（F1）、可還原態（F2）、可氧化態（F3）與殘渣態（F4）[17]，各形態重金屬含量采用ICP-OES（Prodigy7，LeemanLabs，美國）測定；土壤pH 依據HJ 962—2018 測定；SOC 依據HJ 615—2011測定；土壤NH+4-N 含量依據HJ 634—2012測定。根據土壤淋洗后時間不同，分別記為淋洗后當天（AW 0），淋洗后3 d（AW3），淋洗后7 d（AW7），淋洗后15 d（AW15），淋洗后30 d（AW30）。

1.3.2 樣品16S rRNA基因高通量測序

提取原始土壤和淋洗后第3、7、15、30 天的土壤微生物DNA，擴增區為16S rRNA 基因的V4 區。PCR擴增使用的前引物為515F（5'-GTGCCAGCMGCCGC?GGTAA-3'），反 向引 物為806R（5'-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3'）。完成PCR 擴增后，對PCR 產物進行凝膠純化，純化后的產物通過Illumina MiSeq平臺完成16S rRNA 基因測序。通過Galaxy 平臺對獲得測序的原始數據完成數據的預處理。

1.4 數據分析

采用SPSS 26 進行單因素方差（ANOVA）分析，比較各處理間的顯著性差異。群落組成和聚類分析、主坐標分析（PCoA）通過R語言“vegan”包實現。共現網絡分析基于Pearson 相關性分析（設置閾值R>0.6，P<0.05），通過R 語言“igraph”包，構建連接矩陣，并得到網絡節點、邊數據和部分拓撲參數，將“igraph”包得到的graphml 格式文件導入Gephi 0.9.2 軟件進行可視化，圖片中不同顏色代表不同微生物網絡模塊。Mantel test 分析通過R 語言“linkET”包實現，用原始微生物OTU代表群落組成，微生物α多樣性代表群落多樣性。

2 結果與討論

2.1 腐植酸淋洗前后土壤重金屬總量與形態分布變化

腐植酸淋洗前后土壤中Cd、Pb 和Zn 總量和形態分布變化如圖1 所示。腐植酸淋洗后土壤中的Cd 和Zn 含量顯著降低（P<0.05），分別降低了40.5%和26.5%，說明腐植酸淋洗可以有效去除土壤中Cd 和Zn；淋洗后Pb 含量未顯著降低（P>0.05），主要因為原土中Pb主要以殘渣態（F4）存在（圖1a），可遷移性差，因此較難被淋洗去除。

圖1 腐植酸淋洗前后土壤中Cd、Pb、Zn的總量（圖a）和形態分布（圖b）變化Figure 1 Changes of the total concentration（a）and speciation distribution（b）of Cd，Pb，and Zn in the soil before and after humic acid washing and during incubation

陽離子型重金屬主要以4 種形態存在于土壤中，以酸提取態（F1）存在的重金屬遷移性強且易被植物吸收利用[18]；重金屬可還原態（F2）主要結合在Fe-Mn氧化物上，在厭氧或缺氧環境中不穩定，因此可還原態有潛在的生物可利用風險[19]；可氧化態（F3）比可還原態穩定；殘渣態（F4）化學性質最穩定，被固定在土壤中難以遷移、轉化和被吸收。因此，土壤中重金屬的可氧化態和殘渣態含量越高，重金屬越穩定。由圖1b 可知，淋洗前Cd、Pb 和Zn 主要以殘渣態存在于土壤中。腐植酸淋洗后當天土壤中酸提取態Cd 和Zn所占比例分別提高了7個和12個百分點，說明腐植酸淋洗過程可以活化土壤中Cd 和Zn，提高其可遷移性，且腐植酸淋洗對Cd的活化效果更顯著，這可能是因為腐植酸含有多種活性官能團（如羧基、酚羥基等），可與重金屬離子結合形成可溶態的有機-金屬復合物，進而提高了其可遷移性[20]。淋洗結束后，隨著時間推移，可氧化態和殘渣態Cd 和Zn 的百分比逐漸提高，與淋洗結束當天相比，第30 天時分別提高了9 個和8 個百分點，說明其可遷移性與生物可利用性逐漸降低。淋洗后有部分腐植酸留存于土壤中，Cd可以與腐植酸中的酚羥基、羧基形成Cd2+-腐植酸配合物，使其具有類似金屬-氧絡合物的穩定性[21]；Zn主要通過離子交換與腐植酸結合降低可遷移性[22]。對于Pb，與對照相比，腐植酸淋洗當天酸提取態和可還原態降低了4 個百分點，第30 天時降低了6 個百分點。Pb 不僅可以與殘存的腐植酸絡合，還可以與腐植酸-礦物復合體形成共沉淀，因此可氧化態和殘渣態Pb含量顯著提高[23]。

除腐植酸外，研究者目前也利用其他天然化合物（如檸檬酸、酒石酸等）進行土壤淋洗研究，Wuana等[24]使用檸檬酸和酒石酸淋洗土壤后Cd 分別降低了38.4%和19.3%，Wang 等[25]使用亞氨基二琥珀酸淋洗土壤后Cd 和Zn 的含量分別降低了24.1%和25.4%，通過對比可發現腐植酸用作土壤淋洗劑時對Cd有較好的去除效果。此外，為了避免二次污染，在實際應用中需重點考慮如何進一步處理含有高濃度重金屬的淋洗液。近期學者的研究證明可以使用硫化鈉（Na2S）、乙基黃原酸鉀（PEX）、二甲基二硫代氨基甲酸鈉（DTC）等作為重金屬沉淀劑處理土壤淋洗液，同步去除土壤淋洗液中絡合態重金屬且實現淋洗液的回收[26]。如Na2S 中的S2-可以與淋洗液中的Cd2+和Pb2+生成圓餅片狀結構沉淀，其中包含CdS 和PbS 等物質[26]。在淋洗成本方面，Zhang 等[27]總結了常用的土壤淋洗劑在去除Cd 時的淋洗成本，發現使用腐植酸的成本遠低于EDTA、EDDS 和皂素等淋洗劑，因此腐植酸可被用作綠色、高效和低成本的土壤淋洗劑。

2.2 腐植酸淋洗前后土壤理化性質的變化

腐植酸淋洗前后土壤pH，SOC 和NH+4-N 的含量變化見表1。土壤pH 值除了在淋洗后第7 天顯著降低外（P<0.05），其他時間與對照相比均無顯著差異（P>0.05），這是因為腐植酸與土壤中各種陽離子結合形成腐植酸-腐植酸鹽相互轉化的緩沖系統，對土壤的酸堿度起到調節作用[28]。與原土壤相比，土壤SOC 含量在淋洗當天顯著提高了15.0%（P<0.05），說明腐植酸殘留可以提升土壤有機質含量；淋洗后一直到培養結束土壤SOC均無顯著變化，這是由于腐植酸相比其他常被用作淋洗劑的天然小分子酸（如檸檬酸、酒石酸、草酸等）性質穩定、不易分解，具有良好的生物穩定性，可以將SOC 含量穩定在一定水平上[29]。淋洗過程會導致大量NH+4-N 被洗脫，土壤中NH+4-N 含量在淋洗當天與原土壤相比下降了85.4%[30]。淋洗后，NH+4-N含量隨培養時間增加而逐漸增大，淋洗后第30天NH+4-N含量是淋洗后當天的3.01 倍。這是由于腐植酸中含量較高的N元素可在土壤中溶解為NH+4-N，使土壤中NH+4-N含量逐漸提高[31]。

表1 腐植酸淋洗前后與培養期間土壤化學性質變化Table 1 Changes of soil chemical properties before and after humic acid washing and during incubation

2.3 腐植酸淋洗前后土壤微生物群落結構變化

2.3.1 土壤微生物群落多樣性變化特征

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，相較于植物和動物，土壤微生物群落數量、結構和多樣性易受到環境因素影響，被認為是衡量土壤環境質量與生態功能的重要指標，可用于預測土壤生態系統及環境質量的變化，實時反映土壤污染狀況[32-33]。在OTU 水 平上，本 研 究選 取Chao1 指 數、ACE 指 數、Shannon 指數和Simpson 指數來評價腐植酸淋洗前后土壤微生物的α 多樣性。Chao1 指數和ACE 指數可反映微生物群落的豐富度，Shannon 指數和Simpson指數用于衡量微生物群落的多樣性。與對照組相比，ACE和Chao1指數在淋洗后的土壤第3、7天均顯著降低（表2，P<0.05），淋洗后第7 天分別降低了9.15%和9.66%；隨后ACE和Chao1指數均顯著回升，淋洗后第30天時恢復到與對照相比無顯著差異水平（P>0.05）。這可能是因為淋洗過程導致部分細菌被洗脫，進而細菌豐富度水平降低；淋洗后淋洗液殘留物中的微量不穩定組分會在短期內迅速降解，作為細菌群落的能量來源，促進其生長，因此ACE 和Chao1 指數在第30 天時恢復到原來水平[34]。Shannon 和Simpson 指數在淋洗后培養期間顯著提高（P<0.05），但是數值波動很小。以上結果表明土壤淋洗會洗脫微生物，但是土壤中殘留的腐植酸可以為微生物生長提供養分，提高細菌群落的豐富度和多樣性。

表2 腐植酸淋洗前后與培養期間土壤中細菌的α多樣性指數變化Table 2 Change of α diversity index of soil bacteria before and after humic acid washing and during incubation

主坐標分析（PCoA）樣本間的空間距離可以表示細菌群落結構的差異程度，進而可衡量群落的β多樣性。基于Bray-Curtis 距離矩陣的PCoA 分析的前兩軸解釋度分別為64.5%和16.2%，與對照相比，腐植酸淋洗對土壤細菌群落有明顯的影響，微生物群落的β多樣性隨著淋洗后培養時間的不同而不同（圖2）。因此，土壤細菌群落的差異取決于腐植酸是否淋洗以及淋洗后培養時間的長短。

圖2 不同條件下細菌群落的主坐標分析（PCoA）圖Figure 2 Principal coordinate analysis（PCoA）analysis of the bacteria community for different treatments

2.3.2 土壤微生物群落組成與聚類分析

圖3 為淋洗前后土壤細菌門和屬水平上的組成與聚類圖。在門分類水平上（圖3a），土壤中微生物群落以Proteobacteria（37.8%~46.6%）、Bacteroidetes（12.2%~20.2%）、Actinobacteria（9.1%~24.1%）、Chlo?roflexi（4.6%~15.1%）和Acidobacteria（1.9%~8.0%）等為主，與前人對土壤優勢菌門的研究一致[35]。研究表明相對豐度最高的Proteobacteria 對土壤多種環境功能有重大影響，如研究者已經證實大部分的α-Pro?teobacteria 有利于土壤的固氮、有機質分解和植物生長[16]，Proteobacteria 菌門中還具有多種擁有涉及重金屬抗性或固定化的重金屬氧化酶基因的成員[36]。在腐植酸淋洗后的培養過程中，不同培養時間下各個門的相對豐度均存在差異（圖3b）。淋洗后，土壤中Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Fibro?bacteres、Armatimonadetes 等菌群的相對豐度增加；Actinobacteria、Firmicutes 等菌群的相對豐度降低。Chloroflexi 在有機物降解和有效Cd 沉淀中具有重要意義，它們可以與甲烷代謝微生物群進行共養相互作用[35]。Acidobacteria 對高濃度Cd 耐受性較強，也是土壤中重要的細菌群落，可以降解植物殘體，參與光合作用和單碳化合物代謝等多種生化行為[37-38]。Fir?micutes 攜帶許多金屬抗性基因，腐植酸淋洗降低了土壤中重金屬的污染水平，導致特征微生物群Fir?micutes 的相對豐度下降[39]。此外，將相對豐度前15的屬水平細菌進行聚類分析（圖3c），發現Pseudar?throbacter、Planococcus、Brevundimonas、Pontibacter等屬的相對豐度在淋洗過程中均有所降低，而Thioba?cillus、OLB13、Flavisolibacter的相對豐度淋洗后逐漸上升。研究發現Brevundimonas可以用于重金屬的生物修復，淋洗后土壤重金屬含量下降導致Brevun?dimonas豐 度降低[40]。Thiobacillus和OLB13均可參 與土壤的反硝化作用，其相對豐度的提高可以促進土壤的氮循環[41-42]。Flavisolibacte可以催化過氧化氫，以保護自身和宿主植物免受重金屬的氧化[43]。

2.3.3 土壤微生物群落網絡分析

微生物共現網絡已被廣泛應用于土壤中關鍵模塊和物種的識別。網絡拓撲屬性可用于描述不同物種或物種與環境因素之間相互作用的強度和復雜性[35]。例如，生態網絡的模塊生態網絡中的關鍵物種（keystone）所執行的特殊代謝功能不僅可以驅動微生物群落的形成過程，還能維持微生物群落的穩定性[44]。本研究采用Gephi軟件對淋洗前后土壤微生物網絡做可視化處理（圖4a~圖b），并計算微生物網絡的拓撲特征（表3）。在腐植酸淋洗后，土壤微生物網絡的節點數量和邊數量提高，平均路徑距離降低，這表明淋洗提高了微生物網絡的復雜性，同時使網絡中的物種聯系更加密切[13]；網絡模塊量增加表明淋洗后的土壤微生物結構更有組織性。

表3 土壤淋洗前后微生物網絡的主要拓撲特征Table 3 Main topological properties of microbial communities in soil before and after washing

圖4 淋洗前（a）與淋洗后（b）土壤微生物群落OTU水平上的共現網絡和網絡節點的分類（c）Figure 4 Co-occurrence network of microbial communities before（a）and after washing（b）and classification of nodes within networks（c）in soils（OTU levels）

進一步通過模塊內連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）兩個拓撲參數來評估共現網絡中每個節點的作用（圖4c）。Zi或Pi值較高的節點被定義為關鍵分類單元，包括模塊樞紐（Zi≥2.5，Pi<0.62）、連接器（Zi<2.5，Pi≥0.62）和網絡樞紐（Zi≥2.5，Pi≥0.62）[45]。在對照土壤的微生物網絡結構中僅識別到兩個模塊樞紐，而在淋洗后土壤的微生物網絡結構中識別到1 個起關鍵作用的網絡樞紐、4個模塊樞紐和16個連接器。對網絡樞紐進行種屬分析后鑒定為Rubellimicrobium，該細菌作為土壤功能微生物可以分泌碳水化合物來抵抗重金屬脅迫[46]。此外，模塊樞紐中的Gemmatimonas可以轉化和分解土壤有機質[47]。連接器包括Plano?coccus、Ohtaekwangia、Ellin6067、Caenimonas、Alter?erythrobacter等細菌。其中，Pseudomonas產生的生物表面活性劑可以與重金屬形成絡合物[48]，Altererythro?bacter對土壤中的Cd 具有較高的耐受性[49]，Caenimo?nas可以產生尿素酶，為植物生長固氮[50]。

微生物的網絡結構需要依靠一些十分活躍的物種進行信息交換或者產生中間代謝產物以維持龐大而復雜的模塊結構，較多的模塊樞紐可以提高微生物群落的交換效率，較多的連接器可以提高群落的穩定性[51]。腐植酸淋洗后土壤微生物網絡結構的模塊樞紐和連接器增加，表明淋洗后土壤微生物將會更高效地進行物質傳輸和利用，同時抵御環境擾動的能力也更強。

2.4 土壤中細菌群落與環境因子的相關性分析

本研究基于Mantel test 分析（圖5），進一步探究了生物可利用態重金屬、土壤理化性質與微生物群落之間的相關性。結果表明，土壤中酸提取態Pb 含量與SOC 和NH+4-N 含量呈顯著負相關（P<0.05），酸提取態Zn 含量與SOC 含量呈顯著正相關（P<0.05）。土壤中NH+4-N、酸提取態Pb 和酸提取態Zn 與細菌群落組成存在顯著相關性（P<0.05），酸提取態Zn 與細菌群落多樣性存在顯著相關性（P<0.05）。腐植酸淋洗顯著提高了酸提取態Zn 含量，說明腐植酸淋洗引起的土壤生境變化與細菌群落的組成和多樣性密切相關[52]，已有研究表明土壤中重金屬的脅迫增強會對土壤微生物群落的生長、存活、多樣性、生物量等生態功能產生不利影響[53]。本研究進一步對門水平上細菌優勢類群與環境因子的關系進行Pearson 相關性分析（表4）。結果表明，細菌中Acidobacteria、Chloroflexi和Armatimonadetes 與土壤的酸提取態Pb 和酸提取態Zn 呈顯著負相關（P<0.05）。Gemmatimonadetes 和Deinococcus-Thermus 與土壤NH+4-N 呈顯著正相關（P<0.05）。先前研究證實Gemmatimonadetes 與土壤養分呈顯著正相關，因此Gemmatimonadetes 的相對豐度提高可能與腐植酸淋洗期間土壤SOC 與NH+4-N含量的提高有關[54]。

表4 門水平優勢菌群與土壤化學性質的Pearson相關性分析Table 4 Pearson correlations of dominated species at the phylum level to chemical properties in soil

圖5 土壤化學性質與微生物群落組成和多樣性的Mantel test 分析Figure 5 Mantel test analysis of soil chemical properties and microbial community composition and diversity

綜上，腐植酸淋洗后改變土壤中酸提取態Pb、酸提取態Zn 和NH+4-N 含量等環境因子，環境因子改變會驅動土壤中微生物群落結構變化。

3 結論

（1）腐植酸淋洗可去除土壤中的Cd 和Zn，對Pb的去除效果較差。淋洗后土壤中的Cd 和Zn 被活化，可遷移性提高；Pb 的可氧化態和殘渣態比例升高，可遷移性降低。

（2）腐植酸淋洗與殘留能顯著改變土壤微生物群落結構。淋洗后培養期間，細菌群落豐富度先降低后升高，群落多樣性提高；Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Fibrobacteres、Armatimonadetes 等菌群的相對豐度增加，Actinobacteria、Firmicutes 等菌群的相對豐度降低。

（3）腐植酸淋洗后土壤微生物的相互作用和網絡復雜性提高；淋洗后土壤微生物網絡結構的模塊樞紐和連接器增加，土壤微生物將會更高效地進行物質傳輸和利用，同時強化了抵御環境擾動的能力。

（4）腐植酸淋洗會改變土壤中酸提取態Pb、Zn的含量和NH+4-N 含量等環境因子，其變化可驅動微生物群落結構發生變化。