土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌的分析方法及賦存形態
2023-06-21 07:55:26古鵬湯佳豪趙慶慶王磊磊王加寧盧媛張聞
農業環境科學學報 2023年5期
古鵬，湯佳豪，趙慶慶，王磊磊，王加寧，盧媛，張聞*
（1.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院生態研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250103；2.南開大學環境科學與工程學院，環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300350）
含氧多環芳烴（oxygenated polycyclic aromatic hy?drocarbon，OPAHs）是在化石燃料和生物質燃燒過程中或通過母體多環芳烴（PAHs）的光、化學和生物反應形成的一類新污染物，含有羰基、羥基或羧基等官能團[1-3]。OPAHs 可通過其極性官能團與土壤固相存在較強的相互作用，其穩定性高于其他含有硝基或烷基等基團取代的PAHs衍生物，因此OPAHs被稱為“持久性終端代謝物”[4]。OPAHs 是可直接作用的誘變劑和致癌物，其生物毒性大于其母體PAHs，在不同環境基質均有檢出，在部分地區其濃度高于衍生它們的親代PAHs[1，4-5]。目前，人們在檢測PAHs 類污染物時常集中于母體PAHs，對于和其同時產生或代謝產生的OPAHs關注度較低，且國內外對于OPAHs的研究主要集中于OPAHs的總量分析、源解析及毒性分析等[6]，其賦存形態及生物有效性分析的相關報道較少。
OPAHs 在土壤中的賦存狀態會影響其環境行為，進而影響其生態效應及環境風險，因此有必要對其賦存形態進行研究。連續提取法[7-11]被報道用于研究土壤中PAHs、脂肪烴等有機污染物的賦存形態，該法通過依次采用不同的提取步驟和試劑將與不同土壤組分結合的有機污染物區分為不同賦存形態，其中較詳盡的分類包含生物有效態、難解吸態、富里酸結合態、胡敏酸態、粗胡敏素結合態、礦物結合態、干酪根結合態等7 種賦存形態，生物有效態與難解吸態的含量加和為有機溶劑提取態含量[10]。OPAHs 作為結構與PAHs 相似的有機污染物，其賦存形態分析亦適用于該法。連續提取法涉及從土壤相、水相和羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPCD）相中提取目標物的過程[7-9]，其中有機溶劑提取態、胡敏酸結合態、粗胡敏素結合態和干酪根結合態涉及從原始土壤或土壤組分（即土壤相）中提取的過程；富里酸結合態和礦物結合態涉及從不同試劑處理后含富里酸或礦物組分溶液（即水相）中提取的過程；生物有效態涉及從HPCD 溶液（即HPCD 相）中提取的過程。然而OPAHs 在以上各相中提取及測定方法尚不完備。Wietzoreck等[12]采用二氯甲烷-索式提取-氣相色譜質譜聯用法測定土壤中的OPAHs，Chibwe等[13]采用加壓液體萃取-氣相色譜質譜聯用法測定土壤中的OPAHs，Hua 等[14]采用固相萃取-超高效液相色譜質譜聯用法測定尿液中的羥基化PAHs。但索氏提取時間較長、有機溶劑消耗較大，加壓液體萃取所采用的儀器昂貴，尚未普及，且測定采用氣質或液質等色質聯用儀器成本較高。因此，建立一種簡便、高效、成本低廉的OPAHs提取及分析方法對研究OPAHs賦存形態具有重要意義。超聲提取法和液液萃取法因其簡便的操作和低廉的成本被廣泛用于PAHs 在土壤相和水相中的提取，高效液相色譜（high performance liq?uid chromatography，HPLC）法是我國環保部發布的PAHs 的標準測定方法[《土壤和沉積物多環芳烴的測定/高效液相色譜法》（HJ 784—2016）]。于田田等[15]針對土壤/沉積物中的1-羥基芘建立了超聲萃取-HPLC 測定方法。Martínez-Pérez-Cejuela 等[16]采用固相萃取-HPLC測定水相中硝化和氧化PAHs。曹笑語等[17]對OPAHs分析方法的研究進展進行了綜述，認為氣質或液質等色質聯用法為目前主要的分析方法，關于HPLC分析方法的報道則比較有限，OPAHs儀器分析方法仍相對缺乏，更多種類的OPAHs在不同環境基質中簡便且低成本的提取及測定方法有待建立和完善。
9-芴酮和9，10-蒽醌被多篇文獻報道是土壤中豐 度 最 高 的OPAHs[1，18-20]，本 研 究 以 這2 種 物 質 為OPAHs 代表物，建立其HPLC 分析方法及不同環境基質中的提取方法，利用連續提取法分析土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌的生物有效態、難解吸態、富里酸結合態、胡敏酸態、粗胡敏素結合態、礦物結合態、干酪根結合態等7 種賦存形態的含量，探究土壤中不同OPAHs 形態賦存特征和自然衰減規律，旨在為控制土壤OPAHs污染提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 供試材料
9-芴酮、9，10-蒽醌購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>98.0%，其結構式如圖1 所示。二者分子量分別為180.21 和208.22，辛醇-水分配系數分別為3.58 和3.39，在25 ℃時的蒸氣壓分別為5.72×10-5Pa 和1.16×10-7Pa[21]。供試土壤采自山東濟南（36°42'29″N，117°04'40″E），土地利用現狀為耕地，土壤質地為壤土。其理化性質：pH 為8.25，有機質含量為5.2%，陽離子交換量為22.6 cmol·kg-1，總氮、總磷及總鉀含量分別為2.28、0.96 g·kg-1和13 g·kg-1。土壤在室內自然陰干、磨碎過2 mm 篩后，向土壤中加入適量9-芴酮和9，10-蒽醌的混合丙酮儲備液制備污染土壤。根據參考文獻報道的實際污染土壤中[22]及相關方法學研究中[23]的OPAHs 含量，本實驗9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的含量都設置為20 mg·kg-1，即二者加和的OPAHs 污染水平為40 mg·kg-1。將污染土壤置于通風櫥中2 d，每隔4 h 攪拌一次，使丙酮充分揮發后備用。
圖1 9-芴酮及9，10-蒽醌分子結構式Figure 1 Molecular structure of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone
1.2 9-芴酮和9，10-蒽醌的HPLC分析方法構建
分別配制20 mg·L-1的9-芴酮和9，10-蒽醌丙酮溶液，采用二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）進行全波長掃描（掃描范圍190~400 nm）。全波長掃描使用的HPLC 條件為：流動相為甲醇∶水=9∶1，流速1 mL·min-1，進樣量2 μL，色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃。根據信號響應值，9-芴酮和9，10-蒽醌的最適檢測波長分別為258 nm 和252 nm。在以上檢測波長下，對HPLC 流動相配比及流速進行優化，篩選使得目標物的出峰時間合適，峰形尖銳、對稱且分離度較好的流動相配比及流速。在此基礎上建立OPAHs 測定外標曲線，配制1、2、5、10 mg·L-1和20 mg·L-1的9-芴酮和9，10-蒽醌系列混合標準溶液，進樣分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。
1.3 9-芴酮和9，10-蒽醌在不同基質中的提取方法構建
采用1.1 節制備的OPAHs 污染土進行超聲提取實驗，萃取劑選用二氯甲烷、甲醇和甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）。稱取2 g 土，向其中加入10 mL 萃取劑，混合均勻后，超聲10 min（功率500 W，頻率40 kHz，25 ℃），3 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉移至50 mL 雞心瓶中。上述操作重復3 次，合并萃取液至雞心瓶中。將雞心瓶旋蒸至近干，加入2 mL 甲醇定容，超聲促溶后，溶液過0.45 μm 尼龍過濾器轉移至自動進樣小瓶中進行HPLC 檢測，測定回收率，確定合適的萃取劑。
制備含有20 mg·L-1OPAHs 的水溶液及HPCD 溶液，其中9-芴酮和9，10-蒽醌質量比例為1∶1。萃取劑選用二氯甲烷和甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）。分別量取20 mL OPAHs 水溶液和HPCD 溶液于分液漏斗中，加入10 mL 萃取劑，進行液液萃取，然后將萃取液轉移至50 mL 雞心瓶中。上述操作重復3 次，合并萃取液至雞心瓶中。其余操作同上。
1.4 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌賦存形態實驗設計
分別稱取10 g 1.1 節制備的OPAHs 污染土壤于多個40 mL 棕色玻璃瓶中，加入無菌水使其含水率為20.0%，用封瓶膜封口后置于生化培養箱中，25 ℃培養，每6 d 稱量補水。在0、15 d 和30 d 進行有機溶劑提取態和生物有效態的提取與分析，并在30 d時進行全賦存形態的提取與分析。每個樣品設置3個重復。
1.5 土壤中不同賦存形態9-芴酮和9，10-蒽醌的提取方法
土壤中OPAHs 賦存形態包括生物有效態（F1）、難解吸態（F2）、富里酸結合態（F3）、胡敏酸結合態（F4）、粗胡敏素結合態（F5）、礦物結合態（F6）和干酪根結合態（F7）。常報道的有機溶劑提取態（FDCM）包含F1和F2，本實驗F1和FDCM分別單獨提取，通過FDCM與F1 差減得到F2，F3~F7 在FDCM提取結束后的土樣基礎上連續分步提取獲得。各態提取方法參照PAHs連續提取方法[7-8]，并基于1.3 節9-芴酮和9，10-蒽醌在不同基質中提取方法的最優結果對其進行改進，具體如下：
生物有效態（F1）：稱取1 g凍干土樣于玻璃瓶中，加入20 mL 用去離子水配制的50 mmol·L-1的HPCD水溶液，密封振蕩（25 ℃，150 r·min-1）提取20 h，離心10 min（3 000 r·min-1，4 ℃）。收集上清液，用10 mL的二氯甲烷液液萃取3次，合并萃取液至雞心瓶中。
有機溶劑提取態（FDCM）：稱取2 g 凍干土樣于玻璃瓶中，加入10 mL 甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V），混勻，超聲10 min（功率500 W，頻率40 kHz，25 ℃），離心10 min，將上清液轉移至50 mL 雞心瓶中。重復3次，合并萃取液至雞心瓶中。
富里酸結合態（F3）：將上一步有機溶劑提取結束后的土樣37 ℃干燥2 h，添加10 mL 2 mol·L-1的NaOH 溶液，混勻，水解2 h（100 ℃）。水解結束冷卻至室溫，離心10 min，沉淀用于提取粗胡敏素結合態（F5），上清液用于提取富里酸（F3）和胡敏酸結合態（F4）。收集上清液，并用少量NaOH 溶液潤洗土壤，離心后潤洗液與上清液合并。用6 mol·L-1的鹽酸溶液酸化上清液至pH<1，離心10 min，上清液為富里酸，沉淀為胡敏酸。將上清液轉移至分液漏斗用10 mL 二氯甲烷液液萃取，重復3 次，合并萃取液至雞心瓶中。
胡敏酸結合態（F4）：向上一步得到的胡敏酸樣品中加入無水硫酸鈉除水，加10 mL 甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）超聲提取10 min，重復3 次，合并萃取液至雞心瓶中。
粗胡敏素結合態（F5）：向富里酸結合態（F3）提取步驟中水解后的土樣中加入10 mL 甲醇，振蕩30 min，超聲10 min，離心收集上清液；然后依次用10 mL甲醇-二氯甲烷混合液（1∶1，V/V）、二氯甲烷和二氯甲烷提取，步驟同上。將所有提取物合并，用20 mL 蒸餾水液液萃取，重復4 次，合并有機相至雞心瓶中。提取后的土樣用于礦物結合態（F6）的提取。
礦物結合態（F6）：上一步得到的土樣37 ℃干燥2 h，轉移至50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 6 mol·L-1鹽酸溶液，振蕩12 h，離心收集上清液；加入10 mL 40.0%氫氟酸-鹽酸（1∶1，V/V），步驟同上。殘渣用2 mol·L-1鹽酸溶液潤洗，離心后與上清液合并。收集的上清液用10 mL二氯甲烷液液萃取，重復3次，合并萃取液至雞心瓶中。
干酪根結合態（F7）：對礦物結合態（F6）提取后的土樣，使用與提取粗胡敏素結合態（F5）相同的步驟進行處理，合并有機相至雞心瓶中。
將雞心瓶旋蒸至近干，加入2 mL 甲醇，超聲促溶后，溶液過0.45 μm 尼龍過濾器轉移至自動進樣小瓶中待測。
1.6 9-芴酮和9，10-蒽醌分析
9-芴酮和9，10-蒽醌分析基于1.2 節的實驗結果，具體為：通過HPLC 測定（安捷倫1260）。檢測條件為：流動相為甲醇∶水=9∶1，流速1 mL·min-1，進樣量2 μL，色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，DAD 檢測器，檢測波長252 nm（9，10-蒽醌）和258 nm（9-芴酮），檢測時間6 min。
1.7 數據分析
通過SPSS 19.0 軟件進行數據處理和單因素方差分析；使用Origin 2022制圖。
2 結果與分析
2.1 9-芴酮和9，10-蒽醌的分析方法
通過反復試驗流動相比例及流速，選擇等度流動相甲醇∶水=9∶1，流速為1.0 mL·min-1，可在6 min內實現2種OPAHs完全分離。在此條件下，得到的色譜峰窄而尖，峰型均良好，無雜質峰干擾，如圖2 所示。基于以上HPLC 測定條件，建立了9-芴酮和9，10-蒽醌的標準曲線，在1.00~20.00 mg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數R2達到0.999及以上，可滿足測試需求。
圖2 9-芴酮和9，10-蒽醌的高效液相色譜圖（檢測波長258 nm）Figure 2 High performance liquid chromatography chromatogram of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone（detection wavelength 258 nm）
2.2 9-芴酮和9，10-蒽醌的提取方法
土壤相中的9-芴酮和9，10-蒽醌通過超聲法進行提取，對比了3種萃取劑二氯甲烷、甲醇及甲醇-二氯甲烷混合溶液的萃取效率。土壤與萃取劑比例、超聲時間及超聲次數參考前期實驗室從土壤中提取PAHs 的方法[24]。水相及HPCD 相中的9-芴酮和9，10-蒽醌通過液液萃取法進行提取，對比了2 種萃取劑二氯甲烷和甲醇-二氯甲烷混合溶液的萃取效率。液液萃取的比例、次數等參照從水相提取PAHs 的方法[25]。各基質中9-芴酮和9，10-蒽醌的提取回收率如圖3 所示，對于土壤中這2 種OPAHs，使用混合萃取劑的提取效率最高，回收率為102.4%±0.8%（9-芴酮）和104.2%±3.4%（9，10-蒽醌），顯著高于以二氯甲烷及甲醇為萃取劑的回收率。對于水相和HPCD 相中的這2種OPAHs，使用二氯甲烷作為萃取劑回收率最高，9-芴酮的回收率分別為87.8%±0.7%和86.3%±3.8%，9，10-蒽醌的回收率分別為87.2%±0.3%和78.7%±2.4%。
圖3 土壤、水及HPCD相中的9-芴酮和9，10-蒽醌回收率Figure 3 Recovery of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone in the soil，water and HPCD
基于以上實驗結果，最終確定土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌最佳的提取條件為：以甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）為萃取劑，土壤與萃取劑比例為2 g∶10 mL，超聲時間10 min，超聲次數3 次。水相及HPCD 相中9-芴酮和9，10-蒽醌的提取條件為：以二氯甲烷作為萃取劑，待提取液與萃取劑比例為20 mL∶10 mL，液液萃取3次。
2.3 9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的賦存形態
圖4為土壤被9-芴酮和9，10-蒽醌污染1個月后的各賦存形態含量，圖5 為各賦存形態占總殘留量的比例。二者反映了這2 種OPAHs 賦存形態的分布特征。同一種賦存形態下2 種OPAHs 污染物9-芴酮和9，10-蒽醌的含量之和用∑OPAHs表示。
圖4 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌及∑OPAHs各賦存形態含量Figure 4 Contents of 9-fluorenone，9，10-anthraquinone and∑OPAHs in soil
圖5 土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌及∑OPAHs各賦存形態含量占比Figure 5 Fractions of each speciation of 9-fluorenone，9，10-anthraquinone and ∑OPAHs in soil
9-芴酮的F1~F7 各態殘留量分別為0.05、0.83、0、0.10、0.44、0 mg·kg-1和0.13 mg·kg-1，分別占其總殘留量的3.2%、53.5%、0、6.5%、28.4%、0 和8.4%。9，10-蒽醌的F1~F7 各態殘留量分別為0.36、2.53、0.14、0.13、1.06、0.06 mg·kg-1和0.67 mg·kg-1，分別占其總殘留 量 的7.3%、51.1%、2.8%、2.6%、21.4%、1.2% 和13.5%。∑OPAHs 的F1~F7 各態殘留量分別為0.41、3.36、0.14、0.23、1.50、0.06 mg·kg-1和0.80 mg·kg-1，分別占其總殘留量的6.3%、51.7%、2.2%、3.5%、23.1%、0.9%和12.3%。綜上可見，9-芴酮和9，10-蒽醌復合污染土壤中，9-芴酮各賦存形態殘留量排序：F2>F5>F7>F4>F1>F3 和F6（F3 和F6 未檢出）；9，10-蒽醌排序：F2>F5>F7>F1>F3>F4>F6；∑OPAHs排序：F2>F5>F7>F1>F4>F3>F6。培養1 個月后，9-芴酮的各態殘留量均低于9，10-蒽醌，9-芴酮、9，10-蒽醌、∑OPAHs的總殘留量分別為1.55、4.95 mg·kg-1和6.50 mg·kg-1，分別占初始投加量的7.8%、24.8%和16.3%。
F1 及F2 態OPAHs 分別易于或較易于被生物利用，可直接或間接反映其在土壤中的有效性。二者之和為有機溶劑提取態，亦稱為可提取態，9-芴酮和9，10-蒽醌可提取態含量之和為3.77 mg·kg-1，占這2 種OPAHs 在土壤中殘留總量的58.0%，為土壤中存在的主要形態。F3 至F7 各態之和為結合態，是殘留在土壤中不易被生物利用的部分，2種OPAHs結合態含量之和為2.73 mg·kg-1，占土壤中殘留總量的42.0%。其中，F3、F4、F5 和F7 分別對應與土壤有機質組分富里酸、胡敏酸、胡敏素和干酪根緊密結合無法被有機溶劑直接萃取的OPAHs，這4 種形態OPAHs 之和為2.67 mg·kg-1，占結合態含量的97.8%。
2.4 9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性的變化
近些年來國內外十分關注土壤中有機污染物的生物有效性[26-27]。本研究中F1 直接反映9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的生物有效性，FDCM是以往污染土壤調查中常用來表征污染物量的指標，因此對二者在30 d內的變化進行對比分析。
由圖6 可知，9-芴酮和9，10-蒽醌的F1 和FDCM態在0 d 到30 d 的過程中均呈降低趨勢，9-芴酮在0、15 d 和30 d 時F1 和FDCM態含量分別為9.56、0.08、0.05 mg·kg-1和14.85、1.86、0.88 mg·kg-1。9，10-蒽醌的相應含量分別為8.50、0.61、0.36 mg·kg-1和16.91、5.78、2.89 mg·kg-1。∑OPAHs相應含量分別為18.06、0.69、0.41 mg·kg-1和31.76、7.64、3.77 mg·kg-1。F1和FDCM在前15 d 降低極快，9-芴酮較0 d 分別降低99.2%和87.5%，9，10-蒽醌分別降低92.8%和65.8%，∑OPAHs分別降低96.2%和75.9%。F1 和FDCM在后15 d 降低趨勢減緩，9-芴酮較0 d 分別降低0.3%和6.6%，9，10-蒽醌分別降低2.9%和17.1%，∑OPAHs 分別降低1.5%和12.2%。
圖6 不同時間點土壤中9-芴酮和9，10-蒽醌的F1和FDCM含量Figure 6 Contents of F1 and FDCM of 9-fluorenone and 9，10-anthraquinone in the soil at different time
3 討論
3.1 不同基質中9-芴酮和9，10-蒽醌的萃取劑選擇
OPAHs 萃取劑需與OPAHs 具有較大的親和力，使其從土壤相或水相或HPCD 相進入萃取劑中，通過離心實現固液分離或靜置實現液液分層。由于羰基的存在，9-芴酮和9，10-蒽醌的極性大于母體PAHs[28]，提取時應選擇具有一定極性且能形成氫鍵的溶劑。二氯甲烷作為萃取劑對PAHs 有較好的提取效果，但二氯甲烷為弱極性溶劑，無法與OPAHs 形成氫鍵，單獨使用時回收率較低[15]。甲醇雖能與9-芴酮和9，10-蒽醌形成氫鍵，但是極性較強，對極性弱于甲醇的OPAHs 萃取率低；且甲醇黏度較大，擴散率較低，不易滲透至基質中與目標物結合，使目標物從基質中脫附，因而回收率較低。將甲醇與二氯甲烷混合之后，可以同時降低溶劑的極性和黏度，回收率明顯提高。實驗結果表明，對于土壤中的9-芴酮和9，10-蒽醌選用甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）效果最好，回收率較二氯甲烷作為萃取劑分別高出17.0% 和17.3%，較甲醇作為萃取劑分別高出11.7%和11.5%。但是混合溶劑用于水相和HPCD 相中提取9-芴酮和9，10-蒽醌的提取效率低于二氯甲烷，可能是由于甲醇與水互溶，導致部分目標物殘存于水相中，使其回收率較低。
3.2 9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的賦存特征
土壤是高度不均勻的復雜體系，各組分間的疏水、靜電相互作用、化學鍵的形成以及分子結構不同，使得污染物進入土壤后分化成不同的形態。污染物在土壤中的賦存形態直接影響其生態風險。目前，土壤中PAHs 賦存形態的研究較多，OPAHs 的賦存形態未見相關報道。聶婧等[29]研究了土壤中四環芳烴芘的賦存形態，各形態芘含量大小順序為有機溶劑提取態>可脫附態>結合態，根據其提取方法，這三態分別對應本研究中的F2、F1、F3+F4，即F2>F1>F3+F4，F2和F1 是芘殘留的主要存在形態，該規律與本研究9-芴酮和9，10-蒽醌的研究結果一致。Zhang 等[9]研究發現黃綿土中PAHs 的賦存形態為有機溶劑可提取態PAHs（59.1%）>胡敏素結合態PAHs（26.2%）>富里酸結合態PAHs（10.0%）>胡敏酸結合態PAHs（4.7%），對應本研究的賦存形態即為FDCM>F5>F3>F4。隋紅等[30]研究發現PAHs在土壤有機質胡敏素組分中含量占比大，在富里酸和胡敏酸中占比相當少，即F5>F3 和F4。本研究中9-芴酮和9，10-蒽醌相應賦存形態含量順序為FDCM>F5>F3或F4，與PAHs 研究結果一致。
本研究表明，9-芴酮和9，10-蒽醌進入土壤后會形成各種賦存形態，各賦存形態含量差異較大。∑OPAHs排序為F2（51.7%）>F5（23.1%）>F7（12.3%）>F1（6.3%）>F4（3.5%）>F3（2.2%）>F6（0.9%）。F1 與F2合并為可提取態，是9-芴酮和9，10-蒽醌在土壤中的主要賦存形態，可反映二者在土壤中的生物有效性，其中F2 是可提取態的主要組成部分。F3~F7 是9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤有機質及礦物結合的部分。土壤有機質被報道是影響土壤中PAHs 賦存形態的重要因素[31-32]。本研究中土壤經有機溶劑提取后，殘留的與有機質組分相關的OPAHs 賦存形態為F3、F4、F5 和F7，即富里酸、胡敏酸、胡敏素和干酪根結合態，其含量占比之和為41.1%；與礦物組分相關的賦存形態為F6，即礦物結合態，其含量占比為0.9%，有機質組分相關賦存形態含量遠高于礦物結合態。因此，與PAHs 相似，2 種OPAHs 9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤組分結合時，有機質組分較礦物組分發揮了更重要的作用。
土壤有機質根據其在不同pH值溶液中溶解度的差異，分為溶于任意pH值溶液的富里酸、溶于堿但不溶于酸的胡敏酸和既不溶于酸也不溶于堿的胡敏素[33]。富里酸和胡敏酸是溶解性有機質的主要組成部分[34]，與其結合的9-芴酮和9，10-蒽醌即F3 和F4可遷移性較其他形態更強。2 種OPAHs 9-芴酮和9，10-蒽醌在富里酸和胡敏酸中含量分布表現不同，對于9-芴酮，F3
本文研究了9-芴酮和9，10-蒽醌2 種污染物在1種土壤中的賦存形態。OPAHs 除包含9-芴酮和9，10-蒽醌等含羰基的PAHs 衍生物以外，還包含PAHs分子中氫原子被1 個或多個羥基、羧基等官能團取代形成的羥基化及羧基化衍生物。這些OPAHs 既有芳香結構的相似性，又有含氧官能團的差異性，未來的研究應關注更多種類OPAHs 在更多不同性質土壤中的賦存形態，以評估其生態風險，支撐PAHs污染場地修復過程中OPAHs衍生物的監測、量化及風險管控。
3.3 9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性在自然衰減中的變化
土壤中的污染物通常可通過自然衰減實現土壤自凈。Wei 等[41]研究表明，在未抑菌的芘污染土壤中，自然衰減初期，芘可提取率快速降低，后期則維持緩慢下降趨勢。本研究發現，9-芴酮和9，10-蒽醌的F1 和FDCM含量在前15 d 降幅較大，后15 d 降幅趨緩，表明這2種OPAHs在自然衰減的不同進程，其生物有效性降低程度不同。Zhang等[11]的研究表明，PAHs及其硝基和羰基衍生物進入土壤30 d 后的可提取率及生物有效性明顯下降。9-芴酮和9，10-蒽醌生物有效性降低的主要原因可能是：一方面，自然揮發和微生物降解等作用可導致土壤中這2 種OPAHs 含量降低；另一方面，隨著9-芴酮和9，10-蒽醌與土壤接觸時間的增加，這2種OPAHs逐漸老化進入土壤有機質和礦物質等組分中形成結合態殘留。
0 d 時，土壤中9-芴酮的F1 態含量高于9，10-蒽醌，15 d 和30 d 時反之，且在30 d 時9-芴酮的各賦存形態含量均低于9，10-蒽醌，即9-芴酮較9，10-蒽醌在土壤中自然衰減得更快，這與兩者的性質密切相關。9-芴酮的蒸氣壓高于9，10-蒽醌，更傾向于從土壤相向氣相中逸散；此外，9-芴酮的水溶解度高于9，10-蒽醌，更易被土壤微生物利用，使得土壤中9-芴酮的殘留量更低。Idowu 等[42]研究了極性PAHs 的環境健康風險，指出高分子量化合物比低分子量化合物通常表現出更大的毒性，且具有氧和氮雜原子的化合物由于更高的反應性，其毒性比同環烴更大。Trine等[43]研究發現雜酚油污染土壤蒸汽強化萃取修復過程中形成了PAHs衍生物，分子量較低的OPAHs 1，4-萘醌會比分子量較高的OPAHs 9，10-蒽醌降解得更快，即其生物有效性更強。本研究中9-芴酮的分子量小于9，10-蒽醌，推測9-芴酮具有更快的降解速率。Qiao 等[44]總結了OPAHs 的生物降解半衰期，9-芴酮和9，10-蒽醌的生物降解半衰期分別為8.98 d和16.7 d，9-芴酮的半衰期小于9，10-蒽醌，說明9-芴酮更易被生物降解。
4 結論
本文針對2 種含氧多環芳烴（OPAHs）9-芴酮和9，10-蒽醌，建立了HPLC-DAD 測定方法及其在不同基質中的提取方法。土壤中這2 種OPAHs 提取使用超聲提取法，萃取劑選用甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）混合液；水和HPCD 溶液中這2 種OPAHs 提取使用液液萃取法，萃取劑選用二氯甲烷。
進入土壤30 d后，各賦存形態9-芴酮和9，10-蒽醌含量之和大小順序為難解吸態>粗胡敏素結合態>干酪根結合態>生物有效態>胡敏酸結合態>富里酸結合態>礦物結合態，可提取態和結合態占總殘留量的比例大致相當，有機質結合態較礦物結合態含量占比更高。隨著自然衰減進行，9-芴酮和9，10-蒽醌的生物有效性降低，9-芴酮較9，10-蒽醌在土壤中生物有效性降低得更快。
