氣體擴散系數法估算水體反硝化速率

李曉寒，嚴星，夏永秋，顏曉元

（1.中國科學院南京土壤研究所土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京 210008；2.中國科學院大學，北京 100049）

反硝化作用是活性氮最終以惰性氮形式離開土壤、水體等內部生物循環回到大氣的最主要的自然途徑[1-2]。反硝化過程主要發生在厭氧條件下，在微生物的作用下，硝酸鹽被依次轉化為亞硝酸鹽、NO、N2O，最后以N2的形式返回到大氣氮庫中。作為反硝化過程的主要產物，N2在空氣背景值中的濃度高達78%，要直接測定反硝化脫氮速率，需要方法的精度達到0.1%。準確測定反硝化速率，對于深入理解水體氮循環過程及其氮去除機制具有重要意義。

反硝化速率的估算方法有很多，主要可以分為間接法和直接法。硝酸鹽消失法、乙炔抑制法和15N 平衡法等屬于間接方法。硝酸鹽消失法認為水體中減少的硝酸鹽是被反硝化過程所消耗，因此可以基于系統中硝酸鹽的減少量來確定反硝化速率，但是由于硝酸鹽還會被生物吸收或被沉積物固定，因而這種方法會導致高估反硝化作用。乙炔抑制法是借助乙炔抑制N2O 向N2的轉化，通過測定N2O 來間接計算反硝化速率，然而乙炔在抑制N2O向N2轉化的同時還會抑制硝化作用，另外乙炔可能會被微生物當作碳源分解利用，從而降低抑制效果，造成反硝化速率被低估[3]。15N 平衡法是通過加入15N 標記的同位素來示蹤各種氮作用過程，最后運用差減法計算反硝化作用消耗的氮，一方面人為添加氮源以及同位素的分餾效應會對反硝化過程產生影響，另一方面平衡法因涉及多個過程的測定而存在多個來源的累計誤差[4]。

反硝化速率的直接估算方法主要基于N2∶Ar 測定。Ar 是一種惰性氣體，在水體中的溶解度主要受溫度和鹽度控制，其濃度非常穩定。因此，可通過水體中溶解的N2∶Ar 的增量來計算系統中N2的濃度。Kana 等[5]開發的膜進樣質譜儀（Membrane inlet mass spectrometer，MIMS），測定N2∶Ar 的誤差小于0.03%，因此該方法可以直接測定反硝化作用產生的N2。密閉培養法是將采集的原狀沉積物和上覆水在培養柱內進行密閉培養，在培養期間，反硝化產生的N2在培養柱水體中不斷累積，因此水中N2濃度隨培養時間的增加便反映了系統的反硝化速率。但這種方法需要在原位采集無擾動的沉積物和上覆水帶回實驗室進行培養，并且在培養、取樣以及補水過程中都要求培養體系完全密閉，不能有空氣進入。因此該方法野外采集原狀沉積物工作量大，實驗要求高，培養取樣過程也耗時耗力，無法反映水力和環境因子（流速、風速等）對反硝化過程的影響。氣體擴散系數法是測定開放水體中溶解的N2∶Ar，根據水-氣界面氣體擴散系數方程計算出氣體擴散系數，進而得到N2的產生速率即反硝化速率。該方法操作簡單，不受環境條件限制，而且能反映開放環境如水力和環境因子對反硝化速率的影響。氣體擴散法的估算結果取決于水-氣界面氣體擴散系數的獲取。目前，計算水-氣界面氣體擴散系數的方法有多種，但是選取何種方法確定水-氣界面氣體擴散系數，方法的可靠性如何，以及方法的不確定性如何，對于這些方面的研究還較少。因此，本研究基于室內培養實驗，同步使用密閉培養法和氣體擴散系數法，進行擴散系數法可靠性評估與系數確定方法比選，以及擴散系數法參數敏感性分析。本研究對于原位條件下水體反硝化速率的快速、準確估算具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 氣體擴散系數法

氣體在水-氣界面的交換通量由氣體的擴散速率和氣體在水中的實際溶解度與理論溶解度的差值決定，因此N2的擴散通量可由如下公式表示：

式中：FN2指N2在水-氣界面的擴散通量，mg·m-2·h-1（以N2計，下同）；kN2指N2的擴散速率，cm·h-1；cwater指水中溶解的N2濃度，mg·L-1；cequal指水-氣平衡時理論上水中溶解的N2濃度，mg·L-1，可以根據采樣點的水溫和鹽度計算[6]。

kN2與k600有如下關系：

SCN2=1 970.7-131.45×T+4.139×T2-0.052 106×T3式中：k600是20 ℃下CO2的擴散系數，cm·h-1；SCN2和600分別是淡水中N2和CO2的施密特數，屬于無量綱參數，氣體的施密特數是關于水體溫度（T，℃）的三次函數[7]；n是 施 密 特 系 數，當 風 速 小 于3.6 m·s-1時，n=2/3，否則，n=1/2[8]。目前常用于估算k600的模型主要是kwind-current類型，如表1 所示，即模型中既包含風速又包含水力參數（流速、水深）。不同模型的參數不同，對氣體擴散通量的估算也存在一定差異，因此本研究比較并標定了表中的3種氣體擴散系數模型。

表1 氣體擴散系數模型Table 1 Gas diffusion coefficient model

在u10不易獲取的情況下，可以通過水面上方1 m處的風速u1（m·s-1）進行換算[12]。

1.2 密閉培養法

密閉培養法是將無擾動的原狀沉積物與上覆水在密閉的培養體系中進行培養。其原理是隨著培養時間延長，反硝化的最終產物N2不斷累積，短時間內水體中N2濃度線性增加，因此將水中N2的濃度與時間進行線性回歸可得到Y=aX+b，其中斜率a即表示水中N2濃度的變化速率，再結合培養柱的橫截面積與上覆水體積，即可準確計算出水體的反硝化速率[13]。

1.3 實驗設計

1.3.1 開放培養

為了應用氣體擴散系數法，需要測定開放體系內上覆水中溶解的N2濃度。在南京市江寧區秦淮河段（31.87°N，118.86°E）采集0~10 cm 表層沉積物，帶回實驗室后將沉積物充分混合均勻，然后分裝到培養柱中（PVC，內徑8 cm、外徑9 cm、高度27 cm），培養柱底部用橡膠塞密封，每根培養柱中的底泥高度約為10 cm。用KNO3配制濃度為0、1、2、4、6 mg·L-1（以N 計，下同）的硝酸鹽溶液，作為培養體系的上覆水，上覆水的深度為15 cm。每個濃度3 個平行，共15 根培養柱放在水浴培養箱中并維持水溫恒定。將培養柱敞口靜置在培養箱中預培養一天兩夜，使培養體系達到平衡狀態。培養體系穩定后取第一個水樣作為0 h的樣品，然后分別在第2、4、6、8小時取樣，每次取3個重復水樣。

取樣時，用移液槍吸取表層的水樣轉移到頂空瓶（12 mL，Labco Limited，英國）中，使水樣在頂空瓶瓶口形成頂空，然后立即擰緊蓋子密封。用移液槍取樣過程中注意不要吸入空氣，將水樣轉移到頂空瓶的過程中也盡量不要充入空氣，以免污染水樣。如果所取樣品不能在2 h 內測定，則要在頂空瓶注入水樣之前用移液槍深入瓶中加入100 μL 飽和ZnCl2溶液，用于抑制微生物活性。

1.3.2 密閉培養

密閉培養所用培養柱尺寸、底泥和上覆水均與開放培養一致，樣品在培養桶中預培養一天兩夜使培養體系達到平衡狀態，每個濃度下設置3 個平行，與開放培養同時在第0、2、4、6、8 小時取樣，每次樣品取3個重復。不同于開放培養的是，密閉培養需要保證在培養期間柱內無氣體交換，因此需要用密封蓋將培養柱密封，密封以及取樣的過程中也要注意避免柱內產生氣泡。

具體培養和取樣方法參照李曉波等[13]的方法。

1.3.3 環境理化因子測定

在開始取樣前用HQ301 直接測定培養柱中上覆水的pH、水溫、鹽度等指標，同時取水樣用于后續測定NO-3-N、NH+4-N。

沉積物剔除石塊等雜物后混勻，并取樣測定pH、NO-3-N、NH+4-N、TN 和TC。沉積物風干后過2 mm 孔徑篩，按照水土比2.5∶1振蕩并靜置后測定pH，NO-3-N、NH+4-N 采用2 mol·L-1KCl 浸提沉積物后測定，TN 和TC在沉積物風干研磨過100目篩后測定。

pH 采用pH 計測定，NO-3、NH+4采用流動分析儀測定，TN 和TC 采用CNS 元素分析儀測定。沉積物的部分理化性質見表2。

表2 沉積物的基本理化性質Table 2 Basic physical-chemical properties of the sediment

1.4 水體中溶解N2的測定

水 中 溶解N2的 濃 度 由MIMS（Bay Instruments，Easton，MD，美國）直接測定。MIMS 主要由蠕動泵、恒溫水浴、液氮冷阱、四極桿質譜管、信號收集器、計算機系統組成[5]。待測水樣沿進樣管在蠕動泵的作用下穿過水浴調節裝置，經過溫度平衡后進入真空系統并與半透膜接觸。水樣中的部分氣體透過半透膜進入四極質譜管，首先在電離裝置作用下進行離子化，而后不同質量的離子經過振蕩電場分離后進入檢測器。蠕動泵可以將水樣以穩定的速度輸入到進樣系統中，恒溫水浴可以快速調節低溫保存的水樣至實際取樣時的溫度，液氮冷阱可以去除水蒸氣、CO2、CH4等低分子有機化合物，以防對待測氣體產生干擾。MIMS通過測定水樣N2∶Ar來計算水樣中N2的濃度，其精度可達到0.03%。水樣中N2濃度的計算公式如下：

式中：fC為校正因子；（[N2]/[Ar]）Sa、（[N2]/[Ar]）St分別表示樣品、標準水樣中N2∶Ar的實測值；（[N2]/[Ar]）E、[Ar]E分別表示標準水樣中N2∶Ar、Ar濃度的理論值。

1.5 參數敏感性分析

本研究旨在理解由擴散系數模型估算的N2通量對輸入的各環境變量的敏感性。敏感性分析分為局部敏感性分析（Local sensitivity analysis，LSA）和全局敏感性分析（Global sensitivity analysis，GSA），常用于模型參數不確定性分析。LSA 是在保持其他條件不變情況下，改變某個特定參數來進行敏感性分析[14]，而GSA 是同時改變全部參數來研究全局所有因素的影響[15]。在本研究中，應用蒙特卡洛模擬法分別產生水溫、鹽度、流速、水深、風速5 個參數的隨機數，進行LSA。蒙特卡洛模擬法是在每個因子的分布范圍內隨機取值，從而產生一系列隨機數。各因子的分布和變異基于太湖流域多年觀測數據。其中，水溫數據和氣象數據分別來源于中國環境監測總站和國家氣象科學數據中心的相關數據庫，流速、水深和鹽度的數據來源于已發表的相關文獻[16-18]。上述5個參數均屬于環境變量，可認為其均服從正態分布。以收集到的數據為基礎確定了各參數的均值和標準差（表3），隨后用蒙特卡洛法進行了1 000次模擬。

表3 蒙特卡洛模擬所需參數的變化范圍Table 3 Range of parameters in Monte Carlo analysis

在本研究中，敏感性的統計指標為無偏百分比差異（Unbiased percent difference，UPD，D），具體計算方法如下：

式中：N為模擬次數；xi指第i次模擬時模型計算的結果；y指N次模擬計算結果的均值。

1.6 統計方法

本研究中數據分析均使用Excel 進行，繪圖使用OriginPro 2022完成。

2 結果與分析

2.1 氣體擴散系數法的可靠性

如圖1 所示，3 種氣體擴散系數模型估算出的水體反硝化速率均與上覆水中NO-3-N 的濃度呈正相關，并且用米氏方程能夠很好地擬合反硝化速率與反應底物（NO-3-N）濃度之間的關系（R2=0.994 6，P<0.01），米氏常數為1.42。反硝化作用是反硝化菌在無氧條件下，將NO-3-N 作為電子受體完成呼吸作用以獲得能量的過程，屬于微生物過程，因此反硝化速率與NO-

圖1 不同氣體擴散系數法估算的反硝化速率對NO-3-N濃度的響應關系Figure 1 Relationship between denitrification rates estimated by different gas diffusion coefficient methods and NO-3-N concentration

3-N 濃度之間符合米氏方程的關系。由此也說明氣體擴散系數法估算出的反硝化速率能夠用于估算水體的反硝化速率。

2.2 結果比較

在氣體擴散系數法與密閉培養法的比較中（圖2）可以發現，3 種擴散系數法與密閉培養法測定的水體反硝化速率之間均有顯著的線性關系（R2=0.776 7，P<0.05），但斜率各不相同，BO04、CL07 和Xia21 的斜率分別為2.44、1.22 和0.59，究其原因是由于模型結構和系數差異造成的。本研究中，3 個模型中風速的系數以及BO04 和Xia21 中水深和流速的系數均是由實測數據擬合分析而來，可認為是經驗系數，而CL07中水深和流速的系數是依據熱力學原理推導出來的。由此可認為，CL07 屬于半經驗半機理模型，BO04 與Xia21 屬于經驗模型。另外，雖然經驗模型的系數都是通過統計分析的方法歸納得到，但在分析過程中所用數據集不同，得到的經驗系數也會有所不同。也正因為如此，雖然3 種模型納入的因子一樣，但模型結構和系數迥異，導致估算出的結果也存在較大差異。

進一步比較了3 種氣體擴散系數模型的反硝化估算結果與密閉培養法的測定結果，如圖3 所示，BO04 和CL07 的反硝化速率估算結果分別為46.51~266.42 μmol·m-2·h-1和23.28~133.33 μmol·m-2·h-1，相較于密閉培養法測定結果（24.55~91.20 μmol·m-2·h-1）均較大。而Xia21 估算的反硝化速率（11.30~64.70 μmol·m-2·h-1）相比于密閉培養法測定結果較小。結合圖2中3種氣體擴散系數法與密閉培養法估算的水體反硝化速率擬合方程的斜率，本研究認為CL07 和Xia21 的估算結果均較為接近密閉培養法的測定結果，但其結果分別偏高和偏低。

圖3 不同擴散模型與密閉培養法估算反硝化速率的結果對比Figure 3 Comparison of denitrification rates estimated by different coefficient diffusion models and MIMS-based method

2.3 氣體擴散系數法的參數敏感性分析

本文所選的3 種氣體擴散系數模型都納入了水深、流速和風速3 個參數，同時水溫和鹽度是決定氣體施密特數的參數，因此用擴散系數模型估算反硝化速率的不確定性取決于以上5 個參數的敏感性。以下選擇CL07模型進行參數敏感性分析。

參數敏感性分析結果表明，氣體擴散系數模型對鹽度的變化幾乎不敏感（UPD=0.03%），而對風速的變化最為敏感（UPD=12.13%），其次比較敏感的參數是流速和水溫，UPD 分別為9.49%和9.42%，對水深也有一定的敏感性，UPD 為6.24%。因此在應用氣體擴散系數法估算水體反硝化速率時，風速、流速和水溫是3 個最重要的環境因子，其準確性影響著模型的估算精度。水體溫度不僅可以通過影響微生物活性從而直接對反硝化速率產生影響，而且水體溫度變化會改變N2在水體中的理論溶解度，導致水體中N2的飽和度發生變化，在用擴散系數法估算反硝化速率時會間接影響估算結果。水體的流動一方面有助于硝酸鹽底物向底泥補充以促進反硝化作用，另一方面也會使水體溶解氧量增多，破環水體底部的厭氧環境從而抑制反硝化作用，因此水體流速對水體反硝化有著至關重要的作用。風速是影響氣體在水-氣界面擴散的重要物理因素，是氣體擴散系數模型中最重要的環境因子。

3 討論

在原位狀態下，水體反硝化過程受多種因素影響，而目前只有氣體擴散系數法能夠實現原位直接估算水體的反硝化速率。以往的研究表明，NO-3濃度和水溫是水體反硝化的主要控制因子。例如Zhao 等[19]構建的反硝化速率預測模型納入了水溫和NO-3-N 濃度兩項參數，模型的解釋率達到了85%。一方面，NO-3是反硝化作用的底物，高濃度的NO-3有利于反硝化的發生；另一方面，隨著水體溫度升高，微生物活性增強，進而促進了反硝化作用。此外，其他的生物化學因子，如溶解氧（DO）[19]、pH 和氧化還原電位（ORP）[20]也會通過影響硝化-反硝化耦合過程來影響水體反硝化速率。近年來，越來越多的研究強調水力因子（如流速、流量、水深、水力停留時間等）在水體反硝化過程中的重要作用。Guo 等[21]通過主成分分析研究發現水力因子（流速、流量）對太湖流域的氮去除貢獻率達到14%。Alexander等[22]在墨西哥灣的研究表明，從小河流到大河流，隨著河道水深增加，水體的氮去除速率減小。Marce等[23]將已發表文獻中的數據進行整理，分析發現水力停留時間可以解釋硝酸鹽去除的22%~48%。以上研究都表明，原位環境下影響水體反硝化速率的因素多且機制復雜，而密閉培養法不能反映水力和環境因子對反硝化過程的影響，因此估算結果存在很大的不確定性。氣體擴散系數法則很好地彌補了這一缺陷，通過在原位直接估算水體的反硝化速率從而能夠更加真實地定量反硝化過程。因此該方法可以在大尺度上高頻率地進行水體反硝化速率的估算[24-25]。

但值得注意的是，因為影響氣體在水-氣界面擴散的因素復雜，所以關于在原位條件下估算氣體擴散速率的最佳模型尚未達成共識[26-27]，并且不同擴散系數方程估算出的反硝化速率存在明顯差異（圖3）。與本研究的結果不同，Yang等[28]比較了10種氣體擴散系數方程估算的k600，結果顯示CL07 的估算結果約是BO04估算結果的2.5倍，這說明了即使相同的氣體擴散系數方程在不同研究條件下估算出的結果也會存在差異。因此在不同情境下應用氣體擴散系數法進行反硝化速率的估算時，要根據實地環境條件對模型進行標定，從而選擇合適的氣體擴散系數方程。

4 結論

BO04、CL07和Xia21 3種氣體擴散方程均能很好地表征反硝化速率對硝態氮濃度的響應關系。在本試驗條件下，CL07和Xia21的估算結果均接近密閉培養法的測定結果。通過對CL07方程進行參數敏感性分析發現，風速、流速和水溫是最為敏感的3 個因子，無偏百分比差異分別達到了12.13%、9.49% 和9.42%。總之，氣體擴散系數法估算水體反硝化速率具有較高的準確性和可靠性，為區域尺度原位條件下水體反硝化速率的快速、準確估算提供了方法基礎。