丁苯酞-兩親碳質微球材料的制備與表征

朱帝　李維　葛方蘭　王麗瑤

摘要：制備兩種型號的包埋了丁苯酞的兩親性碳質微球I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP，研究其包埋率和緩釋性.先用丙酮對酵母細胞進行預處理，然后再將酵母細胞進行溫和的水熱碳化（180～200 ℃，8～12 h），取部分處理液直接烘干得到I-ACPs;其余處理液經硫酸處理數小時，清洗，離心，55 ℃烘干便得到II-ACPs;將I-ACPs和II-ACPs均勻分散于超純水中，添加丁苯酞，常溫下180 r/m振蕩5 h，離心烘干便得到I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP制備成功，包埋效果好，且具有良好的兩親性和緩釋性.I-ACPs@NBP的包埋率和緩釋性要略優于II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP可添加于水凝膠等醫用敷料促進傷口愈合.

關鍵詞：兩親性中空碳質微球; 丁苯酞; 制備; 包埋率; 緩釋性

中圖分類號：R318.08 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8395（2023）05-0677-08

0引言

兩親性中空碳質微球由于在靶向給藥、藥物控釋、催化、儲能材料、固定化酶和環境吸附材料等領域的應用日益廣泛，引起了人們的關注[1-2].這是由于兩親性中空碳質微球具有能夠有效封裝活性成分（如染料、藥物、墨水、細胞和蛋白質）到內腔中的優良特性[1].又由于微球表面層分子具有特定的官能團，可以使其具有更好的物理和化學性質（如超疏水性、超親水性和兩親性）[1].釀酒酵母細胞是制備具有可控孔隙度空心碳質微球的良好材料，對酵母細胞進行溫和的水熱處理（180～200 ℃），可合成具有可控中孔和大孔的中空碳質微球（amphiphilic hollow carbon microspheres，ACPs）[1].在水熱條件下，微球表面碳化形成了部分疏水性基團，同時又保留了酵母細胞壁本身的親水性基團[2]，這些空心球的表面同時被疏水和親水官能團覆蓋，使所獲得的微球具有兩親性.此外，兩親性使得多孔中空碳質球（ACPs）表現出相轉移、蛋白質自富集和pH控制釋放行為[1].為了合成ACPs，首先用丙酮預處理酵母細胞，確保去除細胞內原生質體.再加入戊二醛（GA）作為保護劑[1]，戊二醛通過共價鍵結合細胞壁多糖網絡中的醛基或酰胺基，增強了多糖網絡的強度，從而避免了不必要的斷裂[1]，使細胞壁多糖網絡免遭破壞.研究表明，當加入體積分數2%戊二醛水溶液時，微球表面的孔徑平均尺寸約為43 nm，進一步經硫酸處理后，尺寸增大到50 nm，在部分樣品中甚至可以明顯看到大于100 nm的大孔[1].

丁苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP）為dl-3-正丁基-1（3H）-異苯并呋喃酮，與從芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素具有相同的結構，是人工合成的消旋體[3-4].丁苯酞在229 nm波長處有最大吸收峰[5]，臨床上常用于治療急性缺血性腦卒中[6].丁苯酞能促進血管再生[7-8].丁苯酞化學結構見圖1所示.

丁苯酞（NBP）為黃色液體，微溶于水，可溶于甲醇、乙醇以及DMSO等有機溶劑[5].ACPs具有兩親性，能將丁苯酞包埋在微球內部，同時ACPs表面也能吸附丁苯酞.將NBP包埋于ACPs內部即形成ACPs@NBP，再將ACPs@NBP加入到水凝膠等醫用敷料中，可以促進傷口的血管生長，加快傷口愈合，并且ACPs@NBP具有緩釋性，可以長時間慢慢釋放NBP，以便藥物充分吸收.因此，本實驗制備的包埋了丁苯酞的兩親性碳質微球ACPs@NBP，可應用于水凝膠等醫用敷料的制作.

1材料與方法

1.1實驗試劑 安琪啤酒活性干酵母;丙酮（分析純，質量分數≥99.5%，成都市科龍化工試劑廠）;無水乙醇（分析純，質量分數≥99.7%，成都金山化學試劑有限公司）;戊二醛（AR 50%，羅恩試劑）;0.5 mol/L的NaOH水溶液（實驗室自配）;丁苯酞（石家莊多維化工有限公司）.

1.2實驗儀器 純水超純水一體機（型號：arium comfort I，賽多利斯上海貿易有限公司）;電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器上海有限公司）;數顯控溫加熱攪拌器（常州市金壇大地自動化儀器廠）;冷凍高速離心機（Allegra X-30R，美國貝克曼庫爾特有限公司）;箱式電阻爐（SX2-4-10A，紹興市上虞道墟科析儀器廠）;KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;雙層恒溫振蕩器（IS-RSV1，上海恒科學儀器有限公司）;恒溫搖床（DHZ-CA，太倉市實驗設備廠）;100 mL水解管（安徽韋斯實驗設備有限公司）;紫外可見分光光度計（BioMate 3S，賽默飛世爾科技公司）;透析袋（MW：14 000，biosharp公司）.

1.3中空碳質微球的制備與表征分析

1.3.1中空碳質微球ACPs的制備 本實驗制備了兩種不同表面孔徑大小的碳質微球：I-ACPs和II-ACPs，II-ACPs是I-ACPs經過硫酸處理后形成的.

1.3.2I-ACPs的制備 稱取20 g啤酒酵母溶解于200 mL超純水，用磁力攪拌器攪拌均勻（約1 h）后離心（8 000 r/m，8 min）得到沉淀（酵母細胞），棄去上清液，加入丙酮，用玻璃棒攪拌，使沉淀分散均勻，并置于恒溫振蕩器常溫180 r/m振蕩15 min，8 000 r/m離心8 min，棄去上清液[1，9].重復此操作2次，以除去酵母細胞的原生質體.用超純水懸浮沉淀，均勻分散后，8 000 r/m離心8 min，棄去上清液，收集沉淀物.重復此操作2次，以去除黏附在細胞壁上的原生質體.再將沉淀均勻分散于體積分數為2%的戊二醛水溶液中[1，9]，倒入水解管中，將水解管放入箱式電阻爐中，加熱至180～200 ℃保持8～12 h，使酵母細胞壁受熱碳化.冷卻后取出水解管，搖勻，離心（8 000 r/m，12 min），棄去上清液，取褐色沉淀，用體積分數50%乙醇溶液數次清洗離心（8 000 r/m，12 min），直至上清洗液接近無色，以去除戊二醛、色素及各種有機和無機雜質，得到較為干凈的褐色沉淀[1，9].將其置于烘箱中（55 ℃）烘干，所得產物即為兩親性碳質微球，稱重為2.42 g.

1.3.3II型碳質微球（II-ACPs）的制備 稱取一定量的I-ACPs，置于質量分數為20%～50%的硫酸溶液中，在室溫下處理數小時[1]，8 000 r/m離心12 min，清洗，用0.5 mol/L的NaOH溶液調節PH值至7.0，再離心（8 000 r/m，12 min），55 ℃烘箱中烘干即可得到II-ACPs.

2實驗結果與分析

2.1中空碳質微球ACPs的表征分析 對本研究所獲得的微球材料進行掃描電子顯微鏡（SEM）分析，結果如圖2所示.從圖2中可以看出，II-ACPs表面的小孔孔徑比I-ACPs表面的要大.I-ACPs的微球表面孔徑為43 nm左右;II-ACPs是I-ACPs經過硫酸處理后的產物，微球表面孔徑大約為50～100 nm，部分微球甚至會超過100 nm，形成較大的孔徑.

2.2兩親性碳質微球對丁苯酞的掃描電子顯微鏡與緩釋分析 分別稱取0.2 g I-ACPs和II-ACPs，分別加入10 mL超純水，超聲處理10 min，使其均勻分散[10]，再分別加入0.2 ml丁苯酞，置于搖床上振蕩5 h[10].離心（8 000 r/m，8 min），收集沉淀，放入55 ℃烘箱中，烘干，得I-ACPs@NBP或II-ACPs@NBP.

2.2.1掃描電子顯微鏡（SEM）分析 對本研究所獲得的包埋了丁苯酞的微球材料進行掃描電子顯微鏡（SEM）分析，結果如圖3所示.從圖3b、c、e、f中，可以看出I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP的表面均致密地附著了丁苯酞，說明本研究制備的I-ACPs和II-ACPs都能夠很好地吸附丁苯酞.

2.2.2I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP的NBP緩釋分析 首先繪制丁苯酞的標準曲線.準確量取5.9 μL的NBP（即10.03 mg），置于50 mL容量瓶中，以體積分數50%的乙醇水溶液為溶劑，進行定容.分別取上述溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mL置于10 mL容量瓶中，用體積分數50%的乙醇水溶液稀釋，定容[11]，然后以體積分數50%的乙醇水溶液為空白，于229 nm波長下，分別測定各濃度梯度溶液的吸光度，如表1所示.

以NBP的吸光度對NBP質量濃度作圖，結果如圖4所示，得到標準曲線：y=36.821x-0.033 4，R²=0.999 3，說明NBP在0.006～0.018 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好.

取透析袋，相繼用體積分數50%乙醇，0.01 mol/L碳酸氫鈉和0.001 mol/L EDTA溶液洗滌，最后用超純水漂洗4次，以除去生產過程中產生的極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質.所用透析袋的截留分子質量為14 000，能透過水，乙醇和丁苯酞的小分子物質（丁苯酞分子質量為190.238），由酵母細胞壁碳化得來的碳質微球不能透過.

稱取一定量的I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP，分別溶于20 mL的體積分數50%乙醇水溶液，并轉入透析袋中，將透析袋置于裝有300 mL的體積分數50%乙醇水溶液的錐形瓶中，在搖床中180 r/m振蕩，每隔1 h取樣，于229 nm波長下檢測吸光度，檢測后，樣品要倒回錐形瓶.I-ACPs@NBP的緩釋情況如圖5所示，在第10 h時曲線開始趨于平穩，錐形瓶中體積分數50%的乙醇水溶液中的NBP質量濃度接近最大值，說明I-ACPs@NBP中包埋的NBP基本釋放于體積分數50%的乙醇水溶液中，有效緩釋時間為10 h，15 h后完全緩釋完畢.這說明NBP成功包埋于I-ACPs中，且具有緩釋性.

II-ACPs@NBP的緩釋情況如圖6所示，在第8 h時錐形瓶中體積分數50%的乙醇水溶液中的NBP質量濃度達到最大，完全緩釋完畢，說明II-ACPs@NBP的有效緩釋時間為8 h，NBP亦成功包埋于II-ACPs中，也具有緩釋性.I-ACPs@NBP的10 h的緩釋時間要略優于II-ACPs@NBP的8 h緩釋時間.

2.3熱失重（TGA）分析 熱失重（TGA）由四川大學分析測試中心分析.分別稱取4種實驗樣品，包括I-ACPs@NBP、空載對照I-ACPs、II-ACPs@NBP、空載對照II-ACPs，通入氮氣，流量為50 mL/min，以10 ℃/min的速度升溫到1 000 ℃[9，12].

圖7～10分別是I-ACPs@NBP、空載對照I-ACPs、II-ACPs@NBP和空載對照II-ACPs的熱失重分析結果.4個實驗樣品稱取的質量分別是7.939 0、7.924 0、7.768 0和7.841 0 mg.

對比圖7和8，可知圖7中的第2個臺階和圖8中的第2個臺階都是I-ACPs受熱失重的過程，在300～550 ℃這一升溫范圍內.圖7中的第1個臺階是I-ACPs@NBP中包埋的NBP受熱失重的過程，在100～300 ℃這一升溫范圍內，失重率達53.98%，即4.29 mg，說明7.939 0 mg的I-ACPs@NBP中包埋了4.29 mg的NBP，包埋率達到53.98%，即1 g的I-ACPs能包埋539.8 mg的NBP，包埋效果相當高.

對比圖9和10可知，圖9中的第2階梯和圖10中的第2階梯都是II-ACPs受熱失重的過程，在300～550 ℃這一升溫范圍內.圖9中的第1個臺階是II-ACPs@NBP中包埋的NBP受熱失重的過程，也在100～300 ℃升溫范圍內，失重率達50.66%，即3.94 mg，說明7.768 0 mg的II-ACPs@NBP中包埋了3.94 mg的NBP，包埋率達到50.66%，即1 g的II-ACPs能包埋506.6 mg的NBP，包埋效果好.從圖11能更直觀地看出4個樣品失重變化的異同對比.I-ACPs@NBP的包埋率略優于II-ACPs@NBP.

2.4I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP兩親性測試 將I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP分別融入超純水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF和超純水氯仿混合液中，觀察各自分散情況[9-10，12].

從圖12和13中可以看出，I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP均能很好地分散于極性溶劑和非極性溶劑中，在超純水氯仿混合液中，I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP微粒均聚集在水和氯仿之間.證明了I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP都具有很好的兩親性.

圖12從左至右a、b、c、d、e、f樣品溶劑依次為超純水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF、超純水氯仿混合液（上層為超純水下層為氯仿）.圖13從左至右h、i、j、k、l、m樣品溶劑依次為超純水、丙酮、甲苯、氯仿、DMF、超純水氯仿混合液（上層為超純水下層為氯仿）.

3結論

中空碳質微球具有良好的兩親性和緩釋性，作為載體可以用于包埋各種藥物，目前相關研究報道還不多.最近，有人報道采用中空碳質微球包埋抑菌性物質[9-10]，并添加在凝膠劑中，結果具有很好的緩釋性和長久抑菌性.受此啟發，本研究成功制備了兩種型號的包埋了丁苯酞的兩親性碳質微球，分別為I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP.實驗結果表明，丁苯酞成功包埋于I-ACPs和II-ACPs內部，微球表面也能附著一層致密的丁苯酞，說明包埋效果良好;另外，它們還具有很好的兩親性和緩釋性，I-ACPs@NBP的緩釋性和包埋率略優于II-ACPs@NBP.總的來說，I-ACPs@NBP的總體性能要優于II-ACPs@NBP.I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP均可用于水凝膠等醫用敷料的制備，延長NBP緩釋時間，有利于促進血管的生長，促進傷口愈合.還由于I-ACPs@NBP和II-ACPs@NBP具有兩親性，能夠均勻地分布在水凝膠醫用敷料中.另外，除包埋丁苯酞外，兩親性中空碳質微球亦可以同時包埋表皮生長因子等小分子蛋白質，再添加于水凝膠或水膠體等醫用敷料，賦予醫用敷料多種醫療功能.

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Preparation and Characterization of Butylphthalide-Amphiphilic Hollow

Carbon MicrospheresZHU Di LI Wei GE Fanglan WANG Liyao

MA Xiaojuan YANG Sen HU Han （1. College of Life Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， Sichuan;

2. Key Laboratory of Biological Resources of Sichuan Province， Chengdu 610101， Sichuan）

Abstract：Two types of amphiphilic hollow carbon microspheres embedded with butylphthalide I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were prepared to study their embedding rates and slow release features. The yeast cells were pretreated with acetone， and then carbonized under mild hydrothermal conditions（180-200 ℃， 8-12 h）. Part of the conditioning fluid was directly dried to obtain I-ACPs.The other conditioning fluid was treated with sulfuric acid for several hours， cleaned， centrifuged and dried at 55 ℃ to obtain II-ACPs. The I-ACPs and II-ACPs were evenly dispersed in ultra-pure water， with butylphthalide added and shaken at 180 r/m for 5 h at room temperature， and then I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were obtained by centrifugal and drying. I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP were successfully prepared with good embedding effects， good amphipathies and slow release features. The embedding rate and slow release feature of I-ACPs@NBP are slightly better than that of II-ACPs@NBP. I-ACPs@NBP and II-ACPs@NBP can be added to hydrogel and other medical dressings to promote wound to heal.

Keywords：amphiphilic hollow carbon microspheres; butylphthalide; preparation; embedding rate; slow release feature

（編輯 鄭月蓉）