兩種桉樹葉揮發物對蠶豆根尖細胞有絲分裂行為的影響

王強　孟巧巧　王煜　馬丹煒

摘要：桉樹揮發物對周圍植物具有化感抑制效應，為了探討其化感作用機制，以蠶豆為實驗材料，探究藍桉和巨桉兩種常見桉樹葉揮發油及其兩種主成分α-蒎烯和桉油精對蠶豆的遺傳毒性.結果表明：在兩種桉葉揮發油及其主要成分作用下，蠶豆幼根長僅在最低處理梯度時（24和48 h）顯著大于對照組（P＜0.05），其余處理組均呈現劑量-時間依賴性抑制效應，α-蒎烯與兩種桉葉揮發油的作用效應更為相似;桉葉揮發物在一定范圍內干擾了蠶豆根尖細胞的有絲分裂過程，表現為細胞出現微核和多種類型的染色體畸變，有絲分裂指數下降，微核率升高，并表現出劑量-時間依賴效應，但微核率低于正常細胞的本底值.整體來看，兩種桉葉揮發物的遺傳毒性較小，因此兩種桉樹通過揮發途徑的化感作用不是通過干擾有絲分裂而發揮功能的.

關鍵詞：桉樹; 化感作用; 揮發油; 遺傳毒性

中圖分類號：Q945 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8395（2023）05-0685-08

桉樹（Eucalyptus spp.）是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）植物的總稱，原產于澳大利亞和東南亞[1]，已成為世界三大造林樹種（松、桉、楊）之一[2].桉樹已被120多個國家引種，占世界種植面積的1/3.據統計，我國桉樹種植多達540萬hm^2，占全國森林總面積的近2.5%[3]，主要用于造紙、制作人造板和提取精油[4].桉葉中含有大量的揮發性次生代謝物質，如桉油精、α-蒎烯、桉葉醇、檸檬烯、ρ-對傘花素、香茅醛和藍桉醇等[5-6]，具有良好的殺蟲驅蟲、抗菌、消炎鎮痛、抗氧化等生物活性，具有較大的經濟價值[4].然而，近年來，桉樹種植引起的土壤退化、林下生物多樣性喪失、生態系統功能喪失等生態問題逐漸成為社會關注和學術界爭論的熱點問題[7-9].桉葉油對周圍農作物也具有較強的化感作用，主要通過揮發和凋落物淋溶液等途徑，尤其是葉凋落物淋溶液可大量產生酚酸、酯、烷烴等化感物質，改變土壤pH，顯著抑制種子萌發和植物生長[10-11].根是植物吸收水分和礦質營養的主要器官，根際土壤直接關乎植物的生長狀況，而根尖是根系生長、伸長和吸收最活躍的部位，根尖的健康狀況直接關系植物生存[12].前人研究表明，植物釋放的揮發性物質可被雨露帶入土壤，或被土壤吸附并溶解到根細胞的角質中[13]，影響根尖細胞的有絲分裂行為并誘導遺傳損傷[14]，干擾根的基因表達[15].那么，桉樹化感作用是否通過干擾受體根尖有絲分裂行為，進而抑制生長發育呢？明確這一問題對科學評價桉樹種植對生態環境的負面效應具有積極的理論價值和現實意義.本研究運用細胞毒理學評價常用的蠶豆根尖微核技術，以四川地區廣泛種植的藍桉（Eucalyptus globulus）和巨桉（Eucalyptus grandis）兩種桉樹葉揮發油及其二者共同成分桉油精和α-蒎烯為供體，研究了在桉葉揮發物作用下，蠶豆根尖細胞有絲分裂指數、畸變率和微核率的變化，旨在回答這一科學問題.

1材料與方法

1.1材料 藍桉、巨桉葉采集于四川師范大學成龍校區及其附近街道，陰干備用;供試植物蠶豆種子（成胡14#）購自成都市龍泉驛區大面鎮街道種子市場;實驗所用標準品α-蒎烯（質量分數≥99%）和桉油精（質量分數≥99%）購自科賽斯特（成都）科技有限公司.

1.2揮發油提取、共有成分檢測和處理梯度的設置 參照文獻[16]的水蒸氣蒸餾法略有改動，提取桉葉揮發油.將陰干后桉葉分別剪成小段，準確稱取1 000 g，提取4 h，藍桉揮發油得率為3.67%，淡黃色透明，具有芳香性氣味;巨桉的揮發油得率為1.21%，淡黃色透明，具芳香性氣味[17].無水Na₂SO₄除去水分，稱重，4 ℃保存備用.采用Aglient 7890A/5975c氣相色譜-質譜聯用儀分別測定兩種桉樹揮發油的成分和相對含量.GC-MS檢測表明，藍桉和巨桉揮發油中含量最高的成分均為桉油精和α-蒎烯，桉油精的體積分數分別為59.55%、50.49%;α-蒎烯的體積分數分別為17.18%、17.89%.

本研究設置了4個處理組，即藍桉葉揮發油、巨桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精，每組設置5個處理梯度（記為T1，T2，T3，T4和T5），α-蒎烯和桉油精的處理梯度與其在桉葉油中所占體積分數（59.55%和17.89%）相對應，以不做處理為對照（見表1）.

1.3材料培養和毒性試驗 挑選大小均一、無病、無霉斑和顆粒豐滿勻稱的蠶豆種子，洗凈，質量分數0.5%KMnO₄溶液消毒15 min，蒸餾水清洗3～5次，25 ℃培養箱中浸種24 h后，均勻鋪在墊有濕紗布磁盤中，再覆蓋1層濕紗布，放入25 ℃培養箱中避光培養至種子露白.將露白種子置于墊有濕潤濾紙的培養瓶（直徑6 cm，高度9 cm），每瓶3顆.按照表1分別取不同梯度的桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精，均勻涂抹在培養瓶蓋上，并立即蓋緊瓶蓋，置于25 ℃的培養箱中避光培養24、48和72 h，以瓶蓋未涂抹揮發物的處理作對照，每處理重復10次.處理結束后分為2組，一組用直尺測定根長（cm）;另一組換干凈瓶蓋恢復培養24 h后，參照王煜等[18]觀察蠶豆根尖細胞有絲分裂和微核的方法略有改動.截取0.5 mm左右的根尖，卡諾固定液（體積比冰醋酸∶無水乙醇=1∶3）固定24 h.1 mol·L^-1HCl 60 ℃解離8 min，ddH₂O清洗3次，改良苯酚品紅染液染色，壓片，Nikon E200攝影顯微鏡觀察并拍照，每次處理統計5個根尖，每個根尖計數1 000個細胞，重復3次，計算有絲分裂指數（mitotic index，MI）和微核率（micronucleus frequency， MCN）：

2結果與分析

2.1桉葉揮發物對蠶豆根生長的影響 根據圖1可見，除了24 h處理組的最小梯度對蠶豆根的生長具有顯著促進效應外，其余處理的根長均比對照短，且隨著處理時間延長、處理梯度增加，處理組根生長受抑制程度加劇，在72 h處理組中，在藍桉揮發油、巨桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精的最大梯度作用下，根長僅為對照組的22.48%、20.16%、22.87%和23.64%;形態學觀察表明，揮發物處理組的幼根表現出明顯的受害癥狀，如變短變粗，根冠變褐，根毛稀少等，這種癥狀隨著處理梯度的增加和時間的延長而加劇，甚至出現變黑、爛根的情況;α-蒎烯和桉油精對蠶豆根生長的抑制效應與兩種桉油接近，推測二者是桉油揮發油中的主要化感物質，根據非度量多維尺度分析（NMDS）結果表明（圖2），α-蒎烯對蠶豆根生長的抑制效應與兩種桉葉揮發油的效應更相似.

2.2桉葉揮發物對蠶豆根尖細胞有絲分裂的影響 桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精干擾了蠶豆根尖細胞有絲分裂過程（圖3）.在不同處理時間，各處理組整體表現為處理梯度較低時（T1、T2和T3）有絲分裂指數升高，處理梯度較高時（T4、T5）有絲分裂指數下降.其中，在T1達到最高值，以24 h處理組的變化最為明顯，在該處理時間段的T1處理組中，在藍桉葉揮發油、巨桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精作用下，蠶豆根尖細胞的有絲分裂指數分別為10.02％、10.17％、10.17％和10.03％，與對照（8.09％）差異顯著;在T5達到最低值，以72 h處理組的變化最為明顯，在該處理時間段的T5處理組中，在藍桉葉揮發油、巨桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精作用下，蠶豆根尖細胞的有絲分裂指數分別為4.05％、3.40％、4.36％和4.89％，與對照（7.71％）差異顯著.各處理組的前期細胞所占比例較大，且隨著處理梯度增大和處理時間延長，前期細胞數與有絲分裂指數的變化規律一致，均逐漸減少;處理梯度達到T5時，葉揮發油處理組有絲分裂指數已趨于平穩，表明根尖嚴重受損.

2.3桉葉揮發物的遺傳毒性

2.3.1微核和染色體畸變 顯微觀察表明，在桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精作用下，蠶豆根尖細胞出現微核和染色體畸變現象（圖4），間期細胞產生了單微核（圖4a）、雙微核（圖4b）和多微核（圖4c）現象;前期主要是微核和染色體斷片;中期主要是微核、染色體斷片（圖4d）和紡錘體多極分裂（圖4l）;后期主要是染色體斷片（圖4e）和染色體滯后（圖4k）;末期主要是染色體斷片（圖4f）、游離環（圖4g）、染色體橋（圖4h）、染色體移動不同步（圖4i）和染色體粘連（圖4j）等，這些現象表明桉葉揮發物誘導了遺傳損傷.

2.3.2桉葉揮發物誘導的蠶豆根尖細胞微核率 用微核試驗技術檢測染色體畸變及紡錘絲毒性程度.本研究結果表明（圖5），在桉葉揮發物作用下，蠶豆根尖細胞中微核率變化趨勢表現為先升高后降低，整體顯著高于對照，在T4達到峰值，以48 h處理組的變化最為明顯，在該處理時間段的T4處理組中，藍桉葉揮發油、巨桉葉揮發油、α-蒎烯和桉油精作用下，蠶豆根尖細胞的微核率分別為9.39‰、10.30‰、9.23‰和7.46‰，與對照（2.21‰）差異顯著，但低于正常細胞的本底值10‰[21-22]，因此遺傳毒性效應較低.共有成分α-蒎烯和桉油精誘導微核產生的效應與葉揮發油相似，與對根長的抑制和有絲分裂的影響基本一致.

2.4桉葉揮發物對蠶豆根尖有絲分裂行為影響的綜合比較 根據化感綜合效應指數可知，4種揮發物化感綜合效應由大到小依次為巨桉揮發油（0.37）＞藍桉揮發油（0.33）＞α-蒎烯（0.31）＞桉油精（0.24），α-蒎烯和桉油精與兩種揮發油的化感效應呈極顯著的正相關關系（P＜0.01），表明二者是桉葉揮發油的主效化感物質.

3討論

桉樹富含次生代謝物質，這些物質釋放到環境對周圍植物產生化感作用，抑制周圍植物的種子萌發和幼苗生長[10-11]，因此化感作用可能是桉樹種植引起生物多樣性下降的原因之一.研究表明，桉葉油富含多種化感物質，其中α-松油醇顯著抑制反枝莧（Amaranthus retroflexus）種子發芽和生長[23].環境脅迫導致生物體基因組損傷[24]，干擾細胞周期相關蛋白基因的表達[25]，從而阻止紡錘絲微管蛋白的聚合和紡錘體的形成[26].當受脅迫程度超出了生物的耐受限度時，細胞自我修復DNA或染色體損傷的能力下降，形成染色體斷片，發生斷裂的染色體在機體免疫保護作用下形成染色體橋[27]，由于其無著絲點形成，也就導致了微核的出現[28].本研究結果表明，在兩種桉葉揮發油及其共有成分α-蒎烯和桉油精的作用下，蠶豆根長和根尖細胞均表現為低濃度促進和高濃度抑制，大體為劑量-時間呈現雙重效應，分裂細胞大部分處于分裂前期，這一結果與胡琬君等[29]研究土荊芥揮發油對蠶豆根尖細胞作用的結果相似，表明在較低濃度的桉葉揮發油刺激下，蠶豆根尖細胞出現應急反應，通過加速分裂以抵御桉葉揮發物的化感脅迫，但隨著處理時間延長和處理濃度增加，脅迫強度加劇，超出了細胞應激反應的閾值，紡錘體形成過程受阻，細胞分裂被阻滯在分裂前期.同時，細胞內出現微核和各類染色體畸變現象，根尖細胞的微核率隨著處理時間和處理濃度的增加而逐漸升高，與劉羽等[30]研究4種酚類物質誘導蠶豆根尖細胞微核率的變化趨勢相似.正常情況下，細胞微核率的本底值約為10‰[21-22]，本研究4種桉葉揮發物誘導的微核率均在10‰以下，因此遺傳毒性相對較低，生態風險較低，桉樹揮發性化感物質對有絲分裂過程影響較小，可能通過其他途徑產生化感脅迫.

4結論

藍桉和巨桉的葉揮發物具有一定的遺傳毒性，能干擾蠶豆根尖細胞有絲分裂過程，破壞紡錘體的形成和結構，導致細胞出現微核和各類染色體畸變，導致根系生長受阻，兩種桉葉揮發油共有成分α-蒎烯和桉油精是其主效化感物質.但是，兩種桉葉揮發物誘導的遺傳毒性低于正常細胞10‰的本底值，表明其遺傳毒性較小，桉樹化感脅迫可能通過其他途徑影響植物的生長過程.

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Genotoxic Effects of the Leaf Volatiles of Eucalyptus Globulus and

Eucalyptus Grandis on Vicia faba L. Root Tip CellsWANG Qiang，MENG Qiaoqiao，WANG Yu，MA Danwei（College of Life Sciences， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， Sichuan）

Abstract：Eucalyptus volatile has the allelopathic inhibitory effect on surrounding plants. In order to explore the allelopathy mechanism of Eucalyptus， the genotoxicity of volatile oils from Eucalyptus globules and Eucalyptus grandis and their two common components α-pinene and eucalyptol to broad bean （Vicia faba L.） were studied. The results showed that the root lengths of broad bean in most treatment groups were significantly shorter than those in control except the lowest treated dose group for 24 h and 48 h when exposed to Eucalyptus volatiles. Among them， α-pinene and the two volatile oils of Eucalyptus leaves had similar effects. To some extent， Eucalyptus volatiles interfered with the mitotic process of broad bean root tip cells， showing micronucleus and various chromosome aberrations， the decrease of the mitotic index and the increase of the micronucleus rate increased， which were dose-time dependent effects. But the micronucleus rates were lower than the background value of normal cells. These results suggested that the genotoxicity of Eucalyptus volatiles did not play a significant role in their allelopathy.

Keywords：Eucalyptus; allelopathy; volatile oil; genotoxicity

（編輯 鄭月蓉）