基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析西黃丸治療胃癌血瘀證的潛在活性成分及作用機(jī)制

賀忠寧　陳鴻　郭秋均　花寶金　李叢煌

摘要 目的：應(yīng)用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP V2.0）預(yù)測(cè)西黃丸治療胃癌血瘀證的潛在活性成分，并初步探討其分子機(jī)制。方法：利用TCMIP V2.0平臺(tái)中藥材數(shù)據(jù)庫及中藥分子機(jī)制模型數(shù)據(jù)庫（BATMAN-TCM），收集西黃丸已報(bào)道的化學(xué)成分信息;利用中藥（含方劑）靶標(biāo)預(yù)測(cè)功能，收集西黃丸的候選靶標(biāo)譜;利用疾病數(shù)據(jù)庫，收集胃癌疾病及血瘀證證候基因集;利用病證方關(guān)聯(lián)分析模塊，構(gòu)建“病-證-方”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦荡_定核心網(wǎng)絡(luò);利用David 6.8平臺(tái)對(duì)“病-證-方”的核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物學(xué)功能分析，包括基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析;根據(jù)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)和頻次，圈定西黃丸治療胃癌血瘀證的潛在核心成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和通路信息;利用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”圖;再利用Autodock 4.2對(duì)主要成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果：西黃丸主要通過4味中藥、13個(gè)核心化學(xué)成分、19個(gè)核心靶標(biāo)、33條核心通路發(fā)揮其治療胃癌血瘀證的藥理作用。其治療的機(jī)制可能主要集中麝香、乳香等兩味中藥，涉及的通路主要包括腫瘤通路、致癌相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路、內(nèi)分泌與代謝相關(guān)通路等; 磷酸肌醇3激酶（PIK3CG）、磷脂酰肌醇3（PIK3R1）、核因子B1（NFKB1）、腫瘤蛋白P53（TP53）、細(xì)胞周期蛋白42（CDC42）等靶點(diǎn)可能在其治療胃癌血瘀證中發(fā)揮了重要的作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示核心成分與靶點(diǎn)之間有較強(qiáng)的結(jié)合力。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：西黃丸可以顯著抑制胃癌（MGC-803）細(xì)胞擬態(tài)管道的形成（P<0.01），且抑制作用等同于低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1α）抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-ME）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：西黃丸及2-ME均可以顯著降低小鼠胃癌組織中擬態(tài)管道的形成數(shù)目，二者的作用相似。結(jié)論：西黃丸的潛在化學(xué)成分可以治療胃癌血瘀證患者，還能抑制胃癌小鼠血管生成擬態(tài)的形成。

關(guān)鍵詞 中醫(yī)藥整合藥理學(xué);TCMIP V2.0;西黃丸;胃癌;血瘀證;調(diào)氣解毒;分子對(duì)接;病-證-方

Active Components and Mechanism of Xihuang Pills against Gastric Cancer with Blood Stasis Syndrome：Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

HE Zhongning1，CHEN Hong2，GUO Qiujun1，HUA Baojin1，LI Conghuang1

（1 Guang′anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 10053，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

Abstract Objective：To predict the potential active components of Xihuang Pills against gastric cancer with blood stasis syndrome based on Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine （TCMIP V2.0） and to explore the molecular mechanism.Methods：The chemical constituents of Xihuang Pills were retrieved from TCMIP V2.0 and a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine （BATMAN-TCM）， and the candidate targets of Xihuang Pills were predicted.Genes related to the gastric cancer and blood stasis syndrome were screened out and the disease-syndrome-prescription network was constructed.The core network was determined based on the network topology eigenvalue and David 6.8 was employed for the Gene Ontology （GO） term enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment of the core network.According to the number and frequency of the chemical components， the potential core components of Xihuang Pills against gastric cancer with the blood stasis syndrome and the corresponding targets and pathways were determined.Cytoscape 3.8.0 was used to plot the “core component-core target-core pathway” network， and Autodock 4.2 was applied for the docking of major components and core targets.Results：Xihuang Pills exerts therapeutic effect on gastric cancer with blood stasis syndrome through 4 medicinals， 13 core chemical components， 19 core targets， and 33 core pathways.The main medicinals were Moschus and Olibanum， and the pathways involved mainly included tumor pathway， carcinogenesis-related pathway， immune system pathway， and endocrine and metabolism-related pathway.Phosphatidylinositol-4， 5-bisphosphate 3-kinase， catalytic subunit gamma （PIK3CG）， phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1 （PIK3R1）， nuclear factor kappa B subunit 1 （NFKB1）， tumor protein p53 （TP53）， and cell division cycle 42 （CDC42） may play an important role in the treatment of blood stasis syndrome of gastric cancer.Molecular docking showed high binding affinity between the core components and the targets.In vitro experiments showed that Xihuang pills significantly inhibited the formation of mimicry channels in gastric cancer （MGC-803） cells （P<0.01）， and the inhibitory effect was equivalent to 2-methoxy-estradiol （2-ME）， an inhibitor of Hypoxia Inducible Faction-1 （HIF-1α）.In vivo experiments showed that both Xihuang Pills and 2-ME could significantly reduce the number of mimicry channels in mouse gastric cancer tissue， and their effects were similar.Conclusion：The potential chemical components of Xihuang pills can treat the patients with blood stasis syndrome of gastric cancer and inhibit the formation of angiogenic mimicry in mice with gastric cancer.

Keywords Integrative Pharmacology of traditional Chinese medicine; TCMIP V2.0; Xihuang Pills; Gastric cancer; Blood stasis; Regulating qi and detoxifying; Molecular docking; Disease-syndrome-prescription

中圖分類號(hào)：R273文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.02.003

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年胃癌新發(fā)病例超過100萬例，死亡病例達(dá)78萬例，使其成為最常診斷的第五大癌癥和癌癥死亡的第3大原因［1］。盡管目前手術(shù)、放化療、靶向治療等治療手段不斷進(jìn)步，但胃癌的總體預(yù)后仍然很差，晚期胃癌患者的生存率小于5%［2］。

胃癌可歸屬于中醫(yī)癓瘕、積聚等范疇，《醫(yī)林改錯(cuò)》言：“肚腹結(jié)塊，必有形之血。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“久病必瘀”“久病入絡(luò)”，童克家等［3］的臨床研究顯示：血瘀證素在晚期胃癌患者中占比較高，約占48.23%。血瘀證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)血液高凝狀態(tài)、血管生成、乏氧狀態(tài)等病理狀態(tài)密切相關(guān)［4］，且貫穿于腫瘤發(fā)生發(fā)展的始終;有研究表明，血瘀證是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因［5］。

調(diào)氣解毒法在腫瘤患者的治療過程中起到了關(guān)鍵作用，氣行則血行，氣滯則血凝，胃癌患者多氣血運(yùn)行不暢，癌毒內(nèi)蘊(yùn)于中焦，故臨床治療可以調(diào)氣解毒，活血散結(jié)為法。而西黃丸可作為調(diào)氣解毒法的代表方劑，西黃丸出自《外科證治全生集》，方由牛黃、麝香、乳香、沒藥等四味藥構(gòu)成，組方以麝香破血化瘀;牛黃清熱解毒;乳香、沒藥活血行氣，消腫止痛;全方共奏活血散結(jié)，調(diào)氣解毒之效。郭秋均的研究顯示：西黃丸可通過調(diào)控乏氧微環(huán)境抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［6］。

中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）主要包括來自《中醫(yī)藥百科全書》（ETCM）的5個(gè)數(shù)據(jù)庫資源，提供了中醫(yī)藥包括化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)等方面的基本信息，同時(shí)，采用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計(jì)算及可視化等方法和技術(shù)，形成7大整合藥理學(xué)分析模塊，可用于查詢和挖掘疾病、證候和方劑的生物學(xué)基礎(chǔ)和機(jī)制，進(jìn)而有效揭示中藥治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制［7-8］。本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)，探討西黃丸治療胃癌血瘀證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步深入研究西黃丸的有效成分、分子作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)［9］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫 中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP V2.0），中醫(yī)藥分子機(jī)制模型數(shù)據(jù)庫（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）生物信息注釋可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov），有機(jī)小分子活性數(shù)據(jù)庫（Pubchem）（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（RCSB Protein Data Bank）（http：//www.rcsb.org/），蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫（STRING）（https：//cn.string-db.org），分子在線對(duì)接平臺(tái)（Cavity-detection guided Blind Docking，CB-DOCK）（http：//clab.labshare.cn）。

1.1.2 細(xì)胞 人胃癌MGC-803細(xì)胞系購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，編號(hào)：1101HUM-PUMC000660。

1.1.3 動(dòng)物 4～6周齡無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0033。倫理審批號(hào)：IACUC-GAmH-2022-012。飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)于北京大學(xué)溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲食。

1.1.4 藥物 西黃丸（北京同仁堂藥店，批號(hào)：13043355），2-ME（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，批號(hào)：138019）。

1.1.5 試劑與儀器 低氧工作站（RUSKINN公司，英國(guó)，型號(hào)：INVIVO2 200），光學(xué)倒置顯微鏡（Nikon公司，日本，型號(hào)：TS100）。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 疾病靶點(diǎn)來源 TCMIP V2.0中“疾病相關(guān)分子庫”來源于基因相關(guān)性數(shù)據(jù)庫（DisGeNET），人類表型本體數(shù)據(jù)庫（HPO），Drugbank數(shù)據(jù)庫，治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD）等數(shù)據(jù)庫［10］。在TCMIP V2.0“疾病相關(guān)分子庫”中，以“Gastric cancer”“Stomach cancer”“Neoplasms of the Stomach”“Stomach Neoplasms”作為疾病關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，檢索出的所有靶點(diǎn)，作為胃癌的候選靶點(diǎn)集。

1.2.1.2 證候靶點(diǎn)來源 在TCMIP V2.0“疾病相關(guān)分子庫”中，以“不同的臨床表現(xiàn)”為切入點(diǎn)，通過血瘀證候相關(guān)臨床表現(xiàn)的英文詞條進(jìn)行檢索，相關(guān)基因集取并集，得出血瘀證的候選靶點(diǎn)譜。具體檢索詞見表1。

1.2.1.3 方劑靶點(diǎn)來源 利用TCMIP V2.0中“中藥材數(shù)據(jù)庫”收集“麝香”“牛黃”“乳香”“沒藥”等4味藥材的化學(xué)成分信息，并結(jié)合BATMAN-TCM模型數(shù)據(jù)庫的化學(xué)成分及既往文獻(xiàn)研究加以補(bǔ)充，最終構(gòu)建方劑的化學(xué)成分庫。設(shè)置Tanimoto Score為0.8（高準(zhǔn)確度）預(yù)測(cè)化學(xué)成分的候選靶點(diǎn)譜。TCMIP V2.0采用二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性搜索，并采用Tanimoto Score定義的相似度計(jì)量方法，通過與已經(jīng)上市，或FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的藥物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性比對(duì)，以Tanimoto Score定義的相似度計(jì)量方法進(jìn)行相似性打分［10］。

1.2.1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用TCMIP V2.0“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊，根據(jù)胃癌疾病基因集、證候（血瘀證）基因集和方劑（西黃丸）候選靶點(diǎn)之間的相互作用信息，構(gòu)建“疾病-證候-方劑”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。TCMIP V2.0可針對(duì)疾病、證候、方劑、中藥成分，構(gòu)建可視化的中藥多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò);平臺(tái)鑲嵌了HAPPI，Reactome，OPHID，InAct，HPRD，PDZBase，MINT，DIP等數(shù)據(jù)庫中PPI數(shù)據(jù)，設(shè)置了連接度（Degree），介度（Betweenness），緊密度（Closeness）3種網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦担ㄟ^相關(guān)計(jì)算來預(yù)測(cè)中藥治療疾病發(fā)揮藥效的關(guān)鍵靶點(diǎn);通過關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析，確定關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及其所參與的生物學(xué)通路［10］，分析方劑治療疾病的機(jī)制。

1.2.1.5 靶點(diǎn)富集分析與分子網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用David 6.8平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物通路富集分析，分析西黃丸治療胃癌血瘀證主要參與的生物通路，探討其治療的可能作用機(jī)制。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”分子網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白 在Pubchem數(shù)據(jù)庫下載西黃丸關(guān)鍵成分的sdf格式結(jié)構(gòu)文件，并利用Openbabel軟件將其轉(zhuǎn)化為pdb格式。借助RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)接采用AutoDock 4.2軟件進(jìn)行。在對(duì)接過程中，采用軟件中Autogrid模塊設(shè)置蛋白對(duì)接盒子，盒子大小根據(jù)蛋白質(zhì)與其已知配體的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行設(shè)定，對(duì)接采用拉馬克遺傳算法（LGA），并借助Pymol軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化制圖［11］。將出現(xiàn)頻次較多的主要成分和靶點(diǎn)中，選擇有實(shí)驗(yàn)構(gòu)型且有相互作用關(guān)系的4對(duì)成分-靶點(diǎn)采用AutoDock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能見圖5。一般認(rèn)為，分子對(duì)接時(shí)化合物與蛋白的結(jié)合能<-5 kcal/mol（1 cal=4.184 J）時(shí)表示有一定結(jié)合能力，<-7 kcal/mol時(shí)表示結(jié)合活性較強(qiáng)，結(jié)合能越小說明對(duì)接效果越好［11］。

1.2.2 體內(nèi)外試驗(yàn)

1.2.2.1 分組與模型制備 體外實(shí)驗(yàn)制備常氧和乏氧2種細(xì)胞培養(yǎng)條件，分別分為空白組、西黃丸組、2-ME組、2-ME聯(lián)合西黃丸組。常氧條件將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱20%常氧培養(yǎng)24 h，乏氧條件則將細(xì)胞置于5%低氧工作站中培養(yǎng)24 h，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為空白組、西黃丸組、2-ME組、2-ME+西黃丸組。其中包含西黃丸組灌胃給藥，包含2-ME組腹腔注射2-ME給藥。

1.2.2.2 干預(yù)方法 建立體外模型，西黃丸干預(yù)24 h，倒置顯微鏡下觀察各組MGC-803細(xì)胞成管情況并計(jì)數(shù);建立體內(nèi)模型后，待小鼠7 d成瘤，藥物干預(yù)14 d后脫頸處死小鼠，將小鼠腫瘤組織固定包埋切片，鏡下觀察隨機(jī)5個(gè)視野內(nèi)的擬態(tài)血管數(shù)量。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 5軟件分析上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果并繪圖，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 病-證-方關(guān)聯(lián)核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 共獲得疾病靶點(diǎn)67個(gè)，證候靶點(diǎn)473個(gè)，藥物靶點(diǎn)1 204個(gè)，利用平臺(tái)中“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)”中的“疾病-證候-方劑”關(guān)聯(lián)分析模塊，選擇疾病，證候，方劑的靶點(diǎn)集后提交，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)分析計(jì)算，結(jié)果顯示，與胃癌、血瘀證、西黃丸相關(guān)的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)共226個(gè);疾病、證候、方劑、核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的韋恩圖如圖1。其中胃癌與血瘀證之間有11個(gè)共同靶點(diǎn)，血瘀證與西黃丸之間有73個(gè)共同靶點(diǎn)，胃癌與西黃丸之間有16個(gè)共同靶點(diǎn)。可以看出核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)中其中屬于疾病的靶點(diǎn)有31個(gè)，屬于證候的靶點(diǎn)有76個(gè)，屬于方劑的靶點(diǎn)有164個(gè)，屬于病證方共有的有5個(gè)。為了再一次縮小核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的范圍，提高分析結(jié)果的精確性，將平臺(tái)富集的226個(gè)核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)依次按Degree、Closeness、Betweenness由高至低依次排序，并利用David對(duì)排名前100位的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，共富集到KEGG通路（P≤0.05）共133條，針對(duì)胃癌相關(guān)機(jī)制對(duì)通路進(jìn)行篩選，共選出來60條通路，排名前20位的通路見表2。對(duì)這些通路涉及到的屬于西黃丸的方劑靶點(diǎn)與方劑靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行靶點(diǎn)數(shù)量、靶點(diǎn)頻次、成分頻次的統(tǒng)計(jì)，選取靶點(diǎn)數(shù)量在5以上，靶點(diǎn)頻次在30以上的成分作為核心成分，共13個(gè)核心成分。13個(gè)核心成分有4個(gè)核心成分屬于牛黃，7個(gè)核心成分屬于麝香，乳香，沒藥各含有1個(gè)核心成分。見表3。

2.1.2 核心成分的驗(yàn)證 核心成分中共涉及74個(gè)靶點(diǎn)，選取在通路中出現(xiàn)5次以上的21個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，共富集出65條通路（P≤0.05），其中與胃癌相關(guān)的有33條，占50.8%，此33條核心通路可分為腫瘤通路、致癌相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路、內(nèi)分泌與代謝通路等4個(gè)通路模塊。見表4。

核心通路中涉及的靶點(diǎn)為19個(gè)，與從核心成分中統(tǒng)計(jì)出來的21個(gè)差2個(gè)，占比90.5％。故最終確定的核心靶點(diǎn)為19個(gè)，這19個(gè)靶點(diǎn)在核心通路出現(xiàn)的頻次統(tǒng)計(jì)見圖2。對(duì)這13個(gè)核心成分，19個(gè)核心靶點(diǎn)，33條核心通路利用Cytoscape進(jìn)行作圖，將分析結(jié)果進(jìn)行可視化。13個(gè)核心成分有4個(gè)核心成分屬于牛黃，7個(gè)核心成分屬于麝香，乳香，沒藥各含有1個(gè)核心成分，19個(gè)核心靶點(diǎn)富集的核心通路主要分為腫瘤通路、致癌相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路、內(nèi)分泌與代謝通路等4個(gè)模塊，具體見圖3。

2.1.3 靶點(diǎn)GO生物過程富集分析 對(duì)19個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，可以看出：在生物過程中，主要涉及基因表達(dá)、藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞吞噬、血小板活化、細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)物質(zhì)合成等過程；在細(xì)胞組分中，以細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)成分為主;在分子功能中，主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、離子通道結(jié)合通路;蛋白磷酸酶、一氧化氮合酶等多種酶活性通路。見圖4。

2.1.4 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 大部分化合物與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力較強(qiáng)。特別是雌二醇和PIK3CG，結(jié)合能為-9.1 kcal/mol。見圖5。為了更加直觀地體現(xiàn)關(guān)鍵化合物和核心靶點(diǎn)的相互作用模式，圖6中展示了這9對(duì)化合物對(duì)接后復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示意圖。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 西黃丸及2-ME體外干預(yù)MGC-803細(xì)胞成管的情況 西黃丸在常氧和乏氧環(huán)境下均可以顯著抑制胃癌MGC-803細(xì)胞擬態(tài)血管的形成（P<0.01），乏氧狀態(tài)下抑制作用更為明顯，且與HIF-1α抑制劑2-ME的作用相似。同時(shí)，2-ME聯(lián)合西黃丸可以更好的抑制腫瘤細(xì)胞擬態(tài)血管形成數(shù)目，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 西黃丸及2-ME干預(yù)荷MGC-803細(xì)胞裸鼠移植瘤擬態(tài)血管形成的情況 西黃丸可降低小鼠胃癌腫瘤組織中管道的形成數(shù)，作用與2-ME相似，二者聯(lián)合可以更好的抑制管道形成。見圖8。

3 討論

通過TCMIP V2.0平臺(tái)基于3個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦档倪\(yùn)算，在病證方的總靶點(diǎn)中挑出了226個(gè)初步核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)，方便高效地縮小了范圍，為進(jìn)一步深入研究西黃丸的有效成分、分子作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。再通過David 6.8進(jìn)行富集分析以及篩選，最終確定了13個(gè)核心成分，19個(gè)核心靶點(diǎn)，33條核心通路。這些核心靶點(diǎn)在功能上顯著參與了多種胃癌相關(guān)通路，包括VEGF信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、血小板活化、細(xì)胞凋亡、免疫系統(tǒng)通路等多個(gè)信號(hào)通路。

花寶金團(tuán)隊(duì)近期提出以“調(diào)氣解毒”為惡性腫瘤的主要治療原則，而西黃丸可作為調(diào)氣解毒的代表方劑，既往臨床研究證實(shí)其治療胃癌血瘀證有一定的臨床作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)西黃丸治療胃癌血瘀證的已報(bào)道核心成分主要包括雌二醇、麝香酮類化合物、尿囊素、乳香酸類化合物、麥角胺等。雌二醇作為一種常見類固醇化合物，具有一定的抗微管蛋白作用，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬［12］。麝香酮是麝香的重要成分和生理活性物質(zhì)，能通過阻斷腫瘤新生血管的形成以發(fā)揮其抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移［13］。既往研究證實(shí)：尿囊素可以減少鉑類藥物的神經(jīng)毒性，還能改善血液高凝狀態(tài)，可作為癌癥治療的輔助藥物［14］。乳香酸類化合物已被證實(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、參與腫瘤細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)［15］。劉建平［16］研究發(fā)現(xiàn)麥角胺可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并能進(jìn)抑制其增殖與侵襲。

本研究中，PIK3CG、PIK3R1、NFKB1、TP53、CDC42等靶點(diǎn)出現(xiàn)頻率高，以上靶點(diǎn)參與了多種信號(hào)通路，是西黃丸治療胃癌血瘀證的關(guān)鍵靶點(diǎn)。磷酸肌醇-3激酶催化亞單位γ（Phosphoinositide-3 Kinase Catalytic Subunit-gamma，PIK3CG）是磷酸肌醇-3激酶家族的成員，可參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)，既往研究發(fā)現(xiàn)靶向抑制PIK3CG基因的表達(dá)可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和遷移抑制［17］，發(fā)揮其抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的作用［18］。磷脂酰肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基1（Phosphoinositide-3-kinase Regulatory Subunit 1，PIK3R1）在多種類型惡性腫瘤的形成中起著關(guān)鍵作用，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，PIK3R1基因的下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲均具有抑制作用［19］。NFKB1基因的表達(dá)與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡等病理生理過程相關(guān)，敲除胃癌小鼠的NFKB1基因會(huì)導(dǎo)致小鼠胃中腫瘤壞死因子的表達(dá)增加，從而促進(jìn)炎癥免疫反應(yīng)和胃癌的發(fā)展［20］。TP53基因編碼的蛋白可參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡、衰老、DNA修復(fù)、代謝等改變［21-22］。ANDO等［23］研究發(fā)現(xiàn)TP53基因表達(dá)陽性的患者腫瘤浸潤(rùn)更深，淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的更多。細(xì)胞分裂周期蛋白42（Cell Division Cycle42，CDC42是Rho GTP酶家族的成員，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，有研究表明CDC42的下調(diào)可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1/S期來抑制胃癌細(xì)胞的增殖［24］。

核心通路中基本涵蓋了胃癌的病理生理過程，與我們的預(yù)測(cè)結(jié)果一致，如腫瘤相關(guān)通路、致癌相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路、內(nèi)分泌與代謝相關(guān)通路等信號(hào)通路。提示我們的藥理學(xué)策略具有很高的準(zhǔn)確性。其中VEGF信號(hào)通路是常見的血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移通路［25］，PI3K-AKT信號(hào)通路是一種常見的自噬相關(guān)信號(hào)通路，它的異常激活會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程［26］。RAS蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)、遷移及血管生成，有研究表明RAS信號(hào)通路的激活可以抑制BGC-823胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［27］。ErbB信號(hào)通路的異常激活可能引起腫瘤細(xì)胞增值分化，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［28］。其他信號(hào)通路大多作用于免疫系統(tǒng)來發(fā)揮其抗腫瘤作用。

本研究利用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)TCMIP v2.0及BATMAN-TCM模型數(shù)據(jù)庫收集西黃丸所含化學(xué)成分的候選靶點(diǎn)譜、胃癌的疾病基因集和血瘀證證候基因集，構(gòu)建“病-證-方”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)靶點(diǎn)數(shù)量和頻次圈定治療胃癌的核心成分、核心靶點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能富集分析，明確核心成分發(fā)揮療效的作用機(jī)制。結(jié)果表明，西黃丸可通過4味中藥、13個(gè)核心化學(xué)成分、19個(gè)核心靶點(diǎn)、33條核心通路發(fā)揮其治療胃癌血瘀證的藥理作用。其干預(yù)治療的機(jī)制可能主要集中麝香、乳香等2味中藥，涉及的通路主要包括腫瘤相關(guān)通路、致癌相關(guān)通路、免疫系統(tǒng)通路、內(nèi)分泌與代謝通路等;PIK3CG、PIK3R1、NFKB1、TP53、CDC42等靶點(diǎn)可能在其中發(fā)揮了重要的作用。

本研究團(tuán)隊(duì)既往體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)：西黃丸可以有效抑制胃癌血管生成擬態(tài)的形成［6］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：西黃丸可以顯著抑制胃癌（MGC-803）細(xì)胞擬態(tài)管道的形成（P<0.01），且抑制作用等同于低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1α）抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-ME）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：西黃丸及2-ME均可以顯著降低小鼠胃癌組織中擬態(tài)管道的形成數(shù)目，二者的作用相似。體內(nèi)外試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)西黃丸對(duì)于胃癌血管生成有一定的抑制作用。本研究為中藥復(fù)方作用機(jī)制的初步探索提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效的方法，可以為未來實(shí)體實(shí)驗(yàn)提供方向性的參考，有助于推進(jìn)中藥復(fù)方的研究進(jìn)展。

利益沖突聲明：無。

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（2022-06-11收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（7212189）作者簡(jiǎn)介：賀忠寧（1996.05—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科（腫瘤學(xué)），E-mail：1151593118@qq.com通信作者：李叢煌（1982.07—），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合（腫瘤學(xué)），E-mail：liconghuang@163.com