健脾祛濕方對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠血脂、胃腸功能、水液代謝的影響及作用機(jī)制

趙凡　姜硯馨　蔡祥焜　鄭婷　張惠　田世民　張朋朋　王林元　王淳　鄭立新　張建軍

摘要 目的：觀察健脾祛濕方對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠血脂、胃腸功能、水液代謝的影響及作用機(jī)制。方法：將56只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（n=8）和造模組（n=48），采用“勞倦過(guò)度+飲食不節(jié)+高脂飼料喂養(yǎng)”復(fù)制脾虛濕盛型高脂血癥大鼠模型。造模4周后，根據(jù)總膽固醇（TC）水平將造模組隨機(jī)分成6組：即模型組，血脂康組，參苓白術(shù)顆粒組，健脾祛濕方低、中、高劑量組，每組8只。分組后開(kāi)始給藥，灌胃劑量為1 mL/100 g，空白組、模型組給予生理鹽水，其余組給予相應(yīng)的受試物，連續(xù)給藥6周。測(cè)定血脂四項(xiàng)TC、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-Ch）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-Ch），胃腸激素，即胃動(dòng)素（MTL）、促胃液素（GAS）和血管活性腸肽（VIP），水液調(diào)節(jié)激素醛固酮（ALD）、抗利尿激素（ADH）和心房利尿鈉肽（ANP），以及白蛋白（ALB）和總蛋白（TP），采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察胃、結(jié)腸組織形態(tài)，免疫熒光法檢測(cè)結(jié)腸水孔蛋白（AQP）3、胃AQP4的表達(dá)位置及水平，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)結(jié)腸、胃組織中閉合蛋白（Occludin）的表達(dá)量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-Ch水平升高（P<0.001），HDL-Ch水平降低（P<0.05），血清MTL、GAS水平降低（P<0.001，P<0.01），VIP升高（P<0.001），ALD、ADH升高（P<0.05，P<0.001），ANP水平顯著降低（P<0.001），TP、ALB水平降低（P<0.001，P<0.05）。結(jié)腸絨毛、胃黏膜出現(xiàn)大量脫落情況，結(jié)腸AQP3熒光強(qiáng)度降低，胃AQP4熒光表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)腸、胃組織Occludin表達(dá)水平降低。與模型組比較，血脂康組、參苓白術(shù)顆粒組、健脾祛濕方低、中、高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-Ch水平呈下降趨勢(shì)，HDL-C水平升高，MTL、GAS顯著升高，VIP水平顯著降低，ALD、ADH水平降低，ANP顯著升高，結(jié)腸、胃組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善。結(jié)腸AQP3熒光表達(dá)增強(qiáng)，胃AQP4熒光強(qiáng)度減弱，結(jié)腸、胃組織Occludin表達(dá)水平增強(qiáng)。結(jié)論：健脾祛濕方可降低脾虛濕盛型高脂血癥大鼠血脂，有健脾祛濕之功，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Occludin、AQP3、AQP4的表達(dá)，保護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性達(dá)到促進(jìn)胃腸消化吸收功能，改善水液代謝障礙的作用。

關(guān)鍵詞 健脾祛濕方；脾虛濕盛證；胃腸功能；水液代謝；高脂血癥；水孔蛋白；緊密連接；腸黏膜屏障

Effect and Mechanism of Jianpi Qushi Prescription on Blood Lipids，Gastrointestinal Function and Water Metabolism of Hyperlipidemic Rats with Spleen Deficiency and Dampness

ZHAO Fan1，JIANG Yanxin1，CAI Xiangkun2，3，ZHENG Ting1，ZHANG Hui1，TIAN Shimin2，3，ZHANG Pengpeng2，3，WANG Linyuan1，WANG Chun1，ZHENG Lixin2，3，ZHANG Jianjun1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Test Center，Beijing 100123，China; 3 CAIQTEST（Beijing） Co.，Ltd.，Beijing 100175，China）

Abstract Objective：To observe the effect and mechanism of Jianpi Qushi Prescription（JPQS） on blood lipids，gastrointestinal function and water metabolism of hyperlipidemic rats with spleen deficiency and dampness.Methods：A total of 56 SD rats were randomly divided into blank group（n=8） and modeling group（n=48）.A hyperlipidemic rat model with spleen deficiency and dampness was replicated by overfatigue+irregular diet+high-fat feeding.After 4 weeks of modeling，the modeling group was randomly divided into 6 groups according to total cholesterol（TC） level：model group，Xuezhikang group，Shenling Baizhu Granules group，and JPQS low-，medium-and high-dose groups，with 8 in each group.After grouping，drugs were administered by gavage at a dose of 1 mL/100 g.The blank group and the model group were given normal saline，while the other groups were given corresponding drugs for 6 consecutive weeks.Four blood lipid indexes［TC，triglycerides（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-Ch），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-Ch）］，gastrointestinal hormones［motilin（MTL），gastrin（GAS），vasoactive intestinal peptide（VIP）］，water regulation hormones［aldosterone（ALD），anti-diuretic hormone（ADH），atrial natriuretic hormone（ANP）］，albumin（ALB） and total protein（TP） were detected.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the morphology of gastric and colonic tissues.Immunofluorescence assay was performed to detect the expression position and level of aquaporin 3（AQP3） in colon and AQP4 in stomach，and Western blot was performed to detect the expression level of Occludin in colonic and gastric tissues.Results：Compared with the blank group，the model group had increased serum levels of TC，TG，and LDL-Ch（P<0.001），VIP（P<0.001） and ALD and ADH（P<0.05，P<0.001），and decreased serum levels of HDL-Ch（P<0.05），MTL and GAS（P<0.001，P<0.01），ANP（P<0.001） and TP and ALB（P<0.001，P<0.05）.Additionally，colon villi and gastric mucosa were shed in large amounts in the model group，with reduced fluorescence intensity of AQP3 in colon，enhanced fluorescence expression of AQP4 in stomach，and down-regulated expression of Occludin in colon and gastric tissues.Compared with the conditions in the model group，the serum levels of TC，TG and LDL-Ch of rats in administration groups presented a downward trend，while the HDL-C level was elevated; MTL and GAS were significantly up-regulated，while VIP was significantly reduced; a decrease was found in ALD and ADH，while a remarkable increase was found in ANP; the morphological structure of colonic and gastric tissues was improved，with enhanced fluorescence expression of AQP3 in colon，weakened fluorescence intensity of AQP4 in stomach and elevated expression of Occludin in colonic and gastric tissues.Conclusion：JPQS reduces the blood lipids of hyperlipidemic rats with spleen deficiency and dampness and shows the effect of invigorating spleen and removing dampness.The mechanism may be regulating the expressions of Occludin，AQP3 and AQP4 to protect the structural integrity of tight junctions and promote gastrointestinal digestion and absorption，thereby improving the water metabolism disorders.

Keywords Jianpi Qushi Prescription; Syndrome of spleen deficiency and dampness; Gastrointestinal function; Water metabolism; Hyperlipidemia; Aquaporin; Tight junction; Intestinal mucosal barrier

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.002

《素問(wèn)·經(jīng)脈別論篇》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水津四布，五經(jīng)并行。”［1］中焦脾胃在水谷精微運(yùn)輸代謝過(guò)程發(fā)揮重要作用。有學(xué)者認(rèn)為脾主運(yùn)化是全身組織能量代謝的中心環(huán)節(jié)，生理結(jié)構(gòu)是精微、水濕運(yùn)化的樞紐，負(fù)責(zé)機(jī)體整個(gè)飲食物的代謝；解剖結(jié)構(gòu)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最大的消化器官肝臟；物質(zhì)交換系統(tǒng)負(fù)責(zé)消化、吸收、排泄的消化系統(tǒng)和新陳代謝［2］。脾居中土，運(yùn)化水濕，脾健則水含土中，津液四布，脾虛則土不固水、濕濁泛濫。“諸濕腫滿，皆屬于脾”，脾虛與濕濁常互為因果，相伴而生［3］。

健脾祛濕方具有健脾祛濕、化濁降脂功效，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)饑飽交替喂養(yǎng)大鼠高脂飼料結(jié)合勞倦過(guò)度的方法建立脾虛濕盛型高脂血癥大鼠模型，通過(guò)觀察大鼠胃腸激素、水液調(diào)節(jié)激素及相關(guān)蛋白水平，探究健脾祛濕方對(duì)血脂、胃腸功能及水液代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體（Specific Pathogen-Free，SPF）級(jí)健康雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［批號(hào)：SCXK（京）2016-0011］。飼養(yǎng)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［批號(hào)：SYXK（京）2018-0007］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠自由飲水，飼養(yǎng)室溫度為20～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，燈照周期為12 h，7：00～19：00燈照，19：00～7：00黑暗。實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：2021-FD-019）。

1.1.2 藥物 健脾祛濕方（紅曲、白術(shù)、葛根、茯苓、山楂的比例為3∶12∶16∶16∶12），血脂康（北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)：20210340），參苓白術(shù)顆粒（北京同仁堂，批號(hào)：21111016）。

1.1.3 試劑與儀器 總膽固醇（Total Cholesterol，TC）試劑盒（批號(hào)：211771）、三酰甘油（Triglyceride，TG）試劑盒（批號(hào)：211101）、高密度脂蛋白膽固醇（High Density Lipoprotein-Colesterol，HDL-C）試劑盒（批號(hào)：211481）、低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein-Colesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)：211581）、血清總蛋白（Serum Total Protein，STP）試劑盒（批號(hào)：210911）、白蛋白（Albumin，ALB）試劑盒（批號(hào)：210961），以上檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技有限公司；胃動(dòng)素（Motilin，MTL）試劑盒（貨號(hào)：ml003079）、促胃液素（Gastrin，GAS）試劑盒（貨號(hào)：ml975012）、血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）試劑盒（貨號(hào)：ml936589）、醛固酮（Aldosterone，ALD）試劑盒（貨號(hào)：ml002876）、心房利尿鈉肽（Atrial Natriuretic Peptide，ANP）試劑盒（貨號(hào)：ml154710）、抗利尿激素（Antidiuretic Hormone，ADH）試劑盒（貨號(hào)：ml059245），以上檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司；RIPA裂解液（貨號(hào)：P0013C）、PMSF（貨號(hào)：ST506）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（貨號(hào)：P1045）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號(hào)：A0208）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（貨號(hào)：A0216），購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。水孔蛋白4（Aquaporin 4，AQP4）抗體（貨號(hào)：16473-1-AP）、Occludin抗體（貨號(hào)：13409-1-AP）、β-actin（貨號(hào)：66009-1-lg），購(gòu)自美國(guó)proteintech公司；水孔蛋白3（Aquaporin 3，AQP3）抗體（abcam公司，英國(guó)，批號(hào)：ab125219）；全自動(dòng)生化分析儀（東芝，日本，型號(hào)：TBA-120FR），小動(dòng)物麻醉機(jī)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：ZS-MV），離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：4-5R），多功能酶標(biāo)儀（伯騰儀器有限公司，美國(guó)，型號(hào)：Epoch2C），電泳儀、蛋白電轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad，美國(guó)，型號(hào)：PowerPac Basic），凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：620013-9Q）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 除空白組外，其余各組均采用高脂飼料喂養(yǎng)，單日飽食，雙日禁食，同時(shí)每日下午以10%體質(zhì)量鉛塊尾部負(fù)重，放入水溫（20±2）℃，水深50 cm的圓筒中游泳，游泳至力竭，鼻尖沒(méi)入水中10 s停止。連續(xù)造模10周。SD大鼠動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，造模前隨機(jī)分為2組，空白組8只，造模組48只。每周稱(chēng)重1次。實(shí)驗(yàn)第8天，除空白組給予普通飼料飼養(yǎng)外，造模組（48只）均采用“勞倦過(guò)度+飲食不節(jié)+高脂飼料飼養(yǎng)”復(fù)制脾虛濕盛型高脂血癥大鼠模型。造模4周后，空白組和造模組大鼠不禁食采血（眼內(nèi)眥），采血后盡快分離血清，測(cè)定血清TC、TG、LDL-Ch、HDL-Ch水平。根據(jù)TC水平將造模組隨機(jī)分6組：模型組、血脂康組、參苓白術(shù)顆粒組、健脾祛濕方低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 給藥的灌胃劑量為1 mL/100 g，空白組、模型組給予生理鹽水，血脂康組［0.12 g/kg，相當(dāng)于人體0.02 g/（kg·d）］、健脾祛濕方低、中、高劑量組（1.2 g/kg、2.4 g/kg、3.6 g/kg生藥量，分別相當(dāng)于人體推薦量的5倍、10倍、15倍）給予相應(yīng)的藥物，連續(xù)給藥6周。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法

1.2.3.1 生化分析指標(biāo) 取材前禁食不禁水12 h，于取材前2 h稱(chēng)體質(zhì)量后腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1～2 h，3 500 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，分離血清，取上清液。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、LDL-Ch、HDL-Ch、ALB和TP含量。

1.2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo) 使用腹主動(dòng)脈取血，得到血清。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)MTL、GAS、VIP、ALD、ANP和ADH含量。

1.2.3.3 結(jié)腸、胃組織病理形態(tài) 將大鼠胃、結(jié)腸置于4%多聚甲醛48 h以上，梯度脫水，石蠟包埋，將蠟塊放入冰水中，隨后切片（片厚約5 μm），載玻片撈出烘干表面水分。用HE染色，洗滌10 min，95%乙醇脫水2 min重復(fù)洗2次，二甲苯透明5 min重復(fù)洗2次，中性樹(shù)膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3.4 結(jié)腸組織AQP3、胃組織AQP4免疫熒光表達(dá) 石蠟切片脫蠟恢復(fù)，進(jìn)行抗原修復(fù)處理。滴加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）洗滌3次，5 min/次。滴加二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次。滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚4′（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細(xì)胞核后，使用抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡拍照。

1.2.3.5 結(jié)腸、胃Occludin表達(dá) 采用放射免疫沉淀法裂解液按比例加入苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF）、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，冰上勻漿，4 ℃，12 000×g，離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行組織濃度測(cè)定，計(jì)算上樣量，加入5×上樣緩沖液和定量放射免疫沉淀法裂解液，制備成等濃度等體積的樣品，渦旋混勻，100 ℃變性5 min。配置SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳膠（8%分離膠＋5%濃縮膠），上樣后先恒壓80 V跑30 min，隨后恒壓120 V跑90 min，至marker跑到底部停止電泳。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓120 V 90 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，1×洗滌緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗滌5次，5 min/次，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，回收一抗。1×TBST洗滌5次，5 min/次，二抗孵育1 h，1×TBST洗滌5次，5 min/次。制備顯影液，利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像、分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠血脂四項(xiàng)的影響與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-Ch含量顯著升高（均P<0.001），HDL-Ch含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，血脂康、參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低劑量組TC含量降低（P<0.01，P<0.05，P<0.01）；血脂康、參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低、高劑量組TG含量顯著降低（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；血脂康、健脾祛濕方低、中、高劑量組LDL-Ch含量顯著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01）；血脂康、健脾祛濕方中、高劑量組HDL-Ch含量顯著升高（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠MTL、GAS、VIP的影響 與空白組比較，模型組大鼠MTL、GAS水平顯著降低（P<0.001、P<0.01），VIP水平顯著升高（P<0.001）。與模型組比較，血脂康、參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低、中劑量組MTL含量升高（P<0.001）；參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低、中、高劑量組GAS含量升高（P<0.01，P<0.01，P<0.001，P<0.05）；血脂康、參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低、中、高劑量組VIP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠ALD、ANP、ADH的影響 與空白組比較，模型組大鼠ALD、ADH水平顯著升高（P<0.05，P<0.001），ANP水平顯著降低（P<0.001）。與模型組比較，健脾祛濕方中、高劑量組ALD水平顯著降低（均P<0.001）；各給藥組ANP含量升高，ADH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表3。

2.4 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥復(fù)合模型大鼠TP、ALB的影響 與空白組比較，模型組大鼠TP、ALB水平顯著降低（P<0.001，P<0.05）。與模型組比較，血脂康、參苓白術(shù)顆粒、健脾祛濕方低、中、高劑量組TP水平顯著升高（P<0.001、P<0.01，P<0.001，P<0.01，P<0.01）；血脂康、健脾祛濕方低、中、高劑量組ALB水平顯著升高（P<0.001，P<0.05，P<0.001，P<0.01）。見(jiàn)表4。

2.5 對(duì)脾虛濕盛高脂血癥大鼠結(jié)腸、胃組織病理形態(tài)的影響 空白組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組結(jié)腸結(jié)構(gòu)模糊，腸絨毛存在大量脫落現(xiàn)象，存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。血脂康組、參苓白術(shù)顆粒組、健脾祛濕方低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)、腸絨毛損傷程度均較模型組有所緩解。見(jiàn)圖1。

空白組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)較完整，腺體排列整齊，大小均一。模型組胃黏膜出現(xiàn)大量脫落情況，腺體分散，排列紊亂。各給藥組胃組織病理形態(tài)均較模型組有所改善。見(jiàn)圖1。

2.6 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠結(jié)腸AQP3、胃AQP4蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸AQP3熒光強(qiáng)度降低，胃AQP4熒光表達(dá)增強(qiáng)；給藥處理后，各給藥組結(jié)腸AQP3熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，胃AQP4熒光表達(dá)減弱。見(jiàn)圖2。

2.7 對(duì)脾虛濕盛型高脂血癥大鼠結(jié)腸、胃Occludin表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組結(jié)腸、胃Occludin表達(dá)降低，其中結(jié)腸Occludin表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組結(jié)腸、胃Occludin表達(dá)增強(qiáng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

東漢醫(yī)家張仲景在《傷寒論》中有云：“脾助胃氣消磨水谷，脾氣不轉(zhuǎn)，則胃中水谷不得磨消。”脾失健運(yùn)，常伴有胃腸消化、吸收功能減弱。MTL、GAS、VIP對(duì)胃腸功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用，其中MTL、GAS屬于興奮性胃腸激素，VIP屬于抑制性胃腸激素。MTL可促進(jìn)和影響胃腸運(yùn)動(dòng)及胃腸道水、電解質(zhì)的運(yùn)輸；GAS能調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，在調(diào)節(jié)消化道的功能和維持消化道結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)揮著重要作用，二者含量降低表明了胃腸消化功能低下或紊亂。VIP是腸道主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，能抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，是胃腸道疾病研究的重要指標(biāo)［4］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠MTL、GAS水平降低，VIP水平升高，提示模型大鼠胃腸消化功能減弱。健脾祛濕方干預(yù)后，大鼠體內(nèi)血清MTL、GAS水平顯著提高，VIP含量降低，表明健脾祛濕方可改善胃腸消化功能，具有一定的健脾功效。

一般認(rèn)為濕證的病理基礎(chǔ)是機(jī)體的水液代謝障礙，而機(jī)體水液代謝也受體內(nèi)多種體液因素調(diào)節(jié)。ALD是腎上腺球狀帶合成和分泌的類(lèi)固醇激素，可促進(jìn)腎小管和集合管主動(dòng)吸收Na+，排出K+，具有保鈉保水作用，影響調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和電解質(zhì)，對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用［5］。ADH可提高腎遠(yuǎn)曲小管與集合管上皮細(xì)胞對(duì)水的通透性，促進(jìn)水的重吸收，從而減少尿量。正常狀態(tài)下，機(jī)體ADH的分泌量與血漿滲透壓成反比［6］。ANP由心房合成、貯存和分泌，具有利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓作用，可抑制集合管對(duì)NaCl和水的重吸收，增加排尿量，為體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)及抗利尿激素作用的對(duì)抗激素［7］。研究顯示，模型組大鼠ALD、ADH水平顯著升高，ANP水平顯著降低，說(shuō)明體內(nèi)水、鈉電解質(zhì)大量積聚，出現(xiàn)濕邪內(nèi)停的癥狀。健脾祛濕方組大鼠體內(nèi)ALD、ADH水平下降，ANP含量上升，表明大鼠體內(nèi)水液積聚的現(xiàn)象有所改善。血脂水平在反映機(jī)體脂代謝狀態(tài)的同時(shí)，也表明了體內(nèi)濕濁的情況。研究發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C含量增高，提示健脾祛濕方在改善機(jī)體濕邪內(nèi)停的同時(shí)，對(duì)脂代謝紊亂也具有一定的調(diào)節(jié)作用。

滲透壓是判斷水、電解質(zhì)代謝紊亂的重要標(biāo)志之一，也是維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素［8］。TP、ALB是評(píng)定機(jī)體水液代謝的常見(jiàn)指標(biāo)，TP反映了機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能，機(jī)體蛋白質(zhì)吸收不良，血漿膠體滲透壓降低，可導(dǎo)致體液平衡失調(diào)［9］。ALB占血漿膠體滲透壓80%，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組織和血管內(nèi)外水分的動(dòng)態(tài)交換，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。臨床中也常用ALB含量降低來(lái)判斷水腫的發(fā)生。本研究表明，模型組大鼠體內(nèi)TP、ALB水平顯著降低，健脾祛濕方干預(yù)后，TP、ALB水平顯著升高，可見(jiàn)健脾祛濕方能使機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，水液及能量代謝正常。

AQP是一類(lèi)特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的蛋白，是胃腸道水液運(yùn)輸?shù)闹饕缂?xì)胞蛋白，其在胃腸道的生理作用除了水轉(zhuǎn)運(yùn)外，還具有胃液分泌及屏障功能等作用［10-11］。AQP3具有相對(duì)選擇性，主要分布在結(jié)腸黏膜腔面細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞基底側(cè)，是結(jié)腸中水運(yùn)輸最重要的功能分子之一，可將腸腔的水轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞間隙［12］。AQP4為經(jīng)典AQP，除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)豐富外，也廣泛分布于哺乳動(dòng)物胃腸道，參與胃腸道水液代謝及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，對(duì)水具有選擇透過(guò)性作用［13］。機(jī)體發(fā)生腸炎或腹瀉過(guò)程中，AQP家族中如AQP1、AQP3、AQP4、AQP7、AQP8、AQP10、AQP11等在小腸和大腸中的表達(dá)會(huì)下調(diào)［11］。同時(shí)研究表明AQP4在黏膜滲透調(diào)節(jié)和維持黏膜完整性中起著重要的代償作用，SD大鼠經(jīng)乙醇誘導(dǎo)后引起水腫及胃損傷時(shí)，其胃部AQP4表達(dá)會(huì)增強(qiáng)［14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸AQP3水平下降，胃AQP4水平上升，健脾祛濕方干預(yù)后，大鼠結(jié)腸AQP3、胃AQP4表達(dá)水平均有所改善。機(jī)體的腸黏膜屏障功能受損時(shí)，腸道的消化功能受到影響，也會(huì)造成胃腸功能紊亂［15］。緊密連接是腸黏膜機(jī)械屏障的核心結(jié)構(gòu)，其中Occludin是第一個(gè)被確認(rèn)的完整的膜緊密連接蛋白，與各種連接功能有關(guān)，在維持腸道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能方面發(fā)揮重要作用［16-17］。本研究在檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織Occludin表達(dá)的同時(shí)，對(duì)胃組織中的結(jié)構(gòu)蛋白也進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸、胃組織中的Occludin表達(dá)降低，結(jié)合病理切片觀察，認(rèn)為模型組大鼠結(jié)腸、胃黏膜受損，緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性被破壞。給藥處理后，Occludin表達(dá)增強(qiáng)，提示大鼠結(jié)腸、胃組織受損的緊密連接結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笪改c激素、水調(diào)節(jié)激素及相關(guān)蛋白與文獻(xiàn)報(bào)道一致，健脾祛濕方干預(yù)后，綜合研究中的指標(biāo)表現(xiàn)，認(rèn)為其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Occludin、AQP3、AQP4的表達(dá)，保護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，達(dá)到促進(jìn)胃腸消化吸收功能，改善水液代謝障礙的作用，發(fā)揮了健脾祛濕的功效。本研究在一定程度上揭示健脾祛濕方辨證論治脾虛濕盛型高脂血癥的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明：無(wú)。

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（2022-11-15收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706803）作者簡(jiǎn)介：趙凡（1995.10—），女，碩士，研究方向：中藥基本理論與臨床應(yīng)用，E-mail：zhaofanfan121@163.com通信作者：張建軍（1965.08—），女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：基于中藥藥性與臨床應(yīng)用的藥效機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：zhangjianjun@bucm.edu.cn；鄭立新（1980.08—），女，碩士，副高級(jí)工程師，研究方向：毒理與保健食品功能，E-mail：594782086@qq.com