校園內流浪犬貓的弓形蟲病流行病學調查

馬玉捷 文星星 申童 向瓊昊

摘要：本調查旨在了解弓形蟲病在校園流浪動物（犬、貓）體內的感染情況，于2018.9月～2022.2月期間，在湖南生物機電職業技術學院采集流浪犬、貓血清樣品及糞便樣品共52份，采用熒光探針法進行犬貓弓形蟲病的流行病學調查。調查結果顯示，陽性樣品共有17份，陽性率為32.69％，其中犬樣本21份，陽性樣品6份，陽性率為28.57％；貓樣本21份，陽性樣品11份，陽性率為35.48％。

關鍵詞：流浪動物；弓形蟲；檢測；熒光探針法

隨著國內寵物行業的迅猛發展，社會上的流浪動物數量也與日俱增。流浪犬貓主要是指散布在城市公園、社區以及城鄉接合部的無主人的犬和貓。它們主要來源于兩方面：一是由被棄養的伴侶犬貓組成；二是由流浪犬貓自由交配、繁殖產生的后代[1]。流浪犬貓幾乎遍布每個城市。流浪犬貓大多沒有注射疫苗及驅蟲，容易攜帶諸多病原菌、寄生蟲等，從而造成疾病的傳播。

犬貓弓形蟲病（Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種人畜共患的原蟲病。弓形蟲幾乎可以感染所有的溫血動物，貓既是弓形蟲的中間宿主又是其終末宿主，而人類和其他動物只是中間宿主[2]。人以及其他哺乳動物通過攝入含有感染期蟲體的食物，包括生肉、蛋制品、奶制品、飲用水而感染。也可經破損皮膚、黏膜以及通過胎盤由母體垂直傳播而感染。蒼蠅、蟑螂以及節肢動物也可以攜帶并傳播弓形蟲卵囊[2]。其可引起妊娠期婦女流產、胎兒發育不良、死胎等，還可以引起男性不育，弓形蟲是計劃生育、優生優育的大敵。因此，防止弓形蟲病的傳播已經成為我國重要的公共衛生問題。校園寵物隨著學生畢業等種種原因被遺棄在各大高校內形成一定數量的流浪動物群體。校園流浪犬貓已成為各大高校出現的共同問題。因此對校園流浪犬貓的弓形蟲感染情況進行調查是對長沙城區流浪犬貓弓形蟲病的流行病學調查的重要組成部分。

湖南生物機電職業技術學院內有大量流浪犬貓，由于食物和健康無法保證，其很可能感染攜帶弓形蟲。而校園內有大量師生能夠接觸到流浪動物，由此可能產生一系列關系到人身健康的問題。流浪動物隨地排泄，發情期易攻擊人等情況，使得人與動物的矛盾沖突近年來也在不斷加劇，因此，調查校園內流浪犬貓的重要人畜共患病——弓形蟲攜帶和感染情況顯得尤為重要。為全面掌握校園內流浪犬貓弓形蟲的感染情況，采用熒光探針法對動物體內弓形蟲特異性基因片段進行檢測。

1 材料與方法

1.1 被檢樣品

對湖南生物機電職業技術學院校園內流浪犬貓進行血液采集或糞便采集。對于可以捕捉的39只犬貓施行捕捉麻醉后采血并做絕育手術。對于不能捕捉的動物收集其糞便進行檢測。2018年9月～2022年2月期間共收集到52份樣本，其中貓血清樣本21，糞便樣本10，犬血清樣本11，糞便樣本10。

1.2 樣品采集

動物麻醉后無菌采集受檢動物的靜脈血1.0～1.5ml，離心析出血清，-20℃冷凍備用。采集動物糞便樣本3～5g/份，采集后立刻放入無菌采便管內，

-20℃冷凍備用。按照試劑盒說明書操作，定性測定犬貓樣本中的弓形蟲基因的特異性片段。

1.3 試劑

弓形蟲免核酸提取實時熒光PCR一鍵式試劑盒。卡尤迪生物科技有限公司，批號S2004-07Y。

1.4 儀器

CoyoteBio Mini8 plus實時熒光定量PCR儀，北京尤卡迪生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 擴增試劑準備

從試劑盒中取出TOX-PCR反應液，待其充分溶解后，振蕩混勻5s，瞬時離心5s。根據所要檢測的樣本數，取相應份數的反應液，20μl/份，于0.2ml PCR反應管中備用。試劑用畢后立即放入-20℃保存。

1.5.2 樣本處理

糞便樣本處理：挑取固體糞便樣本0.1g（黃豆粒大小）至400μl樣本稀釋液中渦旋振蕩1min，13000 rpm離心10 min，取50μl上清液轉移至新的1.5 ml離心管中，70℃加熱2min，加熱后取20μl加熱處理后的樣本加入2μl糞便樣本裂解液混勻。加入樣本裂解液，混勻處理后應立即加入PCR反應體系中。血樣本處理：血清樣本經樣本稀釋液（或生理鹽水）稀釋5倍后，即可直接上樣；

1.5.3 加樣

在分裝有TOX-反應液的PCR反應管中分別加入5μl處理后的待檢樣本、TOX-陽性對照品或TOX-陰性對照品2μl（用3μl樣本稀釋液將總體積補足到25μl）。壓緊管蓋，瞬時離心。

1.5.4 PCR擴增

將加完樣的PCR管按照相對應的位置放置到CoyoteBio Mini8 plus儀器里，等待運行。按照說明書操作儀器軟件。檢測結束后查看檢測結果報告。

2 結果

利用實時熒光PCR（熒光探針）方法對湖南生物機電職業技術學院校園內流浪的21只犬31只貓進行了弓形蟲基因特異性片段的檢測，其中17動物檢測為陽性，感染率為32.69%，有6犬檢測結果為陽性，感染率為28.57%，有11只貓檢測結果為陽性，感染率為35.48%。具體感染情況見表。

3 討論

3.1 弓形蟲的分布

弓形蟲為世界性分布，在人群中感染較普遍，全世界有1/4的人口受到威脅，血清陽性率平均為25%～50%，有的高達85%以上[3]。據我國第二次寄生蟲病調查顯示，我國一般人群弓形蟲的平均感染率在7.89%[4]，動物飼養員陽性率明顯高于普通人群。獸醫和屠夫在各職業中感染率最高，達9.20%和7.70%。2006年青島市調查表明飼養寵物者弓形蟲感染率為11.86%，未飼養寵物者為7.38%，飼養寵物者弓形蟲感染高于未飼養寵物者[5]。2016年調查表明寵物犬和鄉村犬弓形蟲抗體陽性率分別為14.5 %和24.6%，流浪貓和寵物貓弓形蟲抗體陽性率分別為24.1%和13.4 %[6]。2011年對長沙城區504只犬貓弓形蟲的調查結果表明長沙地區犬貓弓形蟲感染率較高已達24.4%[7]；

本次針對湖南生物機電職業技術學院內52只流浪犬貓進行弓形蟲檢測顯示，流浪動物弓形蟲感染率為32.69%，其中流浪犬感染率達28.57%，流浪貓感染率達35.48%。高于長沙城區家養寵物弓形蟲感染率24.4%，也高于北京鄉村犬抗體陽性率24.6%與流浪貓抗體陽性率24.1%以及國外Harold Salant和Spira Dan T.的調查結果16.8%[8]。這可能與本次調查的樣本數量、檢測方法有關。由于流浪犬貓在戶外覓食，捕食鼠類、鳥類等弓形蟲中間宿主，易接觸到節肢動物、蚯蚓這類弓形蟲卵囊攜帶者，其食入弓形蟲包囊和卵囊的機會要比家養犬貓大得多。因此流浪犬貓弓形蟲感染率高于室內飼養的犬貓。

3.2 弓形蟲的檢測

犬貓感染弓形蟲后是否發病取決于蟲株的毒力、感染數量和途徑以及宿主免疫力等因素。貓對弓形蟲的敏感性差，僅有少數出現臨床癥狀。人和動物感染弓形蟲多呈無癥狀的隱性感染，因此只能通過醫學檢測來確定是否感染。弓形蟲病的檢查分為免疫學檢查和病原體檢查。目前臨床上主要應用是免疫學方法，包括血清特異性抗體的診斷以及血清中弓形蟲循環抗原的檢測[9]。已有多種血清學方法用于弓形蟲病的診斷，包括間接血凝試驗（IHA）、間接熒光抗體實驗、補體結合試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等方法。常見弓形蟲的檢查指標包括（1）特異性IgM抗體：該抗體常出現在感染早期，提示近期內存在弓形蟲感染，是急性期感染的標志。IgM滴度達到高峰后很快降到低水平；（2）特異性IgG抗體：感染后IgG抗體在血液中出現較晚，但達到高峰后會基本穩定在一個較高的滴度，且持續時間較長，是既往感染的標志。因此健康帶蟲者可長期存在IgG抗體，曾感染弓形蟲而現已治愈者IgG抗體仍可持續較長時間。（3）循環抗原CAg：早期或現癥感染的指標。抗原檢測的靈敏性和特異性都較高，可作為確診依據。弓形蟲的病原體檢測一般有三種：第一種，直接涂片法，在涂片中的細胞漿內尋找弓形蟲。第二種，動物接種。第三種，細胞培養。但病原體檢查操作復雜，檢出率較低，動物接種和細胞培養時間較長，目前在臨床應用較少，意義不大。

3.3 弓形蟲的傳播

動物是弓形蟲的重要傳染源，弓形蟲在它的生活史中，除配子體外，包括滋養體、包囊和卵囊都是均具有感染性的。蟲體在宿主內的形式多樣，包括感染力較強的速殖子、生長緩慢感染力較差的緩殖子及卵囊等。在自然界感染最多的是貓科動物，貓既是弓形蟲的中間宿主又是其終末宿主，而人類和其他動物只是中間宿主。弓形蟲僅在貓體內進行有性繁殖形成卵囊，并隨其糞便排出體外。校園內流浪犬貓因撿拾垃圾，捕食鼠類、鳥類等感染弓形蟲。感染的貓排出弓形蟲卵囊，進入環境中的卵囊經過2～4d發育成具有感染性的成熟卵囊。這些卵囊可以長期存在于外界環境中[10]。當其他動物或家養寵物接觸被卵囊污染的土壤、水后易感染弓形蟲。

3.4 流浪動物對弓形蟲的影響

流浪犬貓的繁殖力驚人，一只流浪母貓一年產仔2胎，每胎產仔4～10只[1]。流浪犬貓大多未進行絕育手術，其大量無序繁殖導致城市流浪動物數量急劇增多。因此帶來的公共衛生問題和社會問題都日益尖銳。目前，流浪犬貓問題已成為世界性的熱點問題，各國對于流浪犬貓如何處理的問題也在不斷探索。對于校園流浪動物的管理，一方面應借助專業學科力量為其進行絕育手術以控制數量。另一方面應定期對校園環境中的犬貓排泄物進行清理、消毒。校園內家養犬應使用引導繩牽引外出，避免犬在外撿食或接觸流浪貓排泄物。家養貓應完全室內飼養，避免其捕食老鼠、蚯蚓等中間宿主。飼喂寵物商品糧，不應飼喂生肉或半熟肉。避免寵物感染弓形蟲病。

犬貓作為與人類關系密切的動物，在弓形蟲的傳播過程中起著非常重要的作用，充分了解校園內流浪犬貓的弓形蟲感染狀況對該病的防控以及公共衛生具有重要的指導意義。校園流浪犬貓已成為各大高校出現的共同問題。因此對校園流浪犬貓的弓形蟲感染情況進行調查是對城區流浪犬貓弓形蟲感染情況調查的重要組成部分。同時對于校園內可抓捕的流浪動物進行絕育手術在很大程度上控制了流浪動物的數量以及人畜共患病的傳播。

參考文獻

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[10] 孔繁瑤.家畜寄生蟲學（第二版）[M].北京：中國農業大學出版社，1997.