piRNA在腫瘤中的研究進展

陳艷麗　陽志軍

【摘要】 PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）是一類長度18～31 nt的非編碼RNA。這類RNA可以通過沉默轉座子來維持基因組的完整性，并具有調控下游靶基因的轉錄和全基因組的DNA的甲基化狀態的作用。近年來，研究發現piRNA在腫瘤中的異常表達與腫瘤的預后顯著相關。piRNA主要通過影響基因組完整性等方式參與包括腫瘤在內的多種疾病的發生和發展過程。本文重點圍繞近年來取得的研究進展，對腫瘤相關piRNA分子機制進行深入闡述，旨在為腫瘤精準診療提供新思路。

【關鍵詞】 piRNA 非編碼RNA 腫瘤

Research Progress of piRNA in Tumor/CHEN Yanli， YANG Zhijun. //Medical Innovation of China， 2023， 20（10）： -183

[Abstract] PIWI-interacting RNA （piRNA） is a non-coding RNA with a length of 18～31 nt. It can maintain the integrity of the genome by silencing transposons and has the function of regulating the transcription of downstream target genes and the methylation state of genome-wide DNA. In recent years， abnormal expression of piRNA in tumors has been found to be significantly correlated with tumor prognosis. piRNAs take part in the development and progression of many diseases， including tumors， by affecting the integrity of the genome. Focusing on the research progress made in recent years， this paper elaborates the molecular mechanism of piRNA related to tumor in depth， aiming to provide new ideas for accurate diagnosis and treatment of tumor.

[Key words] piRNA Non-coding RNA Tumor

First-author's address： The Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Liuzhou 545005， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.10.042

人類全基因組中僅有2%～3%的基因被翻譯成蛋白發揮功能，因為絕大多數基因僅進行了轉錄。轉錄物的改變通常由癌癥基因組中的體細胞變化引起[1]。這些僅僅進行了轉錄的基因稱為非編碼RNA，其種類較多，PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA， piRNA）是其中一種。piRNA長度18～31 nt，數量在非編碼RNA中是最多的，有上百萬種[2-3]。隨著研究的深入，人類發現它主要通過沉默轉座子來維持基因組的完整性參與了包括腫瘤等在內多種疾病的發生和發展過程，其他作用機制包括調控基因的甲基化狀態、下游靶基因的沉默、翻譯后的蛋白進行修飾等。piRNA在癌癥中的異常表達，與腫瘤的預后顯著相關[4-5]。本文結合近年來取得的研究進展，重點對腫瘤相關piRNA分子機制進行深入闡述，旨在為腫瘤精準診療提供新思路。

1 piRNA的發現及產生途徑

二十年前發現的piRNA在基因調控、轉座子元件抑制和抗病毒防御中發揮關鍵作用。piRNA的失調已在包括癌癥在內的多種人類疾病中被發現，且不同動物的piRNA簇來自不同的基因組位點，產生piRNA前體的機制略有不同[6-7]。如按照來源將其進行分類，可以分成長鏈非編碼RNA來源的、mRNA來源的和轉座子來源的piRNA。在這三種來源的piRNA中，目前只有轉座子來源的piRNA被研究得比較深入[2]。piRNA前體通常是由包含重復元件的特定基因組位置產生的，并不依賴于Dicer酶而合成。新生的piRNA需要轉錄后修飾才能成為成熟的piRNA。

piRNA的生物發生有兩條主要途徑：初級piRNA產生途徑及次級piRNA生存途徑——“乒乓循環機制”產生途徑。piRNA的初級合成依賴于細胞核中的RNA聚合酶Ⅱ，轉錄來自piRNA基因簇的小核苷酸序列，形成長的單鏈前體piRNA，然后將其轉移到細胞質中。前體piRNA被核酸內切酶Zucchini催化切割成piRNA前體片段整合到PIWI蛋白中，通過3'-5'外切切割至最終長度，然后分別與PIWI蛋白結合，形成piRNA/PIWI蛋白復合物后被轉移回到胞核內。被轉移到胞漿的前體piRNA與Ago3或Aub蛋白結合形成piRNA/Ago3或piRNA/Aub復合物，piRNA/Ago3復合物可以作為模板生成新的RNA作為形成新的piRNA的底物，由此產生的新的piRNA可以負載Aub蛋白。然后將piRNA/Aub蛋白復合物產生的RNA作為模板，通過類似的工藝作為底物，形成新的piRNA/Ago3復合物。這種以一種piRNA分子的產物為底物合成另一種piRNA分子的相互作用，實現了兩個分子的同時擴增，這就是乒乓擴增[8]。

2 piRNA的結構特點和作用機制

2.1 piRNA的結構特點 piRNA在5'端有強烈的尿苷偏好，而3'端具有2'-O-甲基的獨特結構，PIWI蛋白能夠與它特異性結合[9]。piRNA不具有保守的二級結構及序列結構域，但Balaratnam等[10]通過生物信息學分析認為人的piRNA存在G-quadruplex（GQ）二級結構，并用生物化學及生物物理的方法證實其有形成GQ二級結果的能力。并且利用凝膠電泳實驗證實piRNA的GQ二級結構可抑制其與HIWI-PAZ蛋白的結構域結合，進而影響其和下游靶基因的結合。因此認為piRNA-GQ二級結構，可以賦予其新的調控功能[10]。

2.2 piRNA的作用機制 piRNA在不同的物種中，其序列和結構差異很大，從而導致piRNA在各類物種中的功能差異比較大。現有的研究證據表明，piRNA主要有沉默轉座子、基因及修飾蛋白等重要的調控功能[2，11]。在果蠅卵巢中，發現piRNA來源于特定piRNA簇，經加工成成熟后，piRNA與Argonaute蛋白家族的PIWI成員組裝，形成piRNA誘導的RNA沉默復合物（piRISCs），被轉回到細胞核，并通過在目標轉座子位點誘導局部異染色質形成而抑制轉座子的共轉錄[12-13]。在動物生殖系及體細胞中，piRNA對下游基因的靶點可以容忍少量堿基不匹配，并具有靶向所有種系mRNA的能力，并遵循類似于microRNA的配對規則，而發揮沉默基因功能[14-16]。Han等[17]在2021年的研究中發現piRNA-30473在彌漫性大B細胞淋巴瘤中通過調節m6A RNA甲基化而促進腫瘤發生和提示不良預后。在越來越多的腫瘤中發現有piRNA的表達，并參與調控腫瘤細胞的各種生理功能。

2.2.1 影響腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲 piRNA-823在多發性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）組織及細胞系中表達上調，并促進MM細胞的增殖、成管及侵襲能力。其作用機制是促進血管內皮生長因子、白介素-6、細胞間黏附分子-1的表達并抑制細胞凋亡，并促進p16INK4A的異常甲基化，而失去抑癌活性[18]。Li等[19]在非小細胞肺癌中的研究，基于高通量測序手段，使用癌與癌旁組織標本進行測序，發現血清來源的細胞外囊泡piR-hsa-164586作為早期診斷的新生物標志物。并且通過實時熒光定量PCR技術進行再次驗證，證實piR-hsa-164586在非小細胞肺癌診斷的曲線下面積達到0.623在全部分期（一期）患者群體中。在結直腸癌（colorectal cancer， CRC）組織中，piRNA-823可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，piRNA-823通過上調熱休克因子1的磷酸化和轉錄活性發揮促腫瘤作用[20]。也有研究發現在直腸癌中piRNA-54265與PIWIL2蛋白結合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-src復合物，激活STAT3信號通路，促進CRC細胞增殖、轉移[21]。在肝臟組織中有66 772個piRNAs表達（已知149個），癌和癌旁組織表達差異明顯的有241個piRNAs，轉移和非轉移腫瘤組織表達差異明顯的1 634個piRNAs。差異piRNA的靶基因主要功能富集在細胞黏附上，發現piRNA（piRl/97）促進肝癌細胞的遷移[22]。在乳腺癌中piRNA-36712與SEPW1P（SEPW1的一個反加工偽基因）產生的mRNA相互作用，通過與SEPW1 mRNA競爭microRNA-7和microRNA-324的機制來抑制SEPW1的表達。在乳腺癌中piRNA-36712的下調導致SEPW1表達升高，可能抑制P53，導致Slug表達上調，同時P21和上皮細胞鈣粘蛋白表達下降，從而促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移[5]。PiR-39980在骨肉瘤中通過激活基質金屬蛋白酶-2來促進遷移和侵襲，并通過對SERPINB1的負調控來抑制細胞死亡[23]。PiR-39980在纖維肉瘤中通過直接靶向其核糖核苷酸還原酶亞基M2的3'非翻譯區，從而促進細胞凋亡，抑制纖維肉瘤細胞的增殖[24]。

2.2.2 維持腫瘤細胞的干性 用RT-PCR及軟瓊脂克隆形成實驗鑒定側群細胞（side population， SP）的干細胞特性，q-PCR法檢測SP及非側群的乳腺癌細胞（non-SP，NSP）中3種PIWI基因（HIWI，HILI和HIWI2）及4種piRNA（piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582）的表達水平。結果顯示：乳腺癌MCF-7細胞中的SP亞群富含腫瘤干細胞樣細胞；HIWI和HIWI2在SP細胞中的水平顯著高于NSP細胞（P<0.05）；piR-4987、piR-20365和piR-20582在SP細胞中的表達顯著高于NSP細胞（P<0.01）。因此認為乳腺癌干細胞內可能存在類似生殖干細胞內的PIWI-piRNA通路，HIWI、HIWI2、piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582可能參與調控乳腺癌干細胞的生物學特性[25]。骨髓來源的抑制細胞通過誘導piRNA-823的表達和DNMT3B的激活賦予多發性骨髓瘤細胞干細胞樣的性質。中性粒細胞-髓源性抑制細胞（granulocytic myeloid de-rived suppressor cells， G-MDSCs）促進了MM細胞中腫瘤干細胞（cancer stem cells， CSCs）核心基因的側群、球的形成和表達[26]。

3 piRNA在腫瘤中的應用現狀

隨著研究的深入，piRNA在腫瘤領域顯示出廣闊的應用前景。

3.1 腫瘤診斷 有研究發現在直腸癌患者血清中存在一個5聯piRNAs（piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365）組合可以作為CRC診斷的血清生物標志物，該組合（piRNA Ⅰ組）臨床診斷意義優于癌胚抗原 Ⅱ組，特異性為0.867（P<0.001）[27]。在CRC中，piRNA的失調水平與DNA甲基化和T細胞調節有關。迄今為止，在CRC中僅發現了少數循環的piRNA，然而其表達水平改變是被認為是潛在的候選診斷和預后生物標志物。Vychytilova-Faltejskova等[28]的研究發現血清piRNA-823水平與CRC患者的腫瘤分期呈正相關，在晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者中可觀察到明顯更高的piRNA-823水平。研究也發現胃液中piR-1245的含量明顯高于對照組（P<0.0001）。受試者特征曲線下面積值為0.885[敏感度90.9%，特異度74.2%，95%置信區間（0.828 6，0.941 4）][29]。這些研究發現意味著，piRNAs在腫瘤組織中差異表達，是潛在的腫瘤標志物，具有作為腫瘤診斷的潛力。

3.2 腫瘤治療 越來越多的研究發現，piRNA是潛在的抗腫瘤治療的藥物靶點。在MM細胞中沉默piRNA-823可以降低G-MDSCs維持的多發性骨髓瘤干細胞的干性，從而降低體內的腫瘤負荷和血管生成。并且G-MDSCs、piRNA-823、DNA甲基化和CSCs核心基因之間的細胞、分子和臨床之間存在調控網絡。piRNA-823干擾就是在MM微環境中同時針對G-MDSCs和CSCs新的抗癌策略[26]。細胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）可在腫瘤微環境中攜帶多種RNA，是腫瘤與周圍基質細胞（包括內皮細胞）之間通信的關鍵。piRNA-823在MM患者外周血及MM細胞來源的EVs中積累，MM細胞來源的EVs能有效地將piRNA-823轉移至EA.hy926內皮細胞。轉染piRNA-823類似物或經MM衍生EVs預處理的EA.hy926細胞促進了異種移植瘤MM的生長。相反，轉染piRNA823抑制劑或用轉染piRNA-823抑制劑的MM細胞的EVs處理能有效抑制異種移植瘤MM的生長。由此可見，由MM衍生的EVs攜帶的piRNA-823對于ECs的再生至關重要，通過改變其生物學特性，使其適應MM細胞生長的獨特環境。可能為開發piRNA介導的MM的治療新策略提供依據[30]。piRNA-823在直腸癌中也是潛在的治療靶點[20]。piRNA piR-Fth1與鐵蛋白重鏈1（Fth1）mRNA中有一個互補序列，在三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer， TNBC）細胞中，pi-Fth1在轉錄后水平負調控Fth1的表達，piRNA靶標的特定mRNA pi-Fth1可能是TNBC治療的新靶點[31]。

3.3 腫瘤耐藥 有研究發現在直腸癌中piRNA-54265與PIWIL2蛋白結合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-SRC復合物，激活STAT3信號通路，誘導腫瘤耐藥的產生[21]。piRNA-36712可以影響乳腺癌細胞對紫杉醇和阿霉素的敏感性。piRNA-39980在神經母細胞腫瘤中可以通過抑制藥物誘導的細胞凋亡，降低神經母細胞腫瘤對阿霉素的敏感性[32]。在三陰性乳腺癌中，Pi-fth1通過HIWI2和HILI靶向Fth1mRNA，引起fth1抑制使TNBC細胞對阿霉素的敏感性顯著提高了20倍[31]。這些研究無不顯示著，piRNAs在腫瘤耐藥中發揮著作用，為逆轉腫瘤耐藥策略提供新的潛在治療靶點。

3.4 腫瘤預后 piRNAs在預測腫瘤預后方面也引起了研究者的廣泛重視。Ou等[33]的研究發現在衰老中性粒細胞衍生的外體piRNA-17560，它以STAT3依賴性方式通過肥胖相關蛋白介導的m6A去甲基化促進乳腺癌的化療耐藥和上皮間質轉化，提示piRNA-17560可作為乳腺癌的潛在治療靶點并提示患者預后。piRNA-36712在乳腺癌組織中明顯低于正常乳腺組織，其低水平表達與患者的臨床預后不良相關，這提示piRNA-36712可能是乳腺癌患者預后的潛在預測因子[5]。胃組織的piRNA圖譜顯示，大多數的piRNA嵌入在蛋白編碼序列中（即基因間），并發現一個與無復發生存相關的3聯合piRNA序列（FR290353， FR064000和FR387750或者FR157678）[34]。有研究者通過全基因組聯合單核苷酸多態性的方法綜合分析了3 116個PIWI-piRNA通路基因中常見的單核苷酸多態性位點在黑色素瘤疾病特異性生存中的預后作用，發現PIWI-piRNA通路基因DCP1A的遺傳變異可能預測黑色素瘤疾病特異性生存[4]。另有研究發現，piRNA-1245在CRC中高表達，其過表達與晚期和轉移顯著相關，其高表達的患者總體生存期明顯較短，多因素分析發現其可作為CRC的獨立預后生物學標志物[35]。piRNA-017724水平較低的直腸癌患者總體生存和無進展生存較差，多因素分析發現血清水平的piRNA-017724是總體生存和無進展生存的獨立預后因素[27]。

4 存在問題及展望

針對piRNA的研究已經有10余年，隨著高通量測序實驗技術及生物信息分析學的發展及推廣，使得piRNA的檢測及發現得到更為方便簡易。RNA結合蛋白免疫沉淀技術的及熒光素酶報告系統等越來越成熟，為進一步研究piRNA的功能提供了堅實的實驗技能基礎。在某些腫瘤中，piRNA已有了較深入的研究，piRNA在腫瘤細胞中有差異性表達，并與臨床分期、轉移及預后有關，有望為腫瘤的臨床診斷、預后判斷及精準的治療提供靶點。但在腫瘤中piRNA是如何發生調控功能的分子機制尚不明確，piRNA與PIWI蛋白分別單獨發生調控作用，還是piRNA與PIWI形成RNA誘導的沉默復合物后共同發揮調控作用？在什么水平發生什么具體的調控功能？因此離系統構建一個完整解釋piRNAs和PIWI蛋白的生物發生、功能及其相互作用的知識網絡還很遙遠。但隨著生物實驗技術的不斷進步及成熟，科學研究者們對piRNA的進一步探索和研究，有待揭開其在腫瘤領域的功能的神秘面紗，進而提高人類對腫瘤的認識。

參考文獻

[1] CALABRESE C，DAVIDSON N R，DEMIRCIO?LU D，et al.

Genomic basis for RNA alterations in cancer[J].Nature，2020，578（7793）：129-36.

[2] CHENG， Y，WANG Q，JIANG W，et al.Emerging roles of piRNAs in cancer： challenges and prospects[J].Aging，2019，11（21）：9932-9946.

[3]劉佳，張淑君，成秉林.腫瘤組織PIWI/piRNA通路蛋白對轉座子作用機制研究進展[J]中華腫瘤防治雜志，2017，24（3）：207-211.

[4] ZHANG W，LIU H，YIN J，et al.Genetic variants in the PIWI-piRNA pathway geneDCP1A predict melanoma disease-specific survival[J].International Journal of Cancer，2016，139（12）：2730-2737.

[5] TAN L，MAI D，ZHANG B，et al.PIWI-interacting RNA-36712 restrains breast cancer progression and chemoresistance by interaction with SEPW1 pseudogene SEPW1P RNA[J].Molecular cancer，2019，18（1）：9.

[6] ZHANG J，CHEN S，LIU K.Structural insights into piRNA biogenesis[J].Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech，2022，1865（2）：194799.

[7] CZECH B，MUNAF? M，CIABRELLI F，et al.piRNA-guided genome defense： from biogenesis to silencing[J].Annu Rev Genet，2018，52：131-57.

[8] WEICK E M，MISKA E A.piRNAs： from biogenesis to function[J].Development，2014，141（18）：3458-3471.

[9] STEIN C B，GENZOR P，MITRA S，et al.Decoding the

5' nucleotide bias of PIWI-interacting RNAs[J].Nature communications，2019，10（1）：828.

[10] BALARATNAM S，HETTIARACHCHILAGE M，WEST N，et al.A secondary structure within a human piRNA modulates its functionality[J].Biochimie，2019，157：72-80.

[11]劉啟鵬，安妮，岑山，等.PiRNA抑制基因轉座的分子機制[J].遺傳，2018，40（6）：445-450.

[12] CASIER K，DELMARRE V，GUEGUEN N，et al.Environmentally-

induced epigenetic conversion of a piRNA cluster[J/OL].Elife，2019，8：e39842.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30875295/.

[13] BARCKMANN B，EL-BAROUK M，P?LISSON A，et al.The somatic piRNA pathway controls germline transposition over generations[J].Nucleic Acids Res，2018，46（18）：9524-9536.

[14] DUFOURT J，BONTONOU G，CHARTIER A，et al.piRNAs and Aubergine cooperate with Wispy poly（A） polymerase to stabilize mRNAs in the germ plasm[J].Nature Communications，2017，8（1）：1305.

[15] SHEN E Z，CHEN H，OZTURK A R，et al.Identification of piRNA binding sites reveals the argonaute regulatory landscape of the C. elegans germline[J/OL].Cell，2018，172（5）：937-951，e918.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29456082/.

[16] ZHANG D，TU S，STUBNA M，et al.The piRNA targeting rules and the resistance to piRNA silencing in endogenous genes[J].Science，2018，359（6375）：587-592.

[17] HAN H，FAN G，SONG S，et al.piRNA-30473 contributes to tumorigenesis and poor prognosis by regulating m6A RNA methylation in DLBCL[J].Blood，2021，137（12）：1603-1614.

[18] YAN H，WU Q L，SUN C Y，et al.piRNA-823 contributes to tumorigenesis by regulating de novo DNA methylation and angiogenesis in multiple myeloma[J].Leukemia，2015，29（1）：196-206.

[19] LI Y，DONG Y，ZHAO S，et al.Serum-derived piR-hsa-164586 of extracellular vesicles as a novel biomarker for early diagnosis of non-small cell lung cancer[J].Front Oncol，2022，12：850363.

[20] YIN J，JIANG X Y，QI W，et al.piR-823 contributes to colorectal tumorigenesis by enhancing the transcriptional activity of HSF1[J].Cancer Science，2017，108（9）：1746-1756.

[21] MAI D，DING P，TAN L，et al.PIWI-interacting RNA-54265 is oncogenic and a potential therapeutic target in colorectal adenocarcinoma[J].Theranostics，2018，8（19）：5213-5230.

[22] MIAO P Z，YANG Y，CHEN E B，et al.Differential expressions analysis of piwi-interacting RNAs in hepatocellular carcinoma[J].Chinese Journal of Hepatology，2018，26（11）：842-846.

[23] DAS B，JAIN N，MALLICK B.piR-39980 promotes cell proliferation， migration and invasion， and inhibits apoptosis via repression of SERPINB1 in human osteosarcoma[J].Biology of the Cell，2020，112（3）：73-91.

[24] DAS B，ROY J，JAIN N，et al.Tumor suppressive activity of PIWI-interacting RNA in human fibrosarcoma mediated through repression of RRM2[J].Molecular Carcinogenesis，2019，58（3）：344-357.

[25]李玉鳳，劉巖，李玉輝，等.人乳腺癌干細胞中PIWI基因及piRNAs的表達分析[J].基因組學與應用生物學，2016，35（9）：2211-2216.

[26] AI L，MU S，SUN C，et al.Myeloid-derived suppressor cells endow stem-like qualities to multiple myeloma cells by inducing piRNA-823 expression and DNMT3B activation[J].Molecular Cancer，2019，18（1）：88.

[27] QU A，WANG W，YANG Y，et al.A serum piRNA signature as promising non-invasive diagnostic and prognostic biomarkers for colorectal cancer[J].Cancer Manag Res，2019，11：3703-3720.

[28] VYCHYTILOVA-FALTEJSKOVA P，STITKOVCOVA K，RADOVA L，et al.Circulating PIWI-interacting RNAs piR-5937 and piR-28876 are promising diagnostic biomarkers of colon cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2018，27（9）：1019-1028.

[29] ZHOU X，LIU J，MENG A，et al.Gastric juice piR-1245： a promising prognostic biomarker for gastric cancer[J/OL].Journal of Clinical Laboratory Analysis，2020，34（4）：e23131.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31777102/.

[30] LI B，HONG J，HONG M，et al.piRNA-823 delivered by multiple myeloma-derived extracellular vesicles promoted tumorigenesis through re-educating endothelial cells in the tumor environment[J].Oncogene，2019，38（26）：5227-5238.

[31] BALARATNAM S，WEST N，BASU S.A piRNA utilizes HILI and HIWI2 mediated pathway to down-regulate ferritin heavy chain 1 mRNA in human somatic cells[J].Nucleic Acids Res，2018，46（20）：10635-10648.

[32] ROY J，DAS B，JAIN N，et al.PIWI-interacting RNA 39980 promotes tumor progression and reduces drug sensitivity in neuroblastoma cells[J].J Cell Physiol，2020，235（3），2286-2299.

[33] OU B，LIU Y，GAO Z，et al.Senescent neutrophils-derived exosomal piRNA-17560 promotes chemoresistance and EMT of breast cancer via FTO-mediated m6A demethylation[J].Cell Death Dis，2022，13（10）：905.

[34] MARTINEZ V D，ENFIELD K S S，ROWBOTHAM D A，et al.An atlas of gastric PIWI-interacting RNA transcriptomes and their utility for identifying signatures of gastric cancer recurrence[J].Gastric Cancer，2016，19（2）：660-665.

[35] WENG W，LIU N，TOIYAMA Y，et al.Novel evidence for a PIWI-interacting RNA （piRNA） as an oncogenic mediator of disease progression， and a potential prognostic biomarker in colorectal cancer[J].Molecular Cancer，2018，17（1）：16.

（收稿日期：2023-02-07） （本文編輯：張明瀾）