慢性肺源性心臟病患者血清GSK-3β、β-cateninmRNA表達水平與病情嚴重程度及預后的關系

張鑫,程德均,王科程,杜怡穎,郝晉瑤

慢性肺源性心臟病(chronic pulmonary heart disease,CPHD)是一種常見的慢性呼吸系統疾病,由長期的慢性感染炎性滲出導致小氣道血管重構,進而引起肺動脈阻力增加,形成肺心病,在代償能力喪失后緩慢誘導右心室肥厚,最終導致心力衰竭[1]。據統計,CPHD與10%～30%心力衰竭住院病例有關,80%的慢性阻塞性肺疾病(COPD)會發展為CPHD[2-3]。CPHD失代償期會導致電解質紊亂、消化道出血等多種并發癥,增加死亡率。因此,盡早診斷、及時干預,有助于改善CPHD患者預后。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種組成型活性激酶,參與胚胎發育、細胞分化、轉錄和翻譯等各種生物學活動[4-5]。GSK-3β異常表達與炎性疾病、糖尿病、帕金森綜合征、心臟疾病等有關[6]。β-連環蛋白(β-catenin)屬于連環蛋白家族,參與多種細胞增殖和分化,是經典Wnt信號轉導的核心組成部分,而GSK-3β催化活性是該信號通路的關鍵[7]。Wnt/β-catenin信號通路與COPD、肺動脈高壓、特發性肺纖維化等肺部及呼吸系統疾病相關[8-9]。GSK-3β、β-catenin與CPHD預后的關系尚未明確。本研究旨在明確血清GSK-3β、β-catenin信使RNA(mRNA)表達與CPHD預后的關系,為改善預后提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年10月漢中市三二〇一醫院收治的CPHD患者108例作為CPHD組,原發病均為COPD,男63例,女45例,年齡51～72(63.50±7.50)歲;以患者肺心功能變化分為失代償亞組(肺心功能失代償)40例、代償亞組(肺心功能代償)68例。收集同期醫院體檢健康者108例作為健康對照組,男60例,女48例,年齡52～74(64.92±7.05)歲。本研究經醫院倫理委員會批準(2019LHS-9-2),受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均符合CPHD診斷標準[10];②臨床資料完整;③無家族性遺傳病;④既往無治療史。(2)排除標準:①合并心肌梗死;②肺間質疾病或急性肺栓塞者;③支氣管哮喘;④肝腎功能不全;⑤左心功能不全。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料收集:收集CPHD患者體質量指數(BMI)、病程、吸煙史、糖尿病史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)、第1秒用力呼氣量占預計值百分比(FEV1%)。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平:采集CPHD患者入院后24 h內、健康者體檢當日清晨空腹靜脈血8 ml,離心留取血清,儲存于-70℃環境中。取血清樣本,RNA提取試劑盒(南京偉沃生物科技有限公司)從血清中提取總RNA,取RNA 2 μg按照逆轉錄試劑(南京偉沃生物科技有限公司)得到cDNA。根據PCR試劑盒(深圳盎然生物科技有限公司)配制成10 μl反應體系,以GAPDH為內參,在熒光定量PCR儀(型號QTOWER3G,無錫賽爾博生物科技有限公司)上進行PCR反應,2-ΔΔCt法用于計算GSK-3β、β-catenin mRNA水平。引物由廣州源井生物科技有限公司設計合成,引物序列見表1。

表1 GSK-3β、β-catenin mRNA引物序列

1.3.3 預后評估:CPHD患者入院后均依據“慢性肺源性心臟病基層診療指南(2018年)”[10]中方案接受相關治療,統計CPHD患者1年內預后,隨訪起始日期為收治患者當日,隨訪截止日期為收治患者當日1年后,統計生存情況并分為存活亞組85例、死亡亞組23例。

2 結 果

2.1 2組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較 與健康對照組比較,CPHD組血清GSK-3β mRNA表達水平顯著降低,β-catenin mRNA表達水平顯著升高(P<0.01),見表2。

表2 健康對照組和CPHD組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較

2.2 代償亞組和失代償亞組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較 與代償亞組比較,失代償亞組血清GSK-3β mRNA表達水平顯著降低,β-catenin mRNA表達水平顯著升高(P<0.01),見表3。

表3 代償亞組和失代償亞組CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較

2.3 存活亞組和死亡亞組臨床資料比較 2亞組性別、年齡、BMI、病程、糖尿病史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、FEV1%比較差異無統計學意義(P>0.05);與存活亞組比較,死亡亞組吸煙史比例、PaCO2顯著升高,PaO2顯著降低(P<0.05),見表4。

表4 存活亞組和死亡亞組CPHD患者臨床資料比較

2.4 存活亞組與死亡亞組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較 與存活亞組比較,死亡亞組血清GSK-3β mRNA表達水平顯著降低,β-catenin mRNA表達水平顯著升高(P<0.01),見表5。

表5 存活亞組與死亡亞組CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平比較

2.5 CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平的相關性分析 經Pearson法分析,CPHD患者血清GSK-3β mRNA與β-catenin mRNA表達水平呈負相關(r=-0.502,P<0.001)。

2.6 影響CPHD患者死亡的多因素分析 以CPHD患者是否死亡為因變量(死亡=1,生存=0),將吸煙史(是=1,否=0)、PaCO2(連續變量)、PaO2(連續變量)、GSK-3β mRNA(連續變量)、β-catenin mRNA(連續變量)作為自變量納入多因素Cox回歸分析,結果顯示,GSK-3β mRNA高表達是CPHD患者死亡的保護因素,β-catenin mRNA高表達是CPHD患者死亡的危險因素(P<0.05),見表6。

表6 Cox回歸分析CPHD患者死亡的影響因素

2.7 血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平對CPHD患者死亡的預測價值 繪制血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平對CPHD患者死亡預測價值的ROC曲線,并計算AUC,結果顯示,血清GSK-3β、β-catenin mRNA及二者聯合預測CPHD患者死亡的AUC分別為0.838、0.884、0.913,三者預測CPHD患者死亡的效能均較好(Z/P=0.857/0.391、1.660/0.096),見表7、圖1。

圖1 血清GSK-3β、β-catenin mRNA及二者聯合預測CPHD患者死亡的ROC曲線

表7 血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達水平對CPHD患者死亡的預測價值

3 討 論

CPHD是一種由肺功能下降或肺衰竭引起的心臟病,研究顯示其病理機制主要涉及慢性缺氧狀態、血管介質如一氧化氮和內皮抑素-1的分泌以及血小板衍生生長因子A和B的減少,引起血管平滑肌細胞松弛和損傷,最終導致肺動脈壓升高[11]。常規治療雖可有效改善臨床癥狀,但病程沒有明顯縮短,復發率、病死率仍較高[12]。因而探究影響CPHD預后的分子標志物,對于預后預測、臨床治療有重要意義。

Wnt/β-catenin是一種涉及穩態自我更新、胚胎發育和多種疾病的細胞信號系統,GSK-3β是負調控因子,β-catenin是其正調控因子。當Wnt/β-catenin信號通路未被激活時,激活的GSK-3β能夠磷酸化β-catenin,導致β-catenin水平減少[13-15]。相反,當Wnt/β-catenin途徑被激活時,β-catenin從復合物中釋放,并在細胞質中積累,并最終轉移至細胞核,促進下游靶基因表達[16-17]。氣道壁內的機械力(拉伸和壓縮)可以激活細胞中的β-catenin信號,β-catenin的激活在涉及氣道平滑肌細胞增殖、上皮間質轉化、肌成纖維細胞分化和細胞外基質產生的氣道重構中發揮調節作用[18]。然而,還未有關GSK-3β、β-catenin與CPHD的相關研究。本研究觀察到CPHD患者血清GSK-3β mRNA表達水平較健康人降低,β-catenin mRNA表達水平較健康人升高,提示GSK-3β、β-catenin mRNA可能參與CPHD發生。相關性分析發現,CPHD患者血清GSK-3β mRNA與β-catenin mRNA呈負相關,提示GSK-3β mRNA和β-catenin mRNA可能存在相互作用,共同影響CPHD的發生。有研究表明,高氧誘導的新生兒肺損傷與Wnt/β-catenin信號轉導的激活有關,Wnt/β-catenin信號轉導的抑制可以減輕高氧誘導的肺動脈高壓[19]。一項動物實驗顯示,與健康幼鼠比較,高氧致急性肺損傷幼鼠的肺組織GSK-3β表達減少[20]。結合文獻及本研究結果推測GSK-3β、β-catenin mRNA可能通過影響氣道重構,進而影響肺動脈壓,導致CPHD的發生。Carlier等[21]證明了Wnt/β-catenin通路在COPD患者中被激活,β-catenin蛋白水平上調,并且與COPD嚴重程度相關。本研究發現,CPHD患者的失代償亞組血清GSK-3β mRNA表達水平顯著低于代償亞組,β-catenin mRNA表達水平顯著高于代償亞組,提示血清GSK-3β、β-catenin mRNA異常表達與CPHD的病情嚴重程度相關,猜測低水平GSK-3β mRNA、高水平β-catenin mRNA可能通過調控下游靶基因表達,導致血管平滑肌細胞松弛和損傷,引起氣道重塑,肺動脈壓升高,從而加重CPHD患者病情。

進一步分析發現,與存活亞組比較,死亡亞組血清GSK-3β mRNA表達下調,β-catenin mRNA表達上調,說明血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達異常可能參與了CPHD患者預后不良發生過程,二者可能通過增加肺動脈壓,導致肺功能損害,從而加重病情,導致預后更差。Cox回歸分析顯示,GSK-3β mRNA低表達、β-catenin mRNA高表達是CPHD患者死亡的危險因素,表明GSK-3β mRNA水平越低、β-catenin mRNA水平越高,CPHD患者預后死亡風險越高。ROC曲線發現血清GSK-3β、β-catenin mRNA各自單獨及二者聯合均對CPHD患者預后有較好預測價值,提示檢測血清GSK-3β、β-catenin mRNA水平變化可作為CPHD患者預后死亡的預測指標,有助于指導臨床制定個體化方案,改善CPHD患者預后。

綜上所述,CPHD患者血清GSK-3β mRNA呈異常低表達,β-catenin mRNA呈異常高表達,二者均與病情嚴重程度及預后相關,GSK-3β mRNA聯合β-catenin mRNA預測CPHD患者預后的效能較佳,對患者預后的干預具有重要意義。然而,本研究中樣本量有限,評估患者死亡的危險因素可能存在偏倚,GSK-3β、β-catenin mRNA調控CPHD的病理機制有待深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張鑫:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;程德均:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;王科程、杜怡穎:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;郝晉瑤:進行統計學分析