急性腦梗死患者血清miR-29c-3p、MDM2水平與預后的關系

張蕊,張志勇,張晉霞,任伯

急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)由腦血管血流供應突然中斷引起,是全球致殘事件的主要原因,其發病率隨著社會老齡化的發展而不斷升高[1-2]。盡早識別ACI、評估患者病情是制定個性化治療的前提,對患者的恢復和預后具有重要的臨床和社會價值。溶栓是ACI常用的治療方法,然而,溶栓雖可有效疏通血管,但仍存有一定的風險,且不適用于部分大血管閉塞的患者[3-4]。即使在適當的治療窗進行了溶栓治療,其預后仍需密切關注[5]。因此,尋找更好的評估ACI預后的血液生物標志物具有重要臨床價值。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼短鏈RNA,通過其靶蛋白調控作用參與癌癥及心腦血管等多種疾病的發生、發展[6]。據報道,微小RNA-29c-3p(miR-29c-3p)低表達不僅提示缺血性腦卒中疾病嚴重程度較高,且是患者短期預后不良的危險因素[7]。鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)是一種原癌基因,在多種人類癌癥中發揮致癌活性[8]。此外,MDM2已被證明可通過改變神經元中的氧化還原穩態參與調控大鼠缺血再灌注損傷[9]。生物學研究預測,miR-29c-3p和MDM2可能存在靶向關系,然而,miR-29c-3p和MDM2表達在ACI中的作用尚不清楚。因此,現分析ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2表達情況及其與預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年7月—2022年7月華北理工大學附屬醫院收治的ACI患者90例為ACI組,其中男54例,女36例,年齡49～70(57.52±6.48)歲。同期醫院健康體檢者90例為健康對照組,其中男56例,女34例,年齡47～69(56.50±6.20)歲。2組性別、年齡、體質量指數(BMI)、吸煙史、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平比較差異無統計學意義(P>0.05);與健康對照組比較,ACI組飲酒史比例、總膽固醇(TC)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平升高(P<0.05),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、尿酸(UA)水平降低(P<0.05),見表1。本研究經醫院倫理委員會批準(LS2021027),全部受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 健康對照組和ACI組臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均符合ACI診斷標準[10],且經影像學診斷確診;②急性發作,發病到入院時間<72 h;③臨床數據完整,且患者均接受隨訪。(2)排除標準:①既往有ACI病史;②有靜脈溶栓或發病后血栓清除史;③任何其他中樞神經系統疾病,如顱內出血、帕金森病或阿爾茨海默病等;④嚴重心臟病、肺部或其他感染性疾病;⑤癌癥、自身免疫系統疾病或嚴重的肝腎功能障礙。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血生化指標檢測:采集ACI患者入院后24 h內、健康者體檢時空腹肘靜脈血10 ml,離心留取血清,儲存于-70℃冰箱。取血清樣本,解凍后采用全自動生化分析儀(型號Chemray800,購自北京澤平科技有限責任公司)檢測FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SCr、BUN、UA。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清hs-CRP水平,試劑盒購自廣州宏新生物技術有限公司。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測血清miR-29c-3p水平:使用RNA提取試劑盒(購自廣東固康生物科技有限公司) 提取血清總RNA,逆轉錄試劑(購自北京澤平科技有限責任公司)對總RNA進行逆轉錄合成cDNA。隨后,采用PCR試劑盒(購自廣東固康生物科技有限公司)進行擴增,反應體系和反應參數根據試劑盒說明書進行,2-ΔΔCt法計算miR-29c-3p水平。引物由安徽佰歐晶醫學科技有限公司合成。miR-29c-3p上游引物:5'-GAAGCACCATTTGAAATCAG-3' 和下游引物5'-TTGGCACTAGCACATT-3';內參(U6)上游引物:5'-CTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'和下游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATAC-3'。

1.3.3 ELISA法檢測血清MDM2水平:采用ELISA法測定血清MDM2水平,試劑盒購自英國Biorbyt公司,于酶標儀(型號CMax Plus,購自上海實維實驗儀器技術有限公司)450 nm處讀取吸光度值,根據標準曲線計算血清MDM2水平。

1.3.4 生物信息學評估miR-29c-3p和MDM2結合位點:經Starbase數據庫(https://starbase.sysu.edu.cn)對miR-29c-3p和MDM2相互作用位點進行預測。

1.3.5 預后評估:患者出院后3個月進行門診復診(3個月內無患者死亡),采用改良Rankin量表(mRS)[11]評估患者3個月后神經功能恢復情況。mRS評分以2分為界值,將患者分為預后良好亞組55例(mRS評分≤2分)和預后不良亞組35例(mRS評分>2分)。

2 結 果

2.1 2組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較 與健康對照組比較,ACI組血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),見表2。

表2 健康對照組和ACI組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較

2.2 ACI患者2亞組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較 與預后良好亞組比較,預后不良亞組血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),見表3。

表3 預后良好亞組和預后不良亞組ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平比較

2.3 ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平的相關性分析 miR-29c-3p與MDM2有靶向作用位點,見圖1。經Pearson法分析,ACI患者血清miR-29c-3p與MDM2水平呈負相關(r=-0.442,P<0.001)。

圖1 miR-29c-3p與MDM2的靶向作用位點

2.4 影響ACI患者預后不良的多因素Logistic回歸分析 以ACI患者預后情況為因變量,以上述結果中有統計學意義的指標(飲酒史、TC、HDL-C、UA、hs-CRP、miR-29c-3p、MDM2)作為自變量納入多因素Logistic回歸分析,結果發現,血清hs-CRP高水平、MDM2高水平是ACI患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05),miR-29c-3p高水平是其保護因素(P<0.05),見表4。

表4 Logistic回歸分析ACI患者預后不良的影響因素

2.5 血清miR-29c-3p、MDM2預測ACI患者預后不良的價值 繪制血清miR-29c-3p、MDM2 預測ACI患者預后不良的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清miR-29c-3p、MDM2及二者聯合預測ACI患者預后不良的AUC分別為0.825、0.831、0.909,二者聯合預測效能優于單項預測(Z/P=2.222/0.026、2.063/0.039),見圖2、表5。

表5 血清miR-29c-3p、MDM2及二者聯合對ACI患者預后不良的預測價值

3 討 論

ACI可導致嚴重的腦損傷,影響患者的健康和生活質量[12]。研究顯示,ACI過程中一些miRNA表達會隨著疾病進展而變化,有望作為疾病的潛在預測指標或新的治療方向[13-14]。Song等[15]研究表明,血漿miR-409-3p在ACI中高表達,升高的血漿miR-409-3p與疾病嚴重程度相關。駱嵩等[16]研究顯示,miR-34c水平可評估ACI患者炎性反應和神經缺損的嚴重程度。miR-29c-3p是近期發現的一種可參與缺血性腦病發展的miRNA[7]。以往研究顯示,miR-29c-3p過表達可通過靶向抑制10-11易位蛋白2介導帕金森疾病模型小鼠中的自噬,進而改善疾病的發展[17],表明高水平miR-29c-3p對帕金森疾病的進展具有抑制作用。在本研究中,ACI患者血清miR-29c-3p水平較健康者低,與Wang等[17]研究結果類似,提示低表達的miR-29c-3p可能影響ACI的發生。Zhang等[18]研究發現,miR-29c-3p是膿毒癥患者心功能不全發生的獨立危險因素,在動物模型中抑制miR-29c-3p表達可降低膿毒癥引起的心臟功能障礙和炎性反應。提示miR-29c-3p在不同的疾病中發揮的功能不盡相同。隨后評估了miR-29c-3p水平與ACI預后的關系,結果顯示,預后不良ACI患者血清miR-29c-3p水平較預后良好ACI患者更低,提示血清中miR-29c-3p低水平可能為ACI預后不良的早期指標。進一步研究發現,血清miR-29c-3p低水平為ACI患者預后不良的獨立危險因素,在臨床中有望使用miR-29c-3p水平對其預后進行評估。

Starbase網站預測miR-29c-3p可能與MDM2存在靶向關系。同時相關性分析證實,ACI患者血清miR-29c-3p與MDM2水平呈負相關,與網站預測的結果相一致。MDM2是腫瘤抑制因子p53的負調節因子,在多種惡性腫瘤中高表達[19-20]。早期研究表明,MDM2可通過調節心肌梗死小鼠核因子-κB通路減輕心功能不全和纖維化[21]。胡雪鐘等[22]研究證實,下調MDM2可通過影響p53通路減輕缺血性腦卒中的發展。然而,尚未有研究表明MDM2在ACI中的作用。本研究結果顯示,ACI患者血清MDM2水平較健康者高,預后不良ACI患者血清MDM2水平較預后良好ACI患者高,與胡雪鐘等[22]研究結果一致,驗證了高水平MDM2可促進缺血性腦病的進展。并且血清MDM2高水平是ACI患者預后不良的獨立危險因素,表明MDM2水平可能與ACI的預后不良有關,可能作為預測ACI預后的潛在標志物。通過構建ROC曲線發現血清miR-29c-3p、MDM2水平對ACI患者預后不良具有較高的預測價值,并且二者聯合預測的AUC和特異度上升,表明二者均有望成為ACI預后的預測因子。hs-CRP是一種常見的非特異性炎性因子,據報道,血清hs-CRP高水平是ACI預后不良的獨立危險因素[23],與本研究結果一致?？赡苁且驗閔s-CRP能與脂蛋白結合,激活經典補體途徑,直接增強靜息血管內皮細胞,介導內皮細胞中白細胞的滾動、吸附和滲出,形成不穩定斑塊,最終誘發缺血性腦卒中[24]。因此,本試驗結果可能是miR-29c-3p與MDM2相互作用,炎性因子累積,導致ACI的不良預后,具體機制還需進一步研究。

綜上,ACI患者血清miR-29c-3p呈低水平,MDM2呈高水平,且預后不良ACI患者血清miR-29c-3p較預后良好患者更低,MDM2水平較預后良好患者更高,二者聯合對ACI患者預后有較高預測價值。然而本研究為單中心研究,且樣本量不大,后續將進行大規模、多中心的研究以進一步完善該結論在多樣化ACI群體中的適用性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張蕊:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;張志勇:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;張晉霞:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;任伯:進行統計學分析