顱內大動脈粥樣硬化型急性腦梗死患者血清Annexin A2、miR-9-5p表達與顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度的關系

李波,徐世成,趙安容,李垚,張磊

急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)是一種發病率較高的腦血管疾病,具有較高的致殘率和病死率,呈現年輕化趨勢[1-2]。顱內大動脈粥樣硬化型是其重要分型,其發病因素復雜,顱內動脈粥樣硬化斑塊破裂形成的血栓是其病因之一[3]。顱內動脈粥樣斑塊負荷會影響ACI患者病情嚴重程度,大部分ACI患者伴有顱內動脈粥樣硬化,累及多個動脈節段[4-5]。故研究與ACI顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關的血清標志物,對ACI防治、改善預后有重要臨床價值。膜聯蛋白A2(Annexin A2)是一種磷脂結合蛋白,可增強吞噬細胞的吞噬作用,誘導產生炎性細胞因子,促進動脈粥樣硬化斑塊形成,且與頸動脈斑塊穩定性有關[6-7]。微小RNA(microRNA,miRNA)參與炎性反應、內皮細胞損傷、腫瘤、代謝性疾病、ACI等過程[8-9]。miR-9-5p作為一種miRNA分子能減輕腦缺血再灌注損傷并抑制炎性反應,在腦血管動脈急性梗死的發生發展中起保護作用,并且參與血管損傷修復、血管新生等過程[10]。因此,現分析血清Annexin A2、miR-9-5p表達與顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度的關系,旨在為臨床該病診治提供依據,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2022年10月四川省巴中市中心醫院神經內科收治的顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者170例作為研究組,同期選取體檢健康志愿者173例作為健康對照組。研究組男90例,女80例,年齡(60.84±9.68)歲;合并高血壓20例,糖尿病52例;家族遺傳史10例;發病至入院時間(36.82±9.04)h。健康對照組男97例,女76例,年齡(60.03±8.99)歲。2組性別、年齡、體質量指數(BMI)、飲酒史、吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)比較差異無統計學意義(P>0.05);研究組三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平均明顯高于健康對照組(P<0.05),見表1。本研究經醫院倫理委員會審核批準(BYLS2018-11-3),受試者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 健康對照組和研究組臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均符合ACI相關診斷標準,且均屬于顱內大動脈粥樣硬化型[11];②首次發病;③住院期間未發生感染者;④臨床檢查證實有梗死病灶;⑤發病至入院時間小于72 h。(2)排除標準:①出血性腦梗死、小動脈閉塞、心源性栓塞等腦梗死;②合并自身免疫疾病、腫瘤及感染者;③有頸動脈或顱內手術史;④發病后已進行溶栓治療;⑤顱內動脈瘤等其他病變;⑥精神疾病者。

1.3 觀測指標與方法 患者于入院后次日清晨、體檢健康者于體檢時采集空腹肘靜脈血8 ml,離心留取血清,-70℃貯存。

1.3.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達檢測: 取凍存的血清樣本,解凍后,采用酶聯免疫吸附法檢測血清Annexin A2水平,試劑盒購自天津康爾克生物科技有限公司(批號SYH-36071)。以RNA提取試劑盒(購自北京擎科生物科技有限公司,批號TOA307)獲取血清中總RNA,反轉錄為cDNA,采用熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測血清miR-9-5p相對表達量(PCR試劑盒購自重慶致宏生物科技有限公司,批號19635M)。qRT-PCR反應條件為95℃,3 min;91℃ 30 s、60℃ 35 s、73℃ 29 s,共37個循環。miR-9-5p、內參U6由廣州盧卡科技有限公司合成,引物序列見表2。采用2-△△CT法檢測血清miR-9-5p水平。

表2 miR-9-5p引物序列

1.3.2 顱內動脈粥樣斑塊負荷測定:患者入院后24 h內,采用磁共振掃描儀(荷蘭飛利浦公司,型號Achieva 3.0T)分析ACI患者顱內動脈粥樣硬化斑塊和管壁結構的成分,通過掃描患者大腦動脈3D-TOF序列獲得血管完整的圖像,然后進行高分辨率掃描垂直于血管狹窄的部位,然后將獲得的血管完整影像和狹窄部位影像資料由專業影像科醫生進行數據分析和定量測量,在高分辨率大腦動脈圖像上測得血管總面積、最狹窄血管的管腔面積。顱內動脈粥樣斑塊負荷=(血管總面積-最狹窄血管的管腔面積)/血管總面積。

1.3.3 病情嚴重程度評估及分組:顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者入院后24 h內采用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分對患者進行病情嚴重程度評估,總分為42分,分值越大,表示神經功能缺損越嚴重(病情越嚴重)。根據NIHSS評分分值分為輕度ACI亞組39例(NIHSS<5分)、中度ACI亞組56例(5～15分)和重度ACI亞組75例(NIHSS>15分)[12]。

2 結 果

2.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達比較 與健康對照組比較,研究組血清Annexin A2水平明顯升高(P<0.01),miR-9-5p表達明顯降低(P<0.01),見表3。

表3 健康對照組和研究組血清Annexin A2、miR-9-5p表達比較

2.2 顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分情況 顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者顱內動脈粥樣斑塊負荷為(0.71±0.16),NIHSS評分為(16.40±4.81)分。

2.3 不同病情程度患者血清Annexin A2、miR-9-5p、顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分比較 輕度ACI亞組、中度ACI亞組、重度ACI亞組血清Annexin A2水平、顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分依次升高(P<0.01),miR-9-5p表達依次降低(P<0.01),見表4。

表4 3組ACI亞型患者血清Annexin A2、miR-9-5p、顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分比較

2.4 血清Annexin A2、miR-9-5p表達及其與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分的相關性分析 Pearson法相關分析顯示,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2與miR-9-5p表達呈負相關(P<0.01);血清Annexin A2水平與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈正相關(P<0.01),血清miR-9-5p表達與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈負相關(P<0.01),見表5。

表5 血清Annexin A2、miR-9-5p表達及其與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分的相關性分析

2.5 影響顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的多因素Logistic回歸分析 以發生顱內大動脈粥樣硬化型ACI為因變量,以TG、TC、hs-CRP、Annexin A2、miR-9-5p、顱內動脈粥樣斑塊負荷為自變量納入Logistic回歸分析,結果顯示,血清Annexin A2水平高、顱內動脈粥樣斑塊負荷高是ACI發生的危險因素(P<0.05),miR-9-5p表達高是其保護因素(P<0.05),見表6。

2.6 血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的預測價值 繪制血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的預測效能ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清Annexin A2、miR-9-5p及二者聯合預測重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的AUC分別為0.833、0.791、0.925,二者聯合的AUC優于血清Annexin A2、miR-9-5p單獨預測的AUC(Z/P=2.530/0.011、3.364/0.001),見圖1、表7。

圖1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達預測重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的ROC曲線

表7 血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生的預測價值

3 討 論

ACI是由多種因素引發的腦血管疾病,隨著高血壓、冠心病、高血脂等發生率增加,ACI的發病率也呈逐年升高趨勢[13]。顱內動脈粥樣硬化是ACI形成的病因之一,顱內動脈粥樣斑塊負荷對判斷ACI嚴重程度具有較高的價值,并且顱內動脈粥樣硬化嚴重程度又與患者神經功能恢復有關[14-15]。因此,研究ACI患者顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關的血清標志物對ACI的防治和改善ACI患者的生活質量具有非常重要的意義。

Annexin又稱為鈣磷脂結合蛋白,其可參與細胞信號傳導、形成生物膜、調控細胞生物學活動等[16]。Annexin A2以四聚體的結構形式存在,分子量約為36 000,是一種新型的炎性標志物,存在于中性粒細胞、內皮細胞等細胞中,其中約有1/3的Annexin A2是由血管內皮細胞生成的,具有促進炎性反應的作用[17]。近期有研究顯示,Annexin A2在不穩定性斑塊患者中表達水平高于穩定性斑塊,是急性缺血性腦卒中患者頸動脈斑塊穩定性的影響因素[6]。本研究發現,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,說明Annexin A2參與ACI病理過程。血清Annexin A2水平隨ACI病情嚴重程度加重而升高,提示血清Annexin A2可能參與ACI的發生發展過程。已有研究證實,Annexin A2在冠心病患者血清中呈高表達,Annexin A2可調控血脂的轉運及血管內皮生長因子,在粥樣硬化性腦血管損傷中具有重要作用[18]。根據以往研究推測Annexin A2可能通過促進炎性反應加速內皮細胞損傷參與疾病的發生,加重中性粒細胞及吞噬細胞對腦組織損傷的干預作用。NIHSS評分越高,ACI患者病情越嚴重,顱內動脈粥樣斑塊負荷越高,說明ACI患者顱內供血嚴重不足[19-20]。經Pearson法分析顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈正相關,提示Annexin A2與ACI顱內動脈粥樣斑塊負荷及病情嚴重程度有關,說明Annexin A2可在一定程度上反映ACI病情,從而利于輔助臨床治療。

miRNA是一種內源性非編碼小分子RNA,廣泛存在于真核生物中,已有研究證實miRNA參與ACI發生發展[21-22]。miR-9-5p作為一種miRNA分子,廣泛參與多囊卵巢綜合征、大腦中動脈閉塞等多種疾病的發生[23-24]。Wang等[25]研究表明,miR-9a-5p在大腦中動脈閉塞大鼠模型中表達下調,miR-9a-5p可能會減輕大腦中動脈閉塞誘導的缺血損傷。本研究發現,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清miR-9-5p表達明顯降低,且miR-9-5p表達隨ACI病情嚴重程度的加重而降低,提示miR-9-5p在ACI發生發展過程中起重要作用,推測miR-9-5p可能通過減少內皮細胞損傷,促進血管生成抑制疾病的發生。過表達miR-9-5p通過靶向ERMP1,介導內質網應激來提高細胞活力并抑制神經元凋亡,減輕缺血性卒中,且大腦中miR-9-5p表達有助于神經修復[26]。Pearson相關性分析結果顯示,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清miR-9-5p表達與顱內動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈負相關,提示miR-9-5p與ACI患者病情嚴重程度及顱內動脈粥樣斑塊負荷有關,miR-9-5p可調控血管內皮因子,維護血管完整性,促進新生血管形成,在顱內動脈粥樣硬化ACI中發揮積極作用。本研究還發現,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2與miR-9-5p表達呈負相關,說明Annexin A2與miR-9-5p可能在ACI中存在調控作用,但具體機制仍需要后續探究。Logistic回歸分析顯示,血清Annexin A2水平高、miR-9-5p水平低、顱內動脈粥樣斑塊負荷高是ACI發生的危險因素,說明Annexin A2水平升高,miR-9-5p表達降低,介導血管平滑肌細胞增殖、遷移,損害內皮細胞,造成動脈硬化,促進ACI發生,及時監測血清Annexin A2、miR-9-5p等指標水平變化,對臨床預防ACI發生甚是有益。同時,顱內動脈粥樣斑塊負荷較高者臨床應建立高危預警體系,給予重點關注,以降低ACI風險。本研究ROC曲線結果顯示,血清Annexin A2聯合miR-9-5p表達預測重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI的AUC為0.925,優于單一指標預測效能,說明監測血清Annexin A2、miR-9-5p表達變化能夠為重度顱內大動脈粥樣硬化型ACI發生提供參考。

綜上所述,顱內大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,miR-9-5p表達降低,二者呈負相關,且均與顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關,能夠為臨床病情預測、病理機制解析提供參考。本研究不足之處:引起ACI發生的可能影響因素納入不足,導致結果存在偏倚;樣本量小,未探究血清Annexin A2、miR-9-5p表達與ACI患者預后的關系;尚未明確血清Annexin A2、miR-9-5p表達與顱內動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度的具體調控機制,仍需要基礎實驗探究血清Annexin A2、miR-9-5p表達異常的機制和作用,隨后擴大樣本,追蹤隨訪,展開深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李波:設計研究方案,課題設計,實施研究過程,論文撰寫;徐世成:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;趙安容:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;李垚、張磊:進行統計學分析