腦膠質(zhì)瘤組織中miR-4744、RIOK2表達及其對患者預后的預測價值

段升強,喬建新,徐新文,劉熙鵬,張秀峰

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高、進展快、預后差,且多數(shù)情況下手術(shù)無法完全切除[1-2]。腦膠質(zhì)瘤的預后評估具有重要意義,然而目前缺乏科學有效的判斷方法。微小RNA(miRNA)可以與其他信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)超過70%人類基因的表達[3]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可參與調(diào)控影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的腫瘤細胞增殖和侵襲等生物學行為[4]。微小RNA-4744(miR-4744)是通過二代測序在腦膠質(zhì)瘤組織中鑒定的一種新miRNA,其過表達可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲[5],但miR-4744是否可影響腦膠質(zhì)瘤患者預后尚未可知。右開放閱讀框激酶2(RIOK2)是蛋白激酶(RIO)家族的成員,又被稱為非典型激酶[6-7]。RIOK2在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中高表達,其過表達促進細胞增殖,其下調(diào)導致細胞凋亡并增加對化療的敏感性[8-9]。因此,RIOK2在惡性腫瘤的進展中發(fā)揮促進作用,可能作為腦膠質(zhì)瘤患者預后評估的生物指標。本研究檢測miR-4744、RIOK2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達,分析二者與患者臨床病理特征和預后的關(guān)系,以期為腦膠質(zhì)瘤患者的預后評估提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年12月—2017年11月河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科收治腦膠質(zhì)瘤患者102例作為研究對象,手術(shù)中收集腦膠質(zhì)瘤組織及相對應的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥3 cm)。男58例,女44例,年齡43～66(55.03±7.93)歲;腫瘤部位:額葉63例,顳葉25例,其他14例;腫瘤直徑:<3 cm 50例,≥3 cm 52例;依據(jù)“中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷和治療指南”[10]腫瘤分級標準進行分級:Ⅰ～Ⅱ級57例,Ⅲ～Ⅳ級45例;有遠處轉(zhuǎn)移者56例,無遠處轉(zhuǎn)移者46例;卡氏功能狀態(tài)(KPS)評分[11]:≥80分55例,<80分47例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(LS2014-083),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者符合相關(guān)指南制定的診斷標準[10],并結(jié)合病理檢查和頭顱CT檢查結(jié)果最終確診;②患者均為首次確診,入院前未接受臨床干預措施;③均行手術(shù)切除。(2)排除標準:①合并精神疾病;②合并其他腦部疾病;③心、肝、腎功能嚴重損害;④合并其他惡性腫瘤;⑤臨床及隨訪資料不全;⑥妊娠、哺乳期女性。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平:將腦膠質(zhì)瘤組織及癌旁正常組織勻漿,Trizol試劑盒(批號RJ6829,購自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司)提取組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,使用熒光定量PCR儀(型號Quantagene Q225,購自天津迦美惠眾科技有限公司)及PCR試劑盒(批號HJ-39115,購自杭州九洋生物科技有限公司)進行擴增。miR-4744(內(nèi)參基因U6)、RIOK2 mRNA(內(nèi)參基因GAPDH)的引物序列均由南京有晴生物科技有限公司合成,引物序列見表1。反應條件:96℃ 3 min、 95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s、71 ℃ 5 min,共進行38個循環(huán)。反應結(jié)束收集相應數(shù)據(jù),并進行Ct值分析,以2-ΔΔCt算法計算miR-4744、RIOK2 mRNA的相對表達量。

1.3.2 免疫組化法檢測RIOK2蛋白表達:制作腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織石蠟切片,脫蠟,修復抗原,3% H2O2浸泡15 min,阻斷過氧化氫酶活性,加入兔抗人RIOK2單克隆抗體(批號HPA029069,購自德國Sigma公司),室溫孵育1 h,4℃過夜,磷酸鹽緩沖液清洗1次,而后加入二抗(批號PA1173,購自廣東固康生物科技有限公司)孵育20 min,最后使用蘇木素復染,脫水、封片,顯微鏡下觀察染色結(jié)果:RIOK2蛋白染色陽性信號定位于胞質(zhì),呈中棕黃色顆粒,依據(jù)著色程度和著色百分比進行評定。著色程度:未著色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。著色百分比:無染色記0分,<25%記1分,25%～<50%記2分,50%～<75%記3分,≥75%記4分[12]。兩者乘積為半定量評價標準,≤2分為陰性,>2分為陽性。

1.3.3 預后隨訪:采用電話或門診方式隨訪,隨訪期為5年,隨訪截止日期2022年11月30日。記錄患者術(shù)后第1天到5年后的生存情況:102例均獲訪,患者死亡(死亡組)47例,生存(存活組)55例 。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織miR-4744、RIOK2表達比較 與癌旁組織比較,腦膠質(zhì)瘤組織中miR-4744表達水平明顯降低,RIOK2 mRNA和蛋白陽性率明顯升高(P<0.01),見表2、圖1。

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織RIOK2蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

表2 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織miR-4744、RIOK2表達比較

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 分別以腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平的平均值(0.43、1.60)為臨界值(≥平均值為高表達,<平均值為低表達),將患者分為miR-4744低表達組51例、miR-4744高表達組51例;RIOK2 mRNA低表達組34例、RIOK2 mRNA高表達組68例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位無關(guān)(P>0.05),與腫瘤分級、遠處轉(zhuǎn)移、KPS評分有關(guān)(P<0.01),見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.636,P<0.001)。

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平與預后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示,miR-4744低表達組患者5年生存率為31.37%(16/51),低于miR-4744高表達組的76.47%(39/51),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.874,P<0.001);RIOK2 mRNA高表達組患者5年生存率為42.65%(29/68),低于RIOK2 mRNA低表達組的76.47%(26/34),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.437,P=0.001),見圖2。

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平與預后的關(guān)系

2.5 多因素Cox回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預后的影響因素 以腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)生存情況(生存=0,死亡=1)為因變量,以腫瘤分級(Ⅰ～Ⅱ級=0,Ⅲ～Ⅳ級=1)、遠處轉(zhuǎn)移(否=0,是=1)、KPS評分(≥80分=0,<80分=1)、miR-4744(高表達=0,低表達=1)、RIOK2 mRNA(低表達=0,高表達=1)為自變量進行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示,腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級、有遠處轉(zhuǎn)移、KPS評分<80分、miR-4744低表達、RIOK2 mRNA高表達是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 多因素Cox回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預后的影響因素

2.6 存活組和死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平比較 與存活組比較,死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744表達水平明顯降低,RIOK2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01),見表5。

表5 存活組和死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平比較

2.7 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平對患者5年內(nèi)死亡的預測價值 繪制腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平對患者5年內(nèi)死亡的預測價值ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA及兩者聯(lián)合預測患者5年內(nèi)死亡的AUC分別為0.752、0.711、0.885,兩者聯(lián)合預測患者5年內(nèi)死亡的AUC高于miR-4744、RIOK2 mRNA單獨預測的AUC(Z/P=3.147/0.002、3.531/0.004),見表6、圖3。

圖3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平預測患者5年內(nèi)死亡的ROC曲線

表6 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達水平對患者5年內(nèi)死亡的預測價值

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤按照其惡性程度分為低級別(Ⅰ～Ⅱ級)和高級別(Ⅲ～Ⅳ級)膠質(zhì)瘤,不同級別腦膠質(zhì)瘤的治療方法也不盡相同,預后也相差較大[13-14]。對臨床來說,找到有效的膠質(zhì)瘤預后判斷指標很有必要。

miRNA可作為癌基因亦或腫瘤抑制因子,大量研究揭示了miRNA在膠質(zhì)瘤進展中的失調(diào)[15]。Qiu等[16]研究顯示,膠質(zhì)瘤患者腦脊液中miR-1246呈低表達,與膠質(zhì)瘤復發(fā)率相關(guān),miR-1246升高可抑制膠質(zhì)母細胞瘤的活化與生長。Song等[5]研究發(fā)現(xiàn),miR-4744可負向調(diào)控RIOK2表達來抑制膠質(zhì)瘤細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和生長。本研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織中miR-4744表達水平顯著低于癌旁組織,且miR-4744表達水平與腫瘤分級、遠處轉(zhuǎn)移、KPS評分有關(guān),與Song等[5]研究結(jié)果相符,表明miR-4744參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程,且影響疾病的進展。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示,miR-4744低表達患者5年生存率低于miR-4744高表達患者,死亡組miR-4744表達水平低于存活組,說明miR-4744與患者預后有關(guān),其低表達可能提示腦膠質(zhì)瘤患者預后不良。隨后的Cox回歸分析也顯示,miR-4744低表達是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨立危險因素。為評估m(xù)iR-4744在腦膠質(zhì)瘤患者預后中的應用價值,本研究進行了ROC曲線分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-4744預測患者5年內(nèi)死亡的AUC為0.752,表明其對腦膠質(zhì)瘤患者預后有一定的預測價值。

RIO激酶參與前糖體RNA加工和核糖體生物合成,其在核糖體合成和細胞周期進程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用,可調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長[17-18]。近年來,關(guān)于RIO激酶參與腫瘤的研究逐漸增多。Messling等[19]發(fā)現(xiàn),靶向抑制RIOK2可促使急性髓系白血病蛋白質(zhì)合成減少和白血病細胞死亡。Matsuzaki等[20]研究報道,RIOK2水平與舌鱗狀細胞癌患者生存率密切相關(guān),敲低RIOK2表達可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的生長。Yu等[21]研究發(fā)現(xiàn),RIOK2在膠質(zhì)母細胞瘤中過度表達,抑制RIOK2活性可使膠質(zhì)母細胞瘤細胞周期阻滯和凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織中RIOK2 mRNA和蛋白陽性率明顯高于癌旁組織,且RIOK2 mRNA表達水平與腫瘤分級、遠處轉(zhuǎn)移、KPS評分有關(guān),與Yu等[21]研究結(jié)果一致,說明RIOK2可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展,且與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是導致膠質(zhì)母細胞瘤侵襲特征的機制之一,其特點是上皮標志物(如E-鈣黏蛋白)缺失和間充質(zhì)標志物(如N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白)增加,被認為是膠質(zhì)瘤侵襲性的重要調(diào)節(jié)因子[22]。推測RIOK2的過表達可能提高N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白的表達,使得腫瘤細胞向周圍組織或遠處擴散的能力增加,加劇癌癥進程。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,RIOK2 mRNA高表達患者5年生存率低于RIOK2 mRNA低表達患者,RIOK2 mRNA高表達是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨立危險因素,且死亡組腦膠質(zhì)瘤組織RIOK2 mRNA表達水平高于存活組,表明RIOK2高表達與腦膠質(zhì)瘤患者不良預后相關(guān)。進一步ROC曲線分析結(jié)果顯示,RIOK2 mRNA預測腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的AUC為0.711,而miR-4744和RIOK2 mRNA兩者聯(lián)合預測的AUC為0.885,提示兩者聯(lián)合預測腦膠質(zhì)瘤患者預后的價值更高。

Gao等[9]報道稱miR-4744可以與RIOK2的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合并負調(diào)控RIOK2的表達,且miR-4744對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用可被RIOK2過表達逆轉(zhuǎn)。本研究相關(guān)性分析顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達水平呈負相關(guān),與其研究結(jié)果一致。

綜上所述,miR-4744在腦膠質(zhì)瘤組織中低表達,RIOK2 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達,二者呈負相關(guān),共同調(diào)控腦膠質(zhì)瘤患者的病情進展,且miR-4744、RIOK2 mRNA聯(lián)合對患者預后預測具有較高價值。但關(guān)于二者調(diào)控腦膠質(zhì)瘤進展的機制仍需進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

段升強:設(shè)計研究方案,實施研究過程,課題設(shè)計,論文撰寫;喬建新:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;徐新文:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉熙鵬、張秀峰:進行統(tǒng)計學分析