粉防己堿調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路對抑郁癥大鼠神經(jīng)元損傷的影響

邱雪,趙雯婧,王飛燕,李蓉,何宗嶺,姚剛

抑郁癥是一種常見的精神障礙疾病,其病因復(fù)雜,患者主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩、快感缺失、易怒喜哭等癥狀,具有持久或者反復(fù)發(fā)作的特點,嚴(yán)重時會出現(xiàn)自殺傾向和自殺行為,嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生活質(zhì)量[1-2]。抑郁癥的發(fā)病率隨著人們生活和工作壓力的增大在逐漸升高,據(jù)統(tǒng)計,抑郁癥患者人數(shù)在2005—2015年增加了18.4%,將在2030年成為全球第二大疾病[3]。目前已有的抗抑郁癥藥物治療效果有限,不能治愈難治性抑郁癥患者,因此,積極開發(fā)新的安全有效的治療抑郁癥的藥物有重要意義[4]。粉防己堿(tetrandrine,Tet)是從粉防己根中分離出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿,具有抗炎、抗腫瘤、抑制纖維化、鎮(zhèn)痛等多種生理活性[5]。Gao等[6]研究發(fā)現(xiàn),Tet可以通過增加抑郁大鼠體質(zhì)量、1%蔗糖消耗量和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平,在抑郁大鼠模型中發(fā)揮抗抑郁的作用。Sheng等[7]同樣發(fā)現(xiàn),Tet具有緩解、治療抑郁癥的作用。近年來,Nrf2/HO-1/NLRP3通路成為抑郁癥研究的熱點。一項研究發(fā)現(xiàn),二氫硫辛酸通過Nrf2/HO-1/NLRP3通路對脂多糖誘導(dǎo)的抑郁大鼠具有預(yù)防作用[8]。Tao等[9]同樣發(fā)現(xiàn),厚樸酚通過調(diào)控Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路,使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2表型極化,從而減弱小鼠抑郁行為。但Tet能否通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路改善抑郁癥大鼠神經(jīng)元損傷,尚不清楚。因此,本研究旨在探討Tet對抑郁癥大鼠神經(jīng)元損傷的影響及其可能的作用機(jī)制,以期為臨床治療抑郁癥提供一定的參考價值,報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物:SPF級SD大鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可編號:SCXK(湘)2019-0014],8～10周齡,體質(zhì)量180～200 g,飼養(yǎng)溫度22 ℃,濕度55%～60%,12 h光暗循環(huán),每小時通風(fēng)8～12次。不禁食水。(2)主要試劑:Tet、蛋白提取試劑盒購于北京伊塔生物科技有限公司;皮質(zhì)酮購于上海凜恩科技發(fā)展有限公司;ML385 Nrf2/HO-1/NLRP3通路抑制劑購于上海一研生物科技有限公司;HE染色試劑盒、Nissl染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;活性氧試劑盒(ROS)購于上海烜雅生物科技有限公司;過氧化氫酶試劑盒(CAT)、丙二醛(MDA)、白介素-6和白介素-β(IL-6,IL-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;兔抗凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、Nrf2、HO-1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗抗體購于美國Abcam公司;辣根酶標(biāo)記羊抗兔二抗購于上海信裕生物科技有限公司。

1.2 實驗方法 2022年3—7月在電子科技大學(xué)腦科學(xué)學(xué)院附屬臨床醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室進(jìn)行實驗。選用SD大鼠72只,隨機(jī)數(shù)字表法分為6組(12只/組):空白組、模型組、Tet低劑量組、Tet中劑量組、Tet高劑量組、抑制劑組。除空白組外余大鼠采用皮下注射皮質(zhì)酮構(gòu)建抑郁癥模型,每天1次,連續(xù)28 d,具體操作參考文獻(xiàn)[10]。通過行為學(xué)指標(biāo)觀測判定造模成功[11]。在建模后第8天,Tet低、中、高劑量組大鼠分別灌胃10、20、40 mg/kg的Tet[6],并腹腔注射等量的生理鹽水;抑制劑組大鼠灌胃40 mg/kg的Tet和腹腔注射30 mg/kg的ML385[12];模型組和空白組大鼠灌胃并腹腔注射等量的生理鹽水,每天1次,持續(xù)21 d。在建模結(jié)束后稱量各組大鼠體質(zhì)量。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 大鼠行為學(xué)檢測:糖水偏好試驗:首先對大鼠進(jìn)行糖水訓(xùn)練,第1天每籠放2瓶1%蔗糖水,第2天將1瓶蔗糖水換成純水。大鼠禁食禁水24 h后,籠中放定量好的1瓶1%蔗糖水和1瓶純水,1 h后取走稱質(zhì)量,計算大鼠糖水偏好率。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

強(qiáng)迫游泳試驗:將大鼠放入透明的圓柱形筒中(水深約40 cm,水溫24℃±2℃)適應(yīng)2 min后,記錄5 min內(nèi)大鼠在水中不動時間。

曠場試驗:將大鼠放在底部為25個方格的黑色敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)中間自由活動1 min后,記錄4 min內(nèi)的水平跨格次數(shù)及垂直活動次數(shù),兩項總次數(shù)之和表示大鼠自主活動評分。

1.3.2 HE及Nissl染色:頸椎脫臼處死6只大鼠后,分離出大鼠大腦組織中的海馬組織,在4%多聚甲醛固定24 h后,蔗糖梯度脫水,石蠟包埋后切片(3 μm)。然后將切片放進(jìn)二甲苯進(jìn)行脫蠟,隨后進(jìn)行HE染色與Nissl染色。乙醇脫水后封片,在顯微鏡觀察,隨機(jī)選取Nissl染色切片上CA1區(qū)5個視野進(jìn)行神經(jīng)元計數(shù)。

1.3.3 透射電鏡觀察海馬突觸超微結(jié)構(gòu):將上述剩余海馬組織切塊,先后用戊二醛(2.5%)固定3 d、鋨酸(1%)避光固定2 h,經(jīng)無水乙醇、丙酮梯度脫水,包埋劑滲透包埋后切片(50 nm),鈾鉛雙染色后在透射電鏡下觀察海馬神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4 大鼠海馬組織中炎性因子和氧化應(yīng)激產(chǎn)物的檢測: 處死剩余6只大鼠,分離出海馬組織,將大鼠海馬組織制成勻漿后,根據(jù)IL-6、IL-β、TNF-α ELISA試劑盒檢測大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平,CAT、ROS、MDA試劑盒檢測大鼠海馬組織中CAT、ROS、MDA水平。

1.3.5 Western-blot法檢測Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路蛋白及ASC、Caspase-1蛋白表達(dá):提取各組大鼠海馬組織總蛋白,對蛋白進(jìn)行定量、電泳分離。轉(zhuǎn)PVDF膜后室溫條件下封閉2 h,最后再分別加Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH一抗在4℃條件下孵育過夜,加入二抗在37℃條件下孵育90 min。最后Image J軟件分析各個蛋白條帶的灰度值,計算各個蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 Tet對大鼠體質(zhì)量及行為學(xué)的影響 與空白組比較,模型組大鼠體質(zhì)量、糖水偏好率、自主活動評分顯著降低,不動時間顯著升高,有明顯的焦慮和抑郁樣特征(P<0.05);與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、糖水偏好率、自主活動評分顯著升高,不動時間顯著降低(P<0.05);與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠體質(zhì)量、糖水偏好率、自主活動評分顯著降低,不動時間顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及行為學(xué)比較

2.2 Tet對大鼠海馬組織及神經(jīng)元損傷的影響 空白組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常,錐體細(xì)胞排列緊密有序且完整,細(xì)胞核清晰,胞漿內(nèi)有大量尼氏小體;模型組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)受損,錐體細(xì)胞排列松散無序,部分核固縮,尼氏小體、神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05);與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)較為正常,錐體細(xì)胞排列較為整齊有序,細(xì)胞較為完整,核固縮現(xiàn)象減輕,尼氏小體、神經(jīng)元數(shù)目增加(P<0.05);與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元損傷加重,神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05),見圖1、2和表2。

圖1 各組大鼠海馬組織損傷情況(HE染色,×400)

圖2 各組大鼠神經(jīng)元損傷情況(Nissl染色,×400)

表2 各組大鼠神經(jīng)元存活情況比較

2.3 Tet對大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)的影響 空白組大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)清晰且完整、神經(jīng)元細(xì)胞器豐富,突觸囊泡豐富,突觸數(shù)量多,突觸前膜致密區(qū)存在、連續(xù),樹突棘基質(zhì)均勻。與空白組比較,模型組大鼠線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,神經(jīng)元胞核皺縮,基質(zhì)稀疏,突觸數(shù)量減少,活性帶長度和致密區(qū)厚度顯著降低,突觸間隙顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)有明顯改善,神經(jīng)元各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常、前后膜邊界相對清晰,活性帶長度和致密區(qū)厚度顯著增加,突觸間隙顯著降低(P<0.05)。Tet高劑量組大鼠突觸數(shù)量和突觸小泡明顯增多,Tet低劑量組大鼠突觸數(shù)量增加不明顯。與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)受損加重,線粒體腫脹及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯,突觸數(shù)量減少,活性帶長度和致密區(qū)厚度顯著降低,突觸間隙顯著增加(P<0.05),見圖3和表3。

圖3 透射電鏡觀察各組大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

表3 各組大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

2.4 Tet對大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平的影響 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05);與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠海馬組織中IL-6、IL-β、TNF-α水平比較

2.5 Tet對大鼠海馬組織中CAT、ROS、MDA水平的影響 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中CAT活性顯著減弱,MDA、ROS水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠海馬組織中CAT活性顯著增強(qiáng),MDA、ROS水平顯著降低(P<0.05);與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠海馬組織中CAT活性顯著減弱,MDA、ROS水平顯著升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠海馬組織中CAT、ROS、MDA水平比較

2.6 Tet對大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低,NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,Tet低、中、高劑量組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高,NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與Tet高劑量組比較,抑制劑組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低,NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖4和表6。

注:A.空白組;B.模型組;C.Tet低劑量組;D.Tet中劑量組;E.Tet高劑量組;F.抑制劑組。

表6 各組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

重度抑郁癥是一種慢性、復(fù)發(fā)性和潛在威脅生命的多病因異質(zhì)性精神疾病,其患病率和病死率極高[13]。實驗中常用皮下注射皮質(zhì)酮構(gòu)建抑郁癥大鼠模型進(jìn)行動物研究,以往對抑郁癥模型大鼠研究發(fā)現(xiàn)[3,10-11],大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、探索欲與活動度低、絕望等抑郁情緒。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量、糖水偏好率、自主活動評分顯著降低,強(qiáng)迫游泳不動時間延長等抑郁行為,與前人研究結(jié)果一致,說明抑郁癥大鼠模型構(gòu)建成功[11]。

目前臨床上對抑郁癥的治療雖然有效,但因存在著用藥時間長、易產(chǎn)生不良反應(yīng)等問題,仍不夠理想,因此,研究出更快速、更安全、更有效的抗抑郁藥物是臨床上亟待解決的難題[14]。研究表明,來源于中草藥的Tet能增加抑郁大鼠體質(zhì)量和1%蔗糖消耗量、降低強(qiáng)迫游泳試驗和尾懸實驗的靜止時間,具有緩解、治療抑郁癥的作用[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),Tet能縮短強(qiáng)迫游泳不動時間,增加大鼠體質(zhì)量、糖水偏好率、自主活動評分,大鼠抑郁行為得到顯著改善,與前人研究結(jié)果一致。

神經(jīng)炎性反應(yīng)被認(rèn)為與神經(jīng)精神疾病有關(guān),一些臨床研究表明,抑郁癥狀與促炎因子的表達(dá)之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。而且,抗炎藥的使用已被證明可以改善抑郁癥狀,證明了炎性反應(yīng)作為抑郁癥介質(zhì)的重要性[15]。機(jī)體免疫功能紊亂所引起的中樞炎性反應(yīng)會損傷神經(jīng)元,導(dǎo)致神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變。Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,已成為炎性疾病的潛在治療靶點。HO-1是一種具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用的酶,Nrf2是HO-1表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)制器[16]。Nrf2/HO-1信號通路在抗炎中起著關(guān)鍵作用。其他研究表明,激活的Nrf2/HO-1信號通路可能會減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[17]。已知神經(jīng)炎性反應(yīng)和NLRP3炎性小體激活與抑郁癥的病理有關(guān)。NLRP3是細(xì)胞內(nèi)一種多蛋白質(zhì)復(fù)合體,由NLRP3、ASC及pro-Caspase-1組成。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時,NLRP3被激活并能夠通過結(jié)合蛋白ASC招募pro-Caspase-1,形成NLRP3炎性小體。在NLRP3炎性小體的作用下pro-Caspase-1被激活成為Caspase-1,最終導(dǎo)致IL-1β、IL-18的成熟與分泌,引起一系列炎性反應(yīng)[18]。阻斷NLRP3/Caspase-1途徑,對神經(jīng)炎性反應(yīng)和認(rèn)知障礙具有神經(jīng)保護(hù)作用[19]。ROS是氧化還原反應(yīng)的正常代謝產(chǎn)物,ROS水平過高會破壞細(xì)胞的完整性,通過細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、線粒體和DNA的過氧化作用導(dǎo)致組織功能障礙[20]。文獻(xiàn)報道ROS與NLRP3炎性小體激活相關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn),激活Nrf2/HO-1/NLRP3通路,可有效地降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及Caspase-1、ROS的水平,對緩解抑郁大鼠的抑郁行為有很好的效果[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),Tet不僅對TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等均有顯著的抑制作用,還對神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn),Tet顯著增加海馬組織中神經(jīng)元數(shù)目、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平及CAT活性,降低NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平、炎性因子(IL-6、IL-β、TNF-α)及MDA、ROS水平。

綜上所述,Tet可能通過激活Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路,減輕海馬組織炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷,從而起到緩解大鼠抑郁的作用。此研究為抑郁癥的治療提供了新思路。然而本研究尚存在不足之處,僅驗證了Tet對Nrf2/HO-1/NLRP3信號通路的作用,未對其他靶點、途徑進(jìn)行驗證,后續(xù)研究將會進(jìn)一步明確Tet在抑郁癥中的作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

邱雪、趙雯婧:提出研究思路,設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;王飛燕、李蓉:分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;何宗嶺、姚剛:實施研究過程,進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,論文修改