常氧和低氧條件下肌肽對腦膠質瘤細胞增殖的作用及其機制

段榮清，厲柳岑，湯旗，梅蕾，沈耀

溫州醫科大學 檢驗醫學院（生命科學學院），浙江 溫州 325035

膠質瘤是常見的原發性顱內腫瘤之一，也是最具侵襲性和最致命的腦腫瘤，分為不同的級別和組織學亞型[1]。流行病學表明膠質瘤發生在各個年齡段，但以成年人多見，男性比女性更容易患病[2]。 目前，膠質瘤的治療主要通過手術切除和輔助放化療。膠質瘤腫瘤細胞向周圍正常組織明顯侵襲性和浸潤增殖大大降低了治療效果，導致患者預后惡化，5年病死率超過90%[3-5]。肌肽是一種天然存在的二肽，廣泛分布在肌肉、大腦等可興奮組織中，具有多種有益作用，包括抗氧化、抗糖化、離子螯合劑、傷口愈合促進劑和自由基清除劑[6]。研究[7]表明，肌肽具有抑制體內惡性細胞生長的潛力，被視為潛在的抗癌藥物。為了明確肌肽對膠質瘤的抗腫瘤作用，本研究探討了常氧和低氧條件下肌肽對人腦膠質瘤細胞增殖的影響及其潛在的分子機制，為膠質瘤的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞培養人膠質瘤細胞系U251和U87分別購自中國典型培養物保藏中心和中國科學院細胞生物學研究所。DMEM購自美國Gibco公司；FBS購自澳洲CLARK公司；L-Glutamine（100×）和青霉素-鏈霉素（100×）購自上海碧云天生物技術有限公司。U251和U87細胞均在補充有10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素鏈霉素的DMEM中培養。用DMEM溶解肌肽并配置成500 mmol/L的溶液。細胞樣本分為常氧組、常氧+肌肽組、低氧組、低氧+肌肽組。常氧和低氧組加入適量完全培養基后分別放入常氧培養箱（21% O2、5% CO2、37 ℃）和低氧培養箱（1% O2、5% CO2、 37 ℃）中繼續培養。常氧+肌肽組和低氧+肌肽組根據實驗所需肌肽濃度加入藥物，然后加入適量完全培養基后分別放入常氧培養箱和低氧培養中繼續培養。

1.2 試劑和儀器肌肽購自中國生工生物科技公司；MTT粉末購自上海碧云天生物技術有限公司；DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。一抗試劑包括：c-Myc（1:1000，美國Abcam公司），L-型氨基酸轉運蛋白1（L-type amino acid transporter 1, LAT1）（1:1000，美國Affinity公司），β-actin（1:1000，上海碧云天生物技術有限公司）。儀器主要包括酶標儀Varioskan flash（美國賽默飛公司）、流式細胞儀CytoFLEX（美國貝克曼公司）、超高效液相 Acquity UPLC H-Class/Acquity UPLC IClass（美國Waters公司）、高分辨質譜Xevo-G2-XS QTOF（美國Waters公司）、低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）、Milli-Qs超純水儀（德國Merck Millipore公司）、二氧化碳恒溫細胞培養箱（美國賽默飛公司）、Galaxy 170R CO2培養箱（美國Eppendorf公司）。

1.3 MTT實驗將細胞以2×103的密度接種在96孔板中，然后用不同濃度的肌肽（25 mmol/L和 50 mmol/L）處理細胞72 h。接下來向每孔加入 100 μL 5 g/L MTT溶液，將板放置在37 ℃下孵育4 h，棄掉上清液后加100 μL DMSO溶液溶解甲臜結晶。最后使用酶聯免疫吸附儀在570 nm處測量每個樣品的吸光度。MTT實驗表明，與25 mmol/L相比， 50 mmol/L肌肽處理后細胞活力變化更顯著，細胞狀態還可以，可以進行后續實驗，實驗結果也更明顯，所以確定用50 mmol/L肌肽進行研究。

1.4 克隆形成實驗將細胞以每孔300個的密度接種于6孔板中，待貼壁后用50 mmol/L肌肽處理細胞。每隔3～4 d換1次液，連續培養至形成肉眼可見的克隆團。用PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫溶液染色樣品后計數克隆團。

1.5 Annexin/PI凋亡實驗將約6×105個細胞接種到培養皿中，用50 mmol/L肌肽處理72 h，然后按照試劑盒手冊方案KGA-108（南京凱基生物科技公司）通過流式細胞術觀察和檢測膠質瘤細胞的凋亡情況。

1.6 非靶向代謝組學用肌肽處理U251細胞72 h后，0.25%胰酶消化，離心收集細胞。PBS洗滌細胞3次后，離心去除上清液。樣品液氮急劇冷凍后迅速轉入-80 ℃保存，收集常氧組、常氧+肌肽組共12個樣本送至杭州聯川生物技術有限公司進行分析。

1.7 LC-MS法檢測蛋氨酸水平變化用有機試劑提取代謝樣品，然后從每個樣品中吸取20 μL混合制成QC樣品。使用孔徑為0.22 μm PTFE膜過濾上清液，然后裝入2 mL琥珀色色譜瓶中（帶250 μL內套管），擰緊蓋子，排出內套管中的氣泡。Acquity UPLC H級/Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀配備了QSM四元系統和BSM二元系統，FTN自動進樣器，在線脫氣器。設置以下所有參數，T3柱溫為40 ℃，酰胺柱溫為45 ℃，進樣盤溫度為10 ℃，進樣體積為5 μL。

1.8 蛋白質印跡（Western blot）法將肌肽處理細胞72 h（課題組前期研究選擇了24、48、72 h 3個處理時間，發現作用72 h既能顯著抑制細胞增殖，也不會過度損傷而影響后續各項檢測）后提取總蛋白，通過BCA方法測定蛋白質濃度，根據標準程序進行Western blot。使用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質樣品，然后轉移到PVDF膜上。膜在5%脫脂牛奶中緩慢搖動2 h，一抗中4 ℃孵育過夜，在二抗山羊抗兔抗體（1:1000，上海碧云天生物技術有限公司）孵育1 h。最后使用化學發光試劑BeyoECL Plus（上海碧云天生物技術有限公司）和凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）曝光條帶。

1.9 實時熒光定量PCR將2×104個細胞/孔接種到6孔板中，用肌肽處理72 h后提取總RNA。接下來采用Nanodrop儀器（Nanodrop 2000 Technologies） 檢測RNA濃度。使用合成cDNA HiScript II Q RT SuperMix進行反轉錄。熒光定量PCR在CFX96熒光定量PCR儀器（美國Bio-Rad公司）中進行。所用引物的序列如下：c-Myc上游引物5’-GTCAAGAGGCGAAC ACACAAC-3’，下游引物5’-TTGGACGGACAGGATAT-3’；LAT1上游引物5’-ATATCACGCTGCTCAACGGTG-3’，下游引物5’-CTCCAGCATGTAGGCGTAGTC-3’；GAPDH上游引物5’-CACCATGAAGATCAAGATCATTGC-3’，下游引物5’-GG CCGGACTCATCGTACTCCTGC-3’。

1.10 統計學處理方法采用Graphpad prism 8.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以±s表示。兩組間的比較用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法；多元統計分析采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肌肽對膠質瘤細胞增殖的影響在常氧和低氧條件下，用不同濃度的肌肽（25 mmol/L、 50 mmol/L）處理U251和U87細胞72 h后，U251、U87細胞常氧+肌肽組與常氧組比細胞活力顯著下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）；低氧+肌肽組與低氧組比，細胞活力也顯著下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）；并且肌肽濃度越高，對細胞增殖抑制作用越明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 肌肽對腦膠質瘤細胞細胞活力的影響

2.2 肌肽對腦膠質瘤細胞克隆形成能力的影響在常氧和低氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251和U87細胞后，U251、U87細胞常氧+肌肽組與常氧組比克隆團數顯著減少，差異有統計學意義（均P＜0.01）；低氧+肌肽組與低氧組比克隆團數也顯著減少，差異有統計學意義（均P＜0.01）。50 mmol/L 肌肽處理后，腦膠質瘤細胞的克隆形成能力明顯受到抑制，見圖2。

2.3 肌肽對腦膠質瘤細胞凋亡的影響在常氧和低氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251細胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比，凋亡細胞比例上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧+肌肽組與低氧組比，凋亡細胞比例也上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。這表明肌肽促進膠質瘤細胞的凋亡進程。

圖3 肌肽對U251細胞凋亡的影響

2.4 肌肽對膠質瘤細胞代謝的影響PCA圖顯示常氧+肌肽組與常氧對照組分離趨勢明顯，見圖4A；PLS-DA提示模型穩定可靠，可用于后續差異物的尋找與分析，見圖4B。用火山圖和熱圖表示差異分析結果，火山圖和熱圖提示肌肽作用后代謝物存在顯著性差異，見圖4C、圖4D。50 mmoL/L肌肽處理U251細胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比，部分代謝物含量發生變化，賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、鞘氨醇、煙酰胺單核苷酸的含量下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4E。

圖4 肌肽對膠質瘤細胞代謝的影響

2.5 肌肽對腦膠質瘤細胞蛋氨酸水平的影響在常氧條件下，用50 mmol/L肌肽處理U251細胞72 h后，常氧+肌肽組與常氧組比蛋氨酸含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 肌肽對U251細胞蛋氨酸水平的影響

2.6 肌肽對腦膠質瘤細胞c-Myc表達的影響與常氧組或低氧組比，常氧+肌肽組和低氧+肌肽組的c-Myc蛋白和mRNA的表達水平下調，差異有統計學意義（P＜0.05），表明肌肽從轉錄水平上影響c-Myc的表達，見圖6。

圖6 肌肽對膠質瘤細胞c-Myc表達的影響

2.7 肌肽對腦膠質瘤細胞LAT1表達的影響與常氧組或低氧組比，肌肽處理組下調了U251細胞LAT1蛋白和mRNA的表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05）；但肌肽對U87細胞LAT1蛋白的表達無影響（P＞0.05），見圖7。

圖7 肌肽對膠質瘤細胞LAT1表達的影響

3 討論

膠質瘤是一種中樞神經系統腦腫瘤疾病，起源于神經膠質細胞的病變，其主要特征是廣泛的浸潤性生長和新生血管形成[8]。目前膠質瘤的治療成功率和總生存率仍較低，臨床上治療膠質瘤具有一定的挑戰性[9]，因此積極尋求新的治療策略和藥物對改善膠質瘤患者的預后變得尤為重要。

近年來，肌肽的廣譜抗癌作用引起了研究人員的關注[10]。越來越多的研究表明，肌肽具有抑制體內惡性細胞生長的潛力。相關文獻報道，肌肽能夠抑制腫瘤細胞的增殖，增強腫瘤細胞周期阻滯，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞糖酵解[7，11]。因此，肌肽被認為可能是治療惡性膠質瘤或其他腫瘤的潛在藥物[12]。

本研究探索了常氧和低氧條件下肌肽對腦膠質瘤細胞增殖的影響及潛在分子機制。研究發現不同濃度肌肽作用后，不論是常氧還是低氧狀態，膠質瘤細胞活力受到明顯抑制，具有一定的濃度依賴性。這提示肌肽可能同時作用于線粒體氧化代謝途徑和糖酵解途徑從而發揮抑制膠質瘤細胞增殖的潛能。肌肽還抑制膠質瘤細胞的克隆形成能力。細胞凋亡指的是為了維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的程序性死亡。凋亡進程的改變是腫瘤發生發展的重要變化之一[13]，研究表明肌肽促進膠質瘤細胞的凋亡，進而起到抗腫瘤作用。

過去十年中，在癌細胞代謝領域的研究揭示了代謝改變與癌癥進展之間的聯系[14]。為了探索肌肽作用后膠質瘤細胞的代謝變化情況，進行了非靶向代謝組學分析。研究發現肌肽導致膠質瘤細胞的氨基酸水平發生變化，部分必需氨基酸包括蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸的含量下調。WANDERS等[15]研究證明限制蛋氨酸可以選擇性地抑制癌細胞生長。此外，LC-MS實驗也表明肌肽使膠質瘤細胞蛋氨酸含量下調，這與代謝組學結果一致。豐富的氨基酸供應對于癌癥維持其增殖驅動力很重要[16]。這些結果均提示肌肽可能通過影響膠質瘤細胞的氨基酸代謝從而抑制細胞增殖來發揮抗癌作用。

c-Myc是一種重要的轉錄因子，在大多數人類腫瘤中表達上調，可調控全局基因表達并協調多種生理過程，包括細胞增殖，細胞分化，細胞周期，代謝和凋亡等[17]。本研究發現肌肽能夠下調膠質瘤細胞c-Myc蛋白的表達，進而起到抗癌作用。高度增殖的癌細胞對氨基酸的需求增加，需要選擇性上調氨基酸轉運蛋白，其受轉錄途徑的調節[18]。LAT1運輸包含部分必需氨基酸在內的大的中性氨基酸，在介導氨基酸攝取中起重要作用，從而調節細胞生長、增殖以及其他細胞功能[19]。肌肽作用后，膠質瘤細胞的LAT1表達下調，限制了部分氨基酸的轉運，從而影響了細胞的氨基酸代謝并產生增殖抑制作用。綜上所述，本研究發現肌肽能顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，且常氧和低氧條件下的增殖抑制作用沒有顯著差異，這種抑制作用可能與c-Myc/LAT1軸相關。肌肽影響膠質瘤細胞的氨基酸代謝，進而限制腫瘤細胞的增殖來發揮抗癌作用。