基于IL-23/Th17炎癥軸探討腎康丸對糖尿病大鼠腎臟保護的作用機制研究*

林潔華 周 賽 吳光付 劉雅詩 李貴娟

廣東省江門市五邑中醫院 1 腎病科 2 三門診 529000

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)常見而且較嚴重的并發癥之一[1]。DN起病隱匿,早期往往無明顯臨床癥狀,隨著病情逐漸進展,會出現高血壓、尿蛋白陽性等癥狀,進入DN蛋白尿期,最終發展至終末期腎功能衰竭,這是糖尿病致死最重要的原因之一[2]。DN早期,多種促炎癥因子如CRP、IL-6、TNF-α等會出現不同程度的升高,與TGF-β、NF-кB構成炎癥因子網絡,參與了DN及DM微血管并發癥的發生和發展[3-4]。大量研究顯示IL-23介導Th17的炎癥反應生成IL-23/Th17炎癥軸參與了慢性炎癥性疾病的發生發展[5-6],可能是糖尿病腎病發生、發展的重要環節。

腎康丸是經過臨床可以有效治療DN的經驗方劑,可以延緩DN病情進展以及腎衰竭的發生。前期研究顯示:腎康丸可以降低脾腎氣虛血瘀型T2DM尿毒癥患者的炎癥因子水平、改善腎功能,并且可以作用于早期臨床DN患者及DN大鼠模型炎癥因子網絡而產生腎保護[7]。本研究建立了DN大鼠模型,通過檢測IL-23/Th17炎癥軸相關細胞因子的水平,初步探討IL-23/Th17炎癥軸對T2DM大鼠腎臟損傷的作用及可能的機制;進一步通過腎康丸作用于DN大鼠,觀察其對于T2DM大鼠IL-23/Th17炎癥軸表達的影響,為DN的防治尋找新的理論依據,促進腎康丸的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物。8～12周齡SPF 級雄性SD大鼠20只,體質量為(220±20)g。大鼠自由飲水攝食,溫度25℃,相對濕度50%,適應性飼養7d后進行實驗。

1.1.2 實驗試劑。腎康丸(組成:黃芪、芡實、金櫻子、玉米須等)、STZ(ABT650,美國Sigma公司)、檸檬酸緩沖液、4%多聚甲醛(PT028S,上海博古生物有限公司)、IL-1 ELISA試劑盒(CSB-E08055r, 武漢華美生物工程有限公司)、IL-6 ELISA試劑盒(ab100772,美國Abcam公司)、IL-8 ELISA試劑盒(386m0914,天津安諾瑞康生物技術有限公司)、IL-17 ELISA試劑盒(CSB-E07451r, 武漢華美生物工程有限公司)、IL-22 ELISA試劑盒(CSB-E13418h,武漢華美生物工程有限公司)、IL-23 ELISA試劑盒(I11018354,武漢華美生物工程有限公司)、TNF-α ELISA 試劑盒(ab100785,美國Abcam公司)、TGF-β ELISA 試劑盒(ab119558,美國Abcam公司)、PCNA抗體(ab92552,美國Abcam公司)、TGF-β抗體(AF1027,Affinity)、NF-κB抗體(ab220803,美國Abcam公司)、辣根過氧化物酶(HRP) 標記IgG 抗體(BHR101,北京博爾西科技有限公司)、FITC-IL17A抗體(11-7177-81,上海北諾生物科技有限公司)、Trizol(CW0580,康為世紀公司)、逆轉錄試劑盒(639503,Takara公司)、q-RT-PCR試劑盒(RR430S,Takara公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 T2DM大鼠模型構建。隨機選取10只大鼠標準飼料正常喂養設定為正常對照組(CT組)。20只大鼠用于T2DM模型構建,采用高脂飼料喂養小鼠8周后,對小鼠進行禁食處理12h,隨后腹腔注射STZ-檸檬酸緩沖液(60mg/kg),72h后尾靜脈采血測血糖,連續2次空腹血糖(FBG)≥13.5mmol/L者即為T2DM大鼠模型成功,設定為模型組(DN組);正常對照組大鼠注射相同體積的檸檬酸緩沖液。

1.2.2 分組與給藥。將構建成功的T2DM模型大鼠隨機分為兩組:模型組(DN組)和腎康丸治療組(SK組),每組10只。SK組大鼠每天通過灌胃給予腎康丸350mg,相當于成人每天服用18g;CT組和DN組大鼠每天通過灌胃給予等量的生理鹽水。各組大鼠均連續給藥8周。

1.3 樣本采集和指標檢測

1.3.1 標本采集和處理。隨機選取CT、DN和SK組大鼠各6只,禁食12h后稱量大鼠體重,采用腹腔注射水合氯醛(10%,300mg/kg)的方法對大鼠進行麻醉,隨后采集腹主動脈血液,一部分保留全血用于流式細胞檢測,一部分靜置后3 000r/min,離心15min,分離血清,用于生化指標檢測。處死大鼠后選取左側腎臟,用PBS沖洗干凈,去包膜和腎周脂肪組織,取一半置于4%多聚甲醛中固定保存用于免疫組化染色,另一半右腎放入液氮保存,用于q-RT-PCR檢測。

1.3.2 血清生化指標及炎癥因子表達水平檢測。各組大鼠全血采用流式細胞術檢測Th17細胞含量;分離血清;隨后利用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中C反應蛋白(CPR)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,采用ELISA法測定各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL8水平,具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.3.3 腎臟組織 TNF-α、IL-17、IL-23、TGF-β和NF-κВ mRNA表達水平檢測。提取腎臟組織RNA,逆轉錄成cDNA后,通過實時熒光定量PCR檢測相關基因的mRNA表達水平,利用2-ΔΔCT方法計算mRNA的相對表達量。

1.3.4 大鼠PCDNA、TGF-β、NF-κB陽性面積。對PFA固定好的腎臟組織進行逐級脫水,隨后進行石蠟包埋,切片后經過脫蠟、抗原修復等過程進行PCDNA、TGF-β、NF-κB免疫組化染色,并用顯微鏡拍攝圖像。采用ImageJ-ProPlus6.0 對圖像中的陽性反應部位進行統計分析。

2 結果

2.1 血清生化水平 DN組大鼠Scr、BUN和CRP水平相對于CT組顯著升高(P<0.05),SK組Scr、BUN和CRP水平較DN組顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Scr、BUN、CRP水平對比

2.2 IL-23/Th17炎癥軸相關細胞因子 與CT組相比,DN組大鼠血清的TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL-8、Th17水平顯著升高(P<0.05);SK組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL-8、Th17水平較DN組顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-23/Th17炎癥軸相關細胞因子水平對比

2.3 大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達水平 DN組大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達水平與CT組相比顯著上調(P<0.05);與DN組相比,SK組TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達水平顯著下調(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB mRNA表達水平對比

2.4 大鼠腎臟PCNA百分比和TGF-β、NF-κB的陽性面積 通過免疫組化染色發現:與CT組相比,DN組PCNA的棕色陽性區域顯著增加,說明DN組腎小球的細胞增殖活性顯著增強(P<0.05);而腎康丸治療后SK組陽性面積顯著減少,說明PCNA表達顯著下降(P<0.05)。且DN組TGF-β、NF-κB陽性面積相比于對照組顯著升高(P<0.05),SK組相對于DN組TGF-β、NF-κB陽性表達顯著下降(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腎臟PCNA百分比和TGF-β、NF-κB陽性面積對比

3 討論

DN是糖尿病患者最常見的并發癥之一,同時也是引起終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)的主要誘因之一。近些年來,我國DN的發病率也出現逐年升高的趨勢[8]。研究表明,當人體血液長期處于高糖環境時,體內糖代謝會出現紊亂,誘導腎臟產生過量的活性氧,促使大量炎癥因子的合成、釋放,進而引發腎臟產生嚴重的炎癥和氧化應激反應,導致腎細胞壞死,最終引發終末期腎病[9-11]。DN一旦發展為末期腎病,治療難度增加,且效果不佳。因此,糖尿病患者中DN的及時防治,對腎組織的保護意義重大[12]。

腎康丸是魏連波教授通過多年的臨床觀察與摸索,篩選提煉的治療DN經驗方劑。多項研究發現,腎康丸具有益氣健脾、滋陰養腎等功效,可以作用于早期臨床DN患者及DN大鼠模型炎癥因子網絡而產生腎保護,并且對脾腎氣虛血瘀型T2DM尿毒癥患者具有降低炎癥因子、改善腎功能的作用,可多方面延緩DN的發生、發展[7,13-14]。研究發現,IL-23可以促進輔助性T細胞17(Th17)分泌IL-17、IL-21等多種炎癥因子,進而引發腎臟的局部炎癥反應[15]。此外,多項研究發現,在DN早期存在多種促炎癥因子(如TNF-α、CRP和IL-6等)顯著升高,與TGF-β、NF-кB構成炎癥因子網絡,參與了DN及DM微血管并發癥的發生和發展。

在本研究中,與CT組相比,DN模型組大鼠血清中IL-23、IL-17、IL-21等炎癥因子及Th17細胞比例水平顯著升高,提示IL-23/Th17炎癥軸可能DN大鼠的腎臟損傷。而與DN組大鼠相比,腎康丸治療組大鼠IL-23/Th17炎癥軸相關炎癥因子表達水平下降,說明腎康丸治療可以調控IL-23/Th17炎癥軸從而對DN大鼠的腎臟起保護作用。此外,DN組IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥因子的表達水平顯著上升。研究發現,持續高血糖可以導致腎臟內性氧及糖基化終末產物增加,啟動炎性反應、內皮功能障礙,進而激活NF-кB信號通路,增強NF-кB活性,進一步促進TNF-α、TGF-β等趨化因子和細胞黏附分子的釋放增加[16]。過量的IL-6、TNF-α、TGF-β可導致內皮細胞凋亡,炎癥水平升高,NF-кB可影響血管內皮生長因子等多種信號通路的表達,導致血管細胞損傷及血管生成,促進DN的發生[17]。而在本研究中,DN組大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥相關因子的表達水平顯著上升,而腎康丸治療之后相關炎癥因子表達水平顯著下降,提示腎康丸可能通過調控IL-23/Th17炎癥軸,減少NF-кB等炎癥因子的表達,通過減輕DN患者的炎性反應,緩解疾病的發展進程。此外,DN組大鼠PCNA陽性面積的顯著升高,而腎康丸治療組可以顯著降低PCNA的陽性面積,提示腎康丸可以降低DN組細胞增殖的異常升高。

綜上所述,腎康丸可改善糖尿病腎臟損傷,其作用機制可能與抑制IL-23/Th-17炎癥通路,進而抑制IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥相關因子的表達以及腎小球細胞的異常增殖有關。腎康丸在細胞、分子水平對IL-23/Th-17炎癥通路的調控機制有待進一步深入探究。