山藥(Dioscorea opposita Thunb.)赤霉素合成酶基因 DoGA20ox1的克隆及功能研究

葛明然,張艷芳,邢麗南,趙令敏,張 勇,張曉蒙,劉小燕,霍秀文

(1.內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院/內蒙古自治區野生特有蔬菜種質資源與種質創新重點實驗室,呼和浩特 010019;2.巴彥淖爾市農牧業科學研究院,內蒙古古巴彥淖爾 015000;3.鄂爾多斯市農牧業科學研究院,內蒙古鄂爾多斯 017000)

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(DioscoreaL.),以塊莖為主要產品器官的單子葉植物[1]。是藥典佳品,滋補佳品[2],被譽為“中國小人參”。塊莖的生長發育是受多種因素調節的復雜過程,其中激素作為主要影響因素之一,在該過程中發揮重要作用。有研究表明,赤霉素影響著塊莖的形成[3-5]。

赤霉素(gibberellins,GAs)作為植物生長發育的主要激素之一,參與種子發芽[6]、莖的伸長[7]、果實的生長及品質形成[8]、植株生物量[9]、木質素的積累[10]、葉綠素的表達[11]等。赤霉素合成受內根-貝殼杉烯合成酶、GA-20氧化酶、GA-3氧化酶及 GA-2氧化酶等多個關鍵酶催化[12]。其中GA20ox是赤霉素生物合成中的關鍵酶,影響植物生長發育的復雜過程,內源赤霉素和外部環境因子對植物生長發育的調控均與GA20ox基因的表達水平有關[13],因此為探索該過程,分離和驗證基因功能是非常重要的。目前,已在芍藥[14]、葡萄[15]等植物中克隆獲得了編碼GA20ox的基因。

本研究以‘畢克齊’長山藥(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和長芋’山藥(D.oppositaThunb.;DHCY)為試驗材料,克隆山藥赤霉素合成酶基因DoGA20ox1(Unigene0027812,DoGA20ox1)的開放閱讀框(ORF)及其與cDNA對應的gDNA,對其進行生物信息學分析及基因結構分析;構建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1瞬時表達載體,對該基因進行亞細胞定位;分析DoGA20ox1在2個品種山藥塊莖不同發育時期及不同器官的表達模式差異;構建pPZP221-DoGA20ox1植物表達載體,轉化煙草。為初步解析GA20ox在山藥塊莖膨大過程中赤霉素合成的分子機理方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以內蒙古主栽品種‘畢克齊’山藥(D.oppositaThunb.;B1)和‘大和長芋’山藥(D.oppositaThunb.;DHCY)為試驗材料。于2020年5月初在內蒙古農業大學種質資源圃種植,取種植后90 d、105 d、120 d、135 d和150 d的山藥塊莖,3株混樣,3次生物學重復。將取好的幼莖、葉和塊莖立即液氮速凍,-80 ℃冰箱保存以備后續試驗。

1.2 山藥塊莖總RNA的提取及cDNA合成

參照王金鑫等[16]試驗方法,進行2個山藥品種不同發育時期塊莖、莖及葉的總RNA的提取(TaKaRa Mini Best Plant RNA Extraction Kit)及單鏈cDNA的反轉錄(TaKaRa ;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA SynthesisKit)。

1.3 DoGA20ox1的ORF的克隆

基于前期山藥轉錄組測序數據(2018年由廣州基迪奧生物科技公司測定),篩選赤霉素合成酶基因-GA20ox1(Unigene0027812)。通過Primer Premier 5.0設計GA20ox1的PCR擴增引物(表1)。反應體系及程序按照TaKaRa公司Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye說明書操作。取10 μL PCR產物進行電泳檢測,并將產物送至生工生物工程股份有限公司測序。

表1 DoGA20ox1相關的引物序列Table 1 Related primer sequences of DoGA20ox1

1.4 生物信息學分析

運用下列軟件對DoGA20ox1基因進行生物信息學分析(表2)。

表2 DoGA20ox1生物信息學分析相關軟件Table 2 Related software of DoGA20ox1 bioinformatics analysis

1.5 DoGA20ox1 gDNA的克隆

利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1),參照趙令敏[17]的試驗方法克隆DoGA20ox1的gDNA序列( Takala;Premix LaTaqTM),將測序結果與cDNA序列進行比對,分析基因結構。

1.6 DoGA20ox1的亞細胞定位

設計含有BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切位點的引物(表1),參照王金鑫等[16]的試驗方法,構建CaMV35S-GFP-DoGA20ox1載體。提取質粒,并通過凍融法轉化農桿菌LBA 4404,制備侵染液,注射煙草葉片,使用激光共聚焦顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)觀察煙草葉表皮細胞中GFP的表達情況。

1.7 DoGA20ox1的表達分析

以山藥的18S為內參基因,利用Primer Premier 5.0軟件設計DoGA20ox1qRT-PCR引物(表1),參照王金鑫等[16]的試驗方法(TaKaRa試劑盒;TB Green Premix Ex Taq Ⅱ)進行qRT-PCR分析。

1.8 DoGA20ox1植物表達載體的構建及轉基因煙草的獲得

設計含有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點的DoGA20ox1-ZF/ZR引物,參照邵盈[18]的試驗方法構建pPZP221-DoGA20ox1載體。提取質粒,并通過凍融法轉化農桿菌EHA 101,制備菌液,侵染煙草葉片。經共培養、選擇培養及生根培養后,采用PCR和RT-PCR方法分別檢測轉基因和野生型煙草葉片的DNA和RNA。

1.9 數據分析

用Excel 2007進行數據分析并制圖,采用SPSS 25.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 DoGA20ox1基因的克隆

以山藥塊莖cDNA為模板,GA20ox1-ORF-F/R為引物進行PCR擴增,獲得約1 400 bp的條帶(圖1),回收該克隆條帶,連接轉化后送測,經比對分析GA20ox1片段大小為1 359 bp,ORF長度為1 152 bp,共編碼383個氨基酸(圖2),將該基因命名為DoGA20ox1。

M. DL2000分子標記;1. DoGA20ox1 PCR產物M. DL2000 molecular marker; 1. DoGA20ox1 PCR product圖1 DoGA20ox1的ORF擴增Fig.1 DoGA20ox1 open reading frame amplification

圖2 山藥塊莖 DoGA20ox1的ORF序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence of yam tuber DoGA20ox1 and its deduced amino acid sequence

2.2 生物信息學分析

通過軟件分析,得到DoGA20ox1基因編碼蛋白的理論分子量為97.1 ku,分子式為C3490H5830N1152O1456S308,總原子數為12 236,理論等電點為5.01。對DoGA20ox1基因所編碼氨基酸組成分析得出,預測DoGA20ox1編碼的蛋白質為親水蛋白,膜外蛋白。該蛋白主要由無規則卷曲(42.82%),α螺旋(34.73%)延伸鏈 (16.45%),β轉角(6.01%)構成(圖3)。11個物種GA20ox氨基酸序列比對發現,山藥DoGA20ox1氨基酸序列與幾內亞薯蕷(XM_039265410.1)、石斛(XM_020838041.2)、木豆(XM_020349629.2)、木豆(XM_020349471.2)、赤豆(XM_017558479.1)、綠豆(XM_014656961.2)、碧桃(XM_007219460.2)、扁桃(XM_034346565.1)、睡蓮(XM_031637679.1)、綠豆(XM_014656962.2)序列相似性較高,分別為 93.81%、69.19%、 62.73%、62.72%、62.76%、61.93%、61.2%、 61.2%、59.26%、56.52%,且都具有20G-Fe (Ⅱ) oxygenase 保守結構域(圖4)。構建 DoGA20ox1蛋白的系統進化樹(圖5),結果表明,山藥與幾內亞薯蕷之間的親緣關系最為相近。

圖3 DoGA20ox1蛋白的二級結構預測Fig.3 Secondary structure prediction of DoGA20ox1 protein

圖5 DoGA20ox1及其同源序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of DoGA20ox1 and its homologous sequences

2.3 DoGA20ox1的蛋白相互作用網絡

利用STRING在線網站,分別以馬鈴薯StGA20ox1為模板構建山藥DoGA20ox1的相互作用網絡。結果顯示,GA20ox1與赤霉素合成的關鍵元件如GA2ox(GA2ox1、GA2ox5)、GA3ox(GA3ox1、GA3ox2)作用直接(圖6)。

圖6 DoGA20ox1的蛋白相互作用網絡Fig.6 Protein interaction network of DoGA20ox1

2.4 DoGA20ox1基因的gDNA克隆

以山藥塊莖DNA為模板,GA20ox1-ORF-F/R為引物,經PCR擴增,得到長度為1 499 bp的gDNA序列,其包含4個外顯子和3個內含子。4段外顯子長度分別為567、245、77、263 bp,3段內含子長度分別為132、105、110 bp(圖7)。

圖7 山藥 DoGA20ox1的cDNA和gDNA序列比對Fig.7 Comparison of cDNA and gDNA sequence of yam DoGA20ox1

2.5 DoGA20ox1的亞細胞定位

對重組質粒CaMV35S-GFP-DoGA20ox1進行PCR和雙酶鑒定,PCR(圖8-A)和雙酶切(圖8-B)均獲得與陽性對照大小相同的條帶,說明瞬時表達載體成功構建,可以進行下一步的亞細胞定位。

A.M1.DL5000 DNA標記;+.陽性對照;-.陰性對照;1.PCR;B.M2.DL15000 DNA標記;1.酶切鑒定;2.陽性對照;3.重組質粒A.M1.DL5000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1.PCR;B.M2.DL15 000 DNA marker; 1.Enzyme digestion identification;2.Positive control;3.Recombinant plasmid圖8 PCR和雙酶切法檢測瞬時表達載體CaMV35S- DoGA20ox1Fig.8 Detection of transient expression vector CAMV35S- DoGA20ox1 by PCR and double digestion

注射煙草葉片,2 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。發現GFP的熒光信號均勻分布于煙草細胞內,DoGA20ox1-GFP熒光信號在質膜中定位較強(圖9)。

圖9 DoGA20ox1的亞細胞定位Fig.9 Subcellular localization of DoGA20ox1

2.6 DoGA20ox1基因的表達分析

qRT-PCR結果表明,在2個品種中,DoGA20ox1的表達存在差異。B1的DoGA20ox1基因的表達量呈“升-降-升”的變化趨勢,在150 d時表達達到最高值;DHCY的DoGA20ox1基因的表達量與B1的變化趨勢一致,120 d時達到峰值(圖10-A)。DoGA20ox1基因的表達水平在山藥塊莖的膨大期,DHCY都顯著高于B1。

A.山藥塊莖膨大期 DoGA20ox1的表達量變化;B. DoGA20ox1在不同組織中的特異性表達A.Changes in DoGA20ox1 expression during yam tuber expansion;B.Specific expression of DoGA20ox1 in different tissues圖10 DoGA20ox1的表達分析Fig.10 Expression analysis of DoGA20ox1

DoGA20ox1基因在2品種山藥不同組織中相對表達量也存在差異。B1中莖的表達量最高,而DHCY中葉片的表達量最高。DoGA20ox1基因在B1莖中的表達量分別為葉和塊莖的2.31倍、29.76倍;在DHCY中,DoGA20ox1基因在葉中的表達量是莖和塊莖的2.08倍、31.86倍。DHCY葉、塊莖中的表達量明顯高于B1,為4.29倍、6.9倍。因此,DoGA20ox1基因在山藥中的表達具有特異性(圖10-B)。

2.7 DoGA20ox1植物表達載體的構建

為了進一步闡明DoGA20ox1的功能,將該基因構建到pPZP221-35S-NOS載體中。PCR(圖11-A)和雙酶切(圖11-B)檢測,結果表明成功構建pPZP221-DoGA20ox1植物表達載體。

A.M1.DL2000 DNA標記;+.陽性對照;-.陰性對照;1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA標記;1.陽性對照;2.重組質粒;3.酶切鑒定A.M1.DL2000 DNA marker;+.Positive control; -.Negative control; 1,2.PCR;B.M2.DL15000 DNA marker; 1.Positive control; 2.Recombinant plasmid; 3.Enzyme digestion identification圖11 DoGA20ox1植物表達載體的構建Fig.11 Construction of DoGA20ox1 plant expression vector

2.8 轉基因煙草的分子檢測

選取10個轉DoGA20ox1基因煙草植株,進行DNA提取及PCR檢測。結果顯示,10個轉DoGA20ox1基因煙草植株中,8個株系的擴增條帶均與陽性對照大小一致(圖12)。表明DoGA20ox1基因成功轉入到煙草的DNA中,且轉化率為80.0%。

M.DL2000 DNA標記;+.陽性對照;-.陰性對照;CK.野生型煙草;1～10.轉基因植株M.DL2000 DNA marker; +.Positive control; -.Negative control; CK.Wild-type tobacco; 1-10.Transgenic plant圖12 轉 DoGA20ox1基因煙草PCR檢測Fig.12 PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

從PCR檢測成功的8個轉基因株系中隨機提取5個植株(T-6、T-7、T-8、T-9和T-10)的RNA并進行RT-PCR檢測。結果顯示,5個植株的擴增條帶均與陽性對照大小一致(圖13),DoGA20ox1在轉錄水平成功表達。

M.DL2000 DNA標記;+.陽性對照;-.陰性對照;CK.野生型煙草;1～5.T-6、7、8、9、10轉基因株系M.DL2000 DNA Marker; +.positive control ; -.negative control; CK.Wild type tobacco; 1-5.T-6,7,8,9,10 transgenic lines圖13 轉 DoGA20ox1基因煙草的RT-PCR檢測Fig.13 RT-PCR of DoGA20ox1 gene in transgenic tobacco

3 討 論

GA20ox是赤霉素生物合成的關鍵調控酶,它將非生物活性的GA53和GA12氧化為生物活性的GA20和GA9,進而調節赤霉素的含量。該酶屬于20G-Fe (Ⅱ) oxygenase的雙加氧酶,是一個2-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶超家族保守結構域,2-酮戊二酸和Fe2+能與底物相互作用發生反應進而催化赤霉素生物合成過程中不同的羥基化和去飽和步驟[19]。GA20ox也是目前研究最多的限速酶,先后克隆了30多種植物的GA20ox基因序列[20],其中包括馬鈴薯[21]、萵苣[22]等根莖類植物。GA20ox氨基酸序列與其他物種的同源性一般在50%～60%;并且植物GA20ox蛋白在進化方面較為保守,與同科植物的蛋白同源關系較近[13]。本研究克隆山藥塊莖的DoGA20ox1基因,該基因編碼的氨基酸與幾內亞薯蕷具有較高的相似度,為93.81%;同時,該氨基酸序列包含20G-Fe (Ⅱ) oxygenase保守結構域,這與GA20ox屬于雙加氧酶相吻合。

蛋白質是生物功能的直接體現,因此對其進行亞細胞定位也是必不可少的環節之一。Wang等[23]克隆了碭山酥梨PbGA20ox2基因,氨基酸序列比對發現了2OG-Fell_Oxy保守結構域,該基因位于細胞質、細胞核和質膜中。姜志昂等[24]克隆的蘋果MdGA20ox1基因及閆蒙舉等[25]克隆的葡萄VvGA20ox1、VvGA20ox2基因均定位于細胞核和細胞質膜。本研究山藥DoGA20ox1基因亞細胞定位結果顯示,該基因定位于質膜。GA20ox的定位模式多樣,可能因品種而異,也可能由于發揮的功能不同。

每個基因轉錄產生的mRNA的量受到多種因素的調節,并且在植物發育的不同階段或不同的組織水平上有所不同。GA20ox基因在不同植物中有特異性表達,主要表達在嫩葉、種子、新芽、莖和花中。芍藥PlGA20ox基因在各器官中均有表達;其中芽的表達量最高,花瓣次之,根等表達量較低[14]。GA20ox1基因在草地早熟禾葉片中表達量最高,在根中表達量較低[25]。番荔枝AsGA20ox基因在種子、幼莖段表達量較高[26]。GA20ox基因表達還可能與內源赤霉素的生成量呈相關關系,從而促進塊莖類植物結塊[27]。敖蘭吉亞等[5]研究結果表明B1的GA3含量由塊莖膨大中期末至塊莖膨大盛期呈明顯下降趨勢,而DHCY的塊莖形成的時間,比B1早15 d左右。王金鑫等[16]測定B1和DHCY塊莖的赤霉素含量顯示,B1的赤霉素含量高于DHCY。本研究結果表明,DoGA20ox1的表達水平在B1和DHCY中存在差異,在山藥塊莖的膨大期,DHCY都顯著高于B1。由此表明,低濃度的赤霉素含量可能會促進塊莖形成,還有待進一步研究。本研究還構建了DoGA20ox1基因的過表達載體pPZP221-DoGA20ox1,可為后續探究DoGA20ox1基因在山藥塊莖發育中的功能奠定理論基礎。