木蘭脂素調控Fyn-STAT5通路治療變應性鼻炎*

張曉芳,劉慧娜

鄭州市骨科醫院,河南 鄭州 450052

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱為過敏性鼻炎,是指特應性個體在接觸變應原后出現的一種非感染性鼻部炎性疾病,主要有免疫球蛋白E介導包含組胺在內的介質釋放,且多種免疫活性細胞和細胞因子均有參與[1]。報道指出,AR可參與多種疾病發生,如結膜炎、腺樣體肥大、哮喘等,甚至可導致勞動力喪失,已成為全球性的健康問題[2]。氯雷他定是AR患者常用的抗組胺藥物,可控制過敏癥狀,減輕病情[3]。大量的現代研究與臨床實踐證明,中醫藥干預治療變應性鼻炎效果顯著[4-6],木蘭脂素是中藥材辛夷的提取物,在既往報道中證實有抗炎、抗過敏作用[7],但該藥物對AR是否有效尚需進一步探討。研究指出,鼻黏膜成纖維細胞主要參與特應性個體接觸變應原后的免疫反應[8],包括速發相反應和遲發相反應,出現相應炎癥反應病理表現,且組胺、白三烯、干細胞因子(stem cell factor,SCF)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等均可參與上述反應。另有報道顯示,致密物酪氨酸激酶(dense tyrosine kinase Fyn,Fyn)/信號轉導和轉錄激活因子5(signal transducers and activators of transduction 5,STAT5)通路可參與鼻黏膜成纖維細胞免疫活性的調節[9],介導多種細胞因子的合成與分泌,包括SCF、IL-10等,推測調控AR鼻黏膜成纖維細胞Fyn-STAT5信號通路可調節SCF、IL-10表達,控制特應性個體接觸變應原后的免疫反應,減輕鼻黏膜組織病理損傷。但木蘭脂素是否可通過調控Fyn-STAT5信號通路治療AR尚不明確。鑒于此,本研究特設計動物實驗探討上述問題,以期為AR臨床治療的新藥開發提供方向。

1 材料

1.1 實驗動物58只豚鼠,清潔級,雌雄各半,3月齡,體質量200～250 g,購自上海斯萊克實驗動物公司,生產許可證號:SCXK(滬)2019-0010,使用許可證號:SYXK(滬)2019-0046。飼養環境:通風、無噪聲、12 h光照/12 h黑暗,溫度15～28 ℃,濕度50%～60%。本研究經鄭州市骨科醫院實驗動物倫理委員會審批,審批號:ZZSGKYY20210415。

1.2 藥物與試劑卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)粉末、氫氧化鋁(美國Sigma公司,批號:A5253S、199974-1KG);卵清白蛋白溶液(2%濃度,北京百奧萊博科技有限公司,批號:GS4343);木蘭脂素(成都圣露藥業有限公司,經高效液相色譜法鑒定純度>98%,批號:BJR4713);氯雷他定[拜耳醫藥(上海)有限公司,批號:國藥準字H10970410,規格:10 mg];蘇木素-伊紅染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號:M161317);Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司,批號:R1030);逆轉錄試劑盒(美國Gene Copoeia公司,批號:K20511);引物序列委托中國上海生工生物工程技術服務有限公司合成;蛋白提取試劑盒(美國Bio-Rad公司,批號:P1259178);兔抗鼠Fyn、STAT5、SCF、IL-10單克隆抗體,山羊抗兔Fyn、STAT5、SCF、IL-10多克隆抗體(美國Maxim生物技術公司,批號:M20135、M20196、M20823、M20266、M20239、M20288、M21145、M21152)。

1.3 儀器CX41型光學顯微鏡、CKX 53型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);UC7型組織切片機(德國Leica公司);7300型PCR儀(美國ABI公司);E8015-C1型轉膜儀、PowerPac Basic型電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組、建模與干預將58只豚鼠采用隨機數字表法分為建模組(n=50)、空白組(n=8)。建模組采用OVA抗原混懸液全身及局部攻擊建立AR模型[10],具體如下:卵清蛋白粉末0.3 mg+氫氧化鋁30 mg溶于1 mL生理鹽水中制成混懸液作為基礎致敏制劑,每隔1天進行腹腔注射,每次 1 mL,共4次。末次基礎致敏次日改為局部攻擊致敏,取2%卵清白蛋白溶液攻擊雙側鼻腔,每側 50 μL,每天1次,共7次。空白組僅予以等量生理鹽水和雙側鼻腔攻擊。干預后觀察豚鼠30 min內鼻部癥狀,包括抓鼻、流涕、噴嚏,并分別進行計分,其中輕度計1分、中度計2分、重度計3分,各癥狀總分≥5分則認為建模成功。將建模成功的48只豚鼠隨機分為模型組8只、氯雷他定組10只、木蘭脂素低劑量組10只、木蘭脂素中劑量組10只、木蘭脂素高劑量組10只。木蘭脂素低、中、高劑量組大鼠分別予以20 mg·kg-1、40 mg·kg-1、80 mg·kg-1的木蘭脂素溶液灌胃,氯雷他定組大鼠予以1.05 mg·kg-1氯雷他定溶液灌胃,模型組和空白組僅予以等體積生理鹽水灌胃,灌胃體積為10 mL·kg-1,每天1次,連續7 d。

2.2 鼻黏膜組織病理變化觀察干預完成后取各組豚鼠部分鼻黏膜組織,固定,系列濃度酒精脫水,包埋,切片(層厚4 μm),HE染色,封片,光鏡下觀察鼻黏膜組織疾理變化。

2.3 鼻黏膜成纖維細胞分離并鑒定干預完成后,取各組豚鼠部分鼻黏膜組織,剪碎后消化,每1 h收集1次上清液并更換新的膠原酶溶液,重復4次。將收集的上清液經細胞篩(200目)過濾,1 000 r·min-1離心5 min,以含10%FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養液重懸,并接種至25 cm3細胞培養瓶。細胞培養后除去雜質和細胞碎片,進行傳代培養,取第3代細胞于倒置相差顯微鏡下觀察鑒定,并以免疫細胞化學法檢測大鼠波形蛋白表達。

2.4 鼻黏膜成纖維細胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10mRNA表達檢測參照文獻[11],采用25 μg·L-1TGF-β1處理各組經過鑒定的鼻黏膜成纖維細胞,以5×104mL-1濃度接種于96孔板中,培養72 h。采用試劑盒抽提總RNA,并測定其濃度,逆轉錄為cDNA。采用Primer 6.0軟件設計引物序列,引物信息見表1。配置PCR反應體系,共20μL。采用PCR儀進行擴增,步驟如下:50 ℃反應2 min,40個循環:95 ℃反應2 min、95 ℃反應30 s、60 ℃反應30 s,最后54 ℃反應5 min。根據內參基因和各目基因的Ct值計算目的基因相對表達量,公式:2-△△Ct。

表1 引物信息

△△Ct=(實驗樣品目的基因Ct-內參基因Ct)-(對照樣品目的基因Ct-內參基因Ct)

2.5 鼻黏膜成纖維細胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表達水平檢測細胞增殖、培養和接種操作均同上。提取總蛋白,加上樣緩沖液并進行沸水浴使其變性,測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE電泳凝膠,轉膜后封閉。加入一抗(稀釋比例均1500),4 ℃ 搖床孵育過夜;加入二抗(稀釋比例均為12 000),室溫孵育1～2 h。ECL顯色,顯影成像。采用Image Lab 4.0軟件分析蛋白條帶,計算目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 各組豚鼠干預前后鼻部癥狀評分比較氯雷他定組、木蘭脂素高劑量組在給藥期間各有1只豚鼠灌胃時穿破食管致死。最終氯雷他定組及木蘭脂素高劑量組的樣本量均為9只。

與干預前相比,干預后模型組豚鼠鼻部癥狀評分升高,氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組豚鼠鼻部癥狀評分均下降;且干預后氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組豚鼠鼻部癥狀評分均低于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組豚鼠干預前后鼻部癥狀評分比較 分)

3.2 各組豚鼠鼻黏膜組織病理改變空白組豚鼠鼻黏膜上皮組織及黏膜下組織和腺體結構整齊,未見充血、增生及炎性改變;模型組豚鼠鼻黏膜可見大量上皮組織脫落和壞死,上皮組織下有大量炎性細胞浸潤,黏膜下腺體數量增多,有嚴重擴張,小血管有嚴重充血;木蘭脂素低劑量組鼻黏膜可見部分上皮組織脫落和壞死,上皮組織下有明顯炎性細胞浸潤,黏膜下腺體數量增加,有腺體擴張,小血管有充血;木蘭脂素中劑量組和氯雷他定組鼻黏膜可見少部分上皮組織脫落和壞死,上皮組織下有炎性細胞浸潤,黏膜下腺體數量增加,腺體擴張;木蘭脂素高劑量組鼻黏膜可見輕微上皮組織脫落和壞死,上皮組織下有輕微炎性細胞浸潤,黏膜下腺體數量少量增加并擴張。見圖1。

3.3 各組豚鼠鼻黏膜成纖維細胞病理改變倒置相差顯微鏡下可見空白組細胞形態均勻,多呈長梭形,均勻分布,且呈放射狀或魚群狀排列;模型組、氯雷他定組、木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組成纖維細胞形態與空白組基本一致,但形態稍有改變,梭形長度變短且排列稍有雜亂。免疫細胞化學法檢測顯示各組細胞中波形蛋白均呈強陽性表達,且定位于細胞胞漿。見圖2—圖3。

注:A:空白組;B:模型組;C:氯雷他定組;D:木蘭脂素低劑量組;E:木蘭脂素中劑量組;F:木蘭脂素高劑量組

注:A:空白組;B:模型組;C:氯雷他定組;D:木蘭脂素低劑量組;E:木蘭脂素中劑量組;F:木蘭脂素高劑量組

3.4 各組鼻黏膜成纖維細胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10mRNA表達水平比較模型組FynmRNA、SCFmRNA表達水平均高于空白組,氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組FynmRNA、SCFmRNA均低于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05);模型組STAT5mRNA、IL-10mRNA表達水平均低于空白組,氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組STAT5mRNA、IL-10mRNA表達水平均高于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組鼻黏膜成纖維細胞Fyn mRNA、STAT5 mRNA、SCF mRNA、IL-10 mRNA表達水平比較

3.5 各組鼻黏膜成纖維細胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表達水平比較模型組Fyn、SCF蛋白表達水平均高于空白組,氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組Fyn、SCF蛋白表達水平均低于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05);模型組STAT5、IL-10蛋白表達水平均低于空白組,氯雷他定組和木蘭脂素低劑量組、木蘭脂素中劑量組、木蘭脂素高劑量組STAT5、IL-10蛋白表達水平均高于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖4。

注:BC組:空白組;M組:模型組;LO組:氯雷他定組;MOL組:木蘭脂素低劑量組;MOM組:木蘭脂素中劑量組;MOH組:木蘭脂素高劑量組

表4 各組鼻黏膜成纖維細胞Fyn、STAT5、SCF、IL-10蛋白表達水平比較

4 討論

遺傳和環境因素均可參與AR的發病,目前已發現有多個基因及轉錄因子參與本病的發生[12],表觀遺傳學研究發現,環境的改變可通過遺傳學機制致病,導致呼吸道黏膜免疫系統先天性及獲得性免疫紊亂[13],誘導成纖維細胞等分泌免疫活性因子,增加個體對AR的易感性。目前,臨床上常用的AR治療藥物雖有一定效果,但可能由于作用靶點單一、對局部免疫調控作用并不理想等原因,其臨床效果常難以令人滿意[14]。而挖掘新的、高效的AR治療藥物仍是目前該領域研究的重點。

基礎致敏和局部攻擊致敏是目前常用的AR建模方法,可誘導機體鼻黏膜產生特異性免疫球蛋白E抗體,增加機體AR的易感性,本研究采用該方法對豚鼠建立AR模型,建模成功率高達96.00%,與既往報道一致[15]。AR患者常見臨床表現有鼻癢、流涕、噴嚏等,控制上述臨床表現應當作為此類患者治療的首要任務。本研究中,氯雷他定和木蘭脂素各劑量干預后抓鼻、流涕、噴嚏癥狀評分及總分均下降,且低于模型組,可知氯雷他定與木蘭脂素可有效減輕AR相關癥狀,且高劑量木蘭脂素效果最佳。氯雷他定屬于第二代抗組胺藥物,也是目前臨床上一線抗敏藥,高效持久,可快速阻斷體內過敏反應,但仍有部分AR患者采用氯雷他定治療后效果不佳。木蘭脂素是由辛夷提取并精制而成的藥物,具有消炎、止癢、抗敏作用。根據中醫學理論,AR屬于“鼻鼽”范疇,與肺脾氣虛關系密切。肺氣虛弱,衛表不固,則腠理疏松,風寒乘虛而入,上及鼻竅,正邪相搏,肺氣不得通調,津液不通,聚于鼻竅,擁塞氣阻,可致噴嚏流涕;脾氣虛弱,生化無源,累及肺臟,肺氣甚虛,則鼻竅不通,外邪從口鼻侵入,停聚鼻竅。因此鼻鼽治療應以健脾養肺、通竅利竅為原則。辛夷性溫、味辛、芳香,歸肺經、胃經,可散風寒、通鼻竅,既可祛除體內、體表之寒氣,又可發散風邪、通利鼻竅,善治外感風寒、肺竅郁閉之癥。現代中醫學家認為辛夷可利九竅[16],也有藥理研究證實木蘭脂素可顯著抑制致敏豚鼠離體回腸收縮,還可組織肥大細胞脫顆粒,增加毛細血管的通透性[17-19],認為該藥物屬于一種天然的高效抗敏劑。本研究還發現,氯雷他定組和木蘭脂素各劑量組鼻黏膜組織病理改變均減輕,且木蘭脂素高劑量組與空白組最為接近,表明木蘭脂素可減輕AR豚鼠的鼻黏膜組織病理改變,也證實該藥物具有良好的抗過敏作用。

特異性個體再次接觸變應原后可產生免疫反應,導致炎癥性病理改變,包括速發相反應和遲發相反應,前者多發生于變應原接觸5～10min后,約持續0.5～2 h,后者發生于變應原接觸4～8 h后,約持續24～48 h。在免疫反應過程中,T淋巴細胞、肥大細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等均有參與,可促使遞質釋放和細胞因子產生,其中成纖維細胞可參與速發相反應和遲發相反應,是免疫反應過程中不可或缺的因素[20]。Fyn-STAT5通路是免疫球蛋白E介導的與肥大細胞活化相關的變態反應的重要途徑,其中Fyn屬于細胞內非受體型酪氨酸激酶,可正向調節肥大細胞脫顆粒;STAT5屬于STAT家族的重要組成部分,在肥大細胞發展和生存過程中有關鍵性作用,還可介導肥大細胞激活變態反應[21-22]。SCF和IL-10均為Fyn-STAT5通路的重要調控因子,且在變應性疾病發生和發展過程中均有重要作用,其中SCF可調節造血細胞和免疫細胞生成,IL-10則可調節炎性反應,發揮負向免疫調節作用;還可減少T細胞應答,增強B細胞功能[23-24]。有報道指出[25],AR建模成功后,鼻黏膜成纖維細胞中Fyn、SCF基因與蛋白表達水平均較正常健康豚鼠升高,而STAT5、IL-10基因與蛋白表達水平均下降,因此在AR治療時可嘗試調控Fyn-STAT5通路,抑制Fyn、SCF基因與蛋白表達、上調STAT5、IL-10基因與蛋白表達發揮治療免疫調控作用。本研究中,模型組Fyn、SCFmRNA及蛋白表達水平均較空白組升高,而氯雷他定組和木蘭脂素組Fyn、SCFmRNA及蛋白表達水平均較模型組下降,且STAT5、IL-10mRNA與蛋白表達變化趨勢則正相反,本研究報道和上述報道相符,表明氯雷他定和木蘭脂素均可調控AR豚鼠鼻黏膜成纖維細胞Fyn-STAT5通路,抑制Fyn、SCF表達,上調STAT5、IL-10表達,且木蘭脂素的作用呈劑量依賴性。

綜上所述,木蘭脂素可減輕AR豚鼠鼻部癥狀和鼻黏膜組織病理改變,推測是通過調控鼻黏膜成纖維細胞Fyn-STAT5通路,調節鼻黏膜組織的免疫活性實現的。但木蘭脂素治療AR患者的可行性及安全性仍需進一步探討。