基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討柴胡桂枝湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

李俊輝,王琳,王芳

1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院,河南省骨科醫(yī)院,河南 鄭州 450016; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的自身免疫性疾病,以血管翳和滑膜炎為主要病理改變,導(dǎo)致軟骨破壞和關(guān)節(jié)變性,早期會(huì)出現(xiàn)全身多關(guān)節(jié)對(duì)稱性疼痛、腫脹、僵硬[1]。除關(guān)節(jié)病變外,還可損害關(guān)節(jié)外多器官,包括心、腎、肺、消化系統(tǒng)、眼睛、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)等[2-3]。RA患者發(fā)生嚴(yán)重感染、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、死亡的風(fēng)險(xiǎn)高于普通人群,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,給社會(huì)發(fā)展帶來了沉重負(fù)擔(dān)[4]。

中醫(yī)藥是中國(guó)傳統(tǒng)文化之瑰寶,源遠(yuǎn)流長(zhǎng),在認(rèn)識(shí)及治療本病上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)代研究也表明,中醫(yī)藥可抑制炎癥,緩解RA癥狀,延緩關(guān)節(jié)骨損害進(jìn)展[5-6]。柴胡桂枝湯出自張仲景《傷寒論》,顧名思義,該方是小柴胡湯及桂枝湯的合方,包含桂枝、柴胡、黃芩、芍藥、人參、甘草、半夏、大棗及生姜九味中藥,具有溫通經(jīng)脈、和解表里、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之功效。本方疏通三焦,太陽(yáng)、少陽(yáng)經(jīng)同治,調(diào)達(dá)全身氣機(jī),氣血正常運(yùn)行則痹痛自除,對(duì)于RA的治療有確切的療效[7]。

但柴胡桂枝湯治療RA的作用機(jī)制尚未明確,中醫(yī)藥認(rèn)識(shí)疾病的整體觀念及辨證論治理念與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原則一致[8-9],網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)藥物與疾病之間的關(guān)系,探討中醫(yī)治療疾病“多靶點(diǎn)、多成分、多途徑”的機(jī)制[10]。因此,本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法為基礎(chǔ)對(duì)柴胡桂枝湯治療RA的有效成分、核心靶標(biāo)及相關(guān)通路進(jìn)行闡述,確定潛在的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)及新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 柴胡桂枝湯中藥物有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)并檢索柴胡桂枝湯中包含的中藥成分(柴胡、桂枝、黃芩、人參、半夏、芍藥、大棗、甘草、生姜),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB,OB≥30%)和類藥性(drug like,DL,DL≥0.18)為篩選條件收集符合條件的活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),使用perl腳本運(yùn)行處理藥物有效成分與分子靶標(biāo),篩選有效靶標(biāo)信息,并與Universal Protein數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中經(jīng)過“Reviewed”“Humam”過濾得到的有效信息比對(duì)、整理為藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)化后的基因symbol信息。

1.2 RA相關(guān)靶點(diǎn)的獲取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索關(guān)鍵詞“Rheumatoid arthritis”,其中,Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)選擇“relevance scores”大于10的基因靶點(diǎn),與其他四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)取交集,從而得出RA相關(guān)的疾病靶點(diǎn),使用R語言venn程序包將得到的疾病相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,獲得交集基因的數(shù)目,并將所得疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)合并、去重,得到最終的疾病靶點(diǎn)集。

1.3 柴胡桂枝湯-RA交集靶點(diǎn)的篩選使用venn程序包將中藥與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集,獲得柴胡桂枝湯藥物有效成分中直接與疾病有關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 Cytoscape交互網(wǎng)絡(luò)文件準(zhǔn)備使用perl腳本分析比對(duì),將整理為藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)化形成的symbol信息與疾病基因靶點(diǎn)整理為“Network”“Type”文件進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析將1.4中“Network”“Type”文件導(dǎo)入Cytoscape V3.8.0中對(duì)其進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),并通過節(jié)點(diǎn)度值(degree)篩選其關(guān)鍵有效成分。

1.6 蛋白之間相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鼋柚鶶TRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入,選定物種為“Homo Sapiens”進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,交互得分閾值設(shè)定為0.9,并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn),將TSV數(shù)據(jù)格式文件導(dǎo)出并利用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)集中性分析和評(píng)估,根據(jù)其網(wǎng)絡(luò)中心度進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選得到核心靶點(diǎn)。

1.7 基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析首先,安裝R語言BiocManager程序包,利用library(org.Hs.eg.db)進(jìn)行Symbol轉(zhuǎn)為EntrezIDs的轉(zhuǎn)換,然后安裝R語言DOSE、clusterProfiler等相關(guān)程序包,對(duì)靶點(diǎn)交集基因ID進(jìn)行GO富集與KEGG富集分析。GO富集分析包括顯著富集生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF),并將前10項(xiàng)繪制成柱狀圖。KEGG富集分析繪制的氣泡圖包括顯著富集前的30條通路,據(jù)此推斷出柴胡桂枝湯作用于RA的潛在機(jī)制。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證通過PubChem搜索小分子配體結(jié)構(gòu)2D文件,導(dǎo)入Chem3D軟件生成3D優(yōu)化結(jié)構(gòu),并保存為mol2格式文件,于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)得到大分子蛋白結(jié)構(gòu),經(jīng)PyMOL去除水分子和小分子配體并保存PDB格式文件,在AutoDock軟件中將大分子文件加氫處理,導(dǎo)出pdbqt文件,設(shè)置合適空間對(duì)接Box進(jìn)行分析,導(dǎo)入pdbqt于OpenBabel軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式,通過PyMOL軟件導(dǎo)入文件,進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 柴胡桂枝湯有效活性成分及作用靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)藥物OB與DL值篩選,得到柴胡桂枝湯的有效成分共 263 個(gè),結(jié)合分子靶標(biāo)共14 297個(gè),將有效活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,然后選擇“Reviewed”“Human”,得到下載標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)名。進(jìn)行匹配、刪除重復(fù)值后獲得靶點(diǎn)3 918個(gè),柴胡桂枝湯靶點(diǎn)信息概況見表1。

表1 柴胡桂枝湯成分、靶點(diǎn)及數(shù)據(jù)庫(kù)匹配結(jié)果

2.2 疾病靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)獲取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“gastroesophageal reflux disease”,其中,Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)選擇“relevance scores”大于10的基因靶點(diǎn),去除重復(fù)項(xiàng)目后共獲得關(guān)于RA的靶點(diǎn)373個(gè),繪制韋恩圖。將得到的263個(gè)藥物活性成分與3 973個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集,取交集后獲得169個(gè)靶點(diǎn),即為柴胡桂枝湯治療RA的潛在作用靶點(diǎn),并繪制韋恩圖,見圖1。

注:A:疾病靶點(diǎn)圖;B:潛在作用靶點(diǎn)圖

圖2 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 構(gòu)建中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape V3.8.0軟件將柴胡桂枝湯中的化合物構(gòu)建出柴胡桂枝湯的中藥-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),選取degree較前的20個(gè)關(guān)鍵化合物與靶點(diǎn)作圖,如圖 2 所示。由結(jié)果推測(cè),柴胡桂枝湯通過多種化學(xué)成分干預(yù)多個(gè)靶點(diǎn)治療RA。柴胡桂枝湯中作用于RA的主要化學(xué)成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、黃芩素(baicalein)、甘草查爾酮A(licochalcone A)等degree較大,且與多靶點(diǎn)連接,說明其在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,且 degree 排名前20的關(guān)鍵化合物中14個(gè)都獨(dú)立來自甘草。倒置菱形為177個(gè)靶點(diǎn)基因,外側(cè)圓圈以及顏色代表不同中藥在化合物成分中占比,圖中深灰色為生姜,粉色為大棗,淺藍(lán)色為柴胡,深紅色為甘草,綠色為黃芩,黃色為芍藥,深藍(lán)色為人參,紫色為半夏,淺綠色為桂枝。

2.4 構(gòu)建 PPI 模型圖將藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)平臺(tái)獲得PPI模型,圖中共有189個(gè)節(jié)點(diǎn),2 985條邊,每個(gè)節(jié)點(diǎn)連起來的邊代表共同基因之間的關(guān)聯(lián)度,關(guān)聯(lián)程度高低與邊的粗細(xì)成正比,節(jié)點(diǎn)為具體的共同基因,見圖3。

圖3 柴胡桂枝湯治療RA潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 柴胡桂枝湯與RA相互作用核心靶基因從STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)導(dǎo)出的TSV格式文件,導(dǎo)入到CytoScape V3.8.0,用Tools工具分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?用CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)集中性分析和評(píng)估,以進(jìn)一步分析PPI模型的核心靶基因。根據(jù)介度中心性、接近中心性、程度中心性、特征向量中心性、局部邊連通性和網(wǎng)絡(luò)中心性等相關(guān)指標(biāo)對(duì)基因進(jìn)行篩選,后續(xù)分析大于所有指標(biāo)中位數(shù)的基因,經(jīng)過篩選后,最后獲得核心基因分別是MYC、MAPK14、HIF1A、AKT1、CDKN1A、ESR1、STAT1、RELA、MAPK1、FOS、EGFR、CCND1、TP53、STAT3、MAPK3,見圖4。

注:初步構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)兩次篩選后的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.6 GO與KEGG富集分析安裝R語言程序包,將交集基因Symbol轉(zhuǎn)為EntrezIDs格式,設(shè)置P值和矯正后的P值≤0.05為過濾條件,并去除基因id為NA的基因,將柴胡桂枝湯作用于RA的169個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,結(jié)果得到對(duì)外來反應(yīng)的刺激(response to xenobiotic stimulus)、膜筏(membrane raft)、脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)等2 468個(gè)生物過程、82種細(xì)胞組分和203種分子功能。選取BP、CC、MF排名前10的GO條目繪制氣泡圖。KEGG通路富集分析最終得到179條通路,選取KEGG前30的條目繪制柱狀圖,包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化學(xué)致癌的受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等關(guān)鍵通路,見圖5。

圖5 GO富集分析氣泡圖(左)和KEGG通路分析柱形圖(右)

2.7 分子對(duì)接分析及可視化結(jié)果選取PPI網(wǎng)絡(luò)中degree排名前4的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)的親和力和構(gòu)象的穩(wěn)定性程度以對(duì)接分?jǐn)?shù)表現(xiàn),結(jié)合能的數(shù)值越低,則兩者的結(jié)合能力越強(qiáng),具體結(jié)果見表2。分子對(duì)接結(jié)果表明,ESR1與naringenin、RELA與baicalein、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)14和黃芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)的結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1,分別為-5.6 kcal·mol-1、-5.76 kcal·mol-1和-6.3 kcal·mol-1、-5.36 kcal·mol-1、-6.47 kcal·mol-1,說明基因與柴胡桂枝湯中的有效成分有著良好的結(jié)合力。利用PyMOL軟件將分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,MAPK14與槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素的3D分子對(duì)接可視化結(jié)果見圖6。

注:A:MAPK14與槲皮素;B:MAPK14與山柰酚;C:MAPK14與漢黃芩素;D:MAPK14與柚皮素;E:MAPK14與黃芩素

表2 柴胡桂枝湯治療RA中“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中與其存在作用關(guān)系的化合物結(jié)合能

3 討論

目前,RA影響全球約0.5%～1.0%的人口[11],針對(duì)此病的藥物治療一般為非甾體抗炎藥、傳統(tǒng)風(fēng)濕抗炎藥(DMARDs)及生物制劑,但應(yīng)用這些也有一定的不良反應(yīng),研究表明,非甾體抗炎藥對(duì)胃腸道有較強(qiáng)的刺激,發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也大大增加[12-13]。

本病屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,因其病情復(fù)雜,病程長(zhǎng),后代醫(yī)家也稱其為“頑痹”“尪痹”[14]。柴胡桂枝湯主治“支節(jié)煩疼”,此與痹證表現(xiàn)一致[15],該方氣血同治,調(diào)和營(yíng)衛(wèi),固衛(wèi)腠理,散風(fēng)、寒、濕諸邪,扶養(yǎng)自身正氣,正強(qiáng)邪去則痹痛自除[16]。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為方法探討柴胡桂枝湯治療RA的作用機(jī)制,構(gòu)建的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖提示,柴胡桂枝湯作用于RA可能是通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等核心活性成分為物質(zhì)基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的。槲皮素是一種天然類黃酮,已經(jīng)廣泛應(yīng)用治療自身免疫性疾病,發(fā)揮抗感染、抗氧化作用[17]。相關(guān)研究表明,槲皮素通過抑制中性粒細(xì)胞活性,促進(jìn)其凋亡,降低體內(nèi)炎癥細(xì)胞的水平,從而改善RA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)[18]。山柰酚對(duì)FLS的增殖和遷移至關(guān)重要[19],通過阻斷MAPK途徑的活化來抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎FLS的遷移和侵襲,減少炎癥反應(yīng),延緩關(guān)節(jié)軟骨的破壞[20]。漢黃芩素通過靶向作用NF-κB/MAPK信號(hào)通路,改善氧化應(yīng)激標(biāo)志物,從而減緩RA關(guān)節(jié)炎癥[21]。有研究提示,柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A均可減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜損傷,抑制RA發(fā)展[22-24]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析和兩次篩選,最終我們得到MAPK14、HIF1A、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、STAT3、MAPK3等15個(gè)核心作用靶點(diǎn)。腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6是參與控制RA免疫反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子,與炎癥反應(yīng)和激活破骨細(xì)胞活性密切相關(guān)[25]。MAPK14、MAPK1、MAPK3均屬于MAPK家族,可以調(diào)節(jié)這些促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,在細(xì)胞增殖、存活、凋亡和侵襲方面起著關(guān)鍵作用[26]。研究表明,RELA可以直接介導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化,還可通過miR-30a作為前饋方式間接介導(dǎo)NLRP3的表達(dá),經(jīng)ReLA/MicroRNA-30a/NLRP3信號(hào)軸影響巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性小體表達(dá),從而參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[27]。ESR1是介導(dǎo)雌激素發(fā)揮生物學(xué)作用的分子,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,miR-203負(fù)調(diào)控雌激素受體α,從而導(dǎo)致大鼠關(guān)節(jié)細(xì)胞炎癥聚集和加劇關(guān)節(jié)軟骨破壞[28]。許多研究提示,與男性RA患者相比,女性RA患者的預(yù)后較差,ESR1基因與關(guān)節(jié)軟骨調(diào)控密切相關(guān),其會(huì)增加RA患者發(fā)生關(guān)節(jié)骨破壞的風(fēng)險(xiǎn)[29]。

筆者借助KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),柴胡桂枝湯治療RA的主要通路包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號(hào)通路、化學(xué)致癌的受體激活、AGE-RAGE信號(hào)通路等通路。PI3K-Akt通路是參與多種細(xì)胞過程的最重要通路之一,可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝,參與生長(zhǎng)因子及多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)[30]。該通路受PTEN、SHIP、TNF-α、TGF-β、TRAI等因子調(diào)控,控制RA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖與凋亡的平衡狀態(tài)[31]。研究表明,抑制 PI3K-Akt信號(hào)通路的表達(dá)可降低關(guān)節(jié)炎癥水平,抑制破骨細(xì)胞分化,起到治療RA骨破壞的效果,同時(shí)該信號(hào)通路與FLS滑膜細(xì)胞的增殖與遷移密切相關(guān)[32-33]。晚期糖基化終產(chǎn)物與關(guān)節(jié)炎、阿茲海默癥、糖尿病等疾病的進(jìn)展密切相關(guān),其可與AGE受體相互作用,介導(dǎo)NF-κB活化,誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體釋放,進(jìn)而引起組織炎癥損傷[34]。分子對(duì)接結(jié)果表明,藥物有效成分均可與核心靶點(diǎn)進(jìn)行自發(fā)結(jié)合,其中,ESR1與柚皮素、RELA與槲皮素、AKT1與漢黃芩素、MAPK14與每個(gè)核心活性成分均以較高結(jié)合能結(jié)合,顯示出良好的穩(wěn)定性,提示ESR1、RELA、MAPK14、AKT1可能是柴胡桂枝湯治療RA的核心靶點(diǎn)。

綜上所述,柴胡桂枝湯治療RA具有多靶點(diǎn)、多成分、多通路的特點(diǎn),其可能通過槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素等核心活性成分作用于MAPK14、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、MAPK3等核心靶點(diǎn),調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等通路調(diào)節(jié)免疫,減輕炎癥反應(yīng),緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛,為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但本研究?jī)H限于采用分子對(duì)接形式進(jìn)行理論驗(yàn)證,有待進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。