鱭屬魚類耳石形態(tài)學(xué)比較與短頜鱭物種有效性分析

楊凡，劉明智，欒會(huì)妮，廖傳松，王佳成，馮廣朋，蔣日進(jìn)，徐漢祥

(1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東榮成 264300；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢 430072；4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

生物體的形態(tài)特征在不同環(huán)境下表現(xiàn)不同，這通常是生物體對(duì)生活環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果[1]。目前，有關(guān)生物體形態(tài)學(xué)的差異性與環(huán)境的相互關(guān)系已然成為生物學(xué)界研究的熱點(diǎn)話題之一[2-3]。對(duì)水生動(dòng)物而言，耳石形態(tài)常用于不同種群間的比較研究，如東太平洋不同海區(qū)莖柔魚Dosidicus gigas耳石形態(tài)及生長(zhǎng)研究[4]，嘉陵江不同流域蛇鮈Saurogobio dabryi耳石形態(tài)特征及差異等[5]。這些研究都在嘗試解釋耳石形態(tài)與環(huán)境相互適應(yīng)的關(guān)系。魚類耳石形態(tài)特征通常取決于多種因素，如遺傳、環(huán)境因素等。在特定的水域環(huán)境條件下，同一種魚類耳石形態(tài)特征因其相同的環(huán)境條件和生境履歷特征而表現(xiàn)出較高的同質(zhì)性[6]，而在不同水域環(huán)境，為了更好地適應(yīng)不同水溫、水流速度等環(huán)境因素其耳石形態(tài)則會(huì)表現(xiàn)出異質(zhì)性[5]。

耳石作為一種硬骨魚類最早鈣化的組織，記錄著魚類的年齡以及生活環(huán)境等相關(guān)信息，常用來(lái)鑒定魚類年齡[7]和重塑魚類生活史[8]等。近些年來(lái)，如許氏平鲉Sebastes schlegelii、弧帶鸚嘴魚Scarus dimidiatus耳石形態(tài)特征被國(guó)內(nèi)外學(xué)者用作群體劃分的依據(jù)[9-10]。通常認(rèn)為，在群體識(shí)別與劃分研究中，相較于星耳石和微耳石，矢耳石更適合[11]。目前常用于表征耳石形態(tài)的參數(shù)主要有2 種：耳石尺寸參數(shù)和耳石形狀指標(biāo)，前者通常是對(duì)耳石進(jìn)行幾何測(cè)量如：長(zhǎng)、寬、周長(zhǎng)、面積和質(zhì)量等；后者是通過(guò)耳石大小變量經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換來(lái)表征耳石形狀的某一方面信息，如形態(tài)因子，矩形趨近率、面密度等。尺寸參數(shù)與形狀指標(biāo)的結(jié)合能更好地表征不同種類的耳石特征，從而能更好地劃分不同群體。

近些年來(lái)，耳石形態(tài)在長(zhǎng)江中下游、長(zhǎng)江口以及鄰近海域鱭屬魚類如刀鱭Coilia nasus、短頜鱭C.brachygnathus和湖鱭C.ectenestaihuensis的研究中已取得一定的進(jìn)展。這些研究通常采用框架法和地標(biāo)點(diǎn)法的手段對(duì)不同魚類的耳石形態(tài)特征進(jìn)行比較[12-13]，這些分析方法易受人為因素影響，無(wú)法準(zhǔn)確全面地反映耳石形態(tài)的真實(shí)情況，但耳石的尺寸參數(shù)與形狀指標(biāo)可以較好地反映耳石形態(tài)特征，此外根據(jù)耳石尺寸參數(shù)和形狀指標(biāo)進(jìn)行差異系數(shù)檢驗(yàn)、均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)等一系列分析可以有效地識(shí)別物種有效性，鑒別近緣種。這在湖鱭物種有效性等方面已經(jīng)有一定研究[14]，但是對(duì)于爭(zhēng)議較大的短頜鱭物種有效性卻未見報(bào)道。為此，本研究以楠溪江、甌江、香溪河水域的3 種鱭屬魚類：刀鱭、鳳鱭C.mystus和短頜鱭為研究對(duì)象，利用耳石尺寸參數(shù)和形狀指標(biāo)劃分不同群體。一方面以期能更好地表征耳石形態(tài)，為鱭屬魚類的群體劃分提供科學(xué)的參考，另一方面豐富不同流域鱭屬魚類耳石形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，為更好地區(qū)分和保護(hù)不同區(qū)域鱭屬魚類提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究共采集98 尾鱭屬魚類。其中刀鱭32 尾，來(lái)自永嘉楠溪江；鳳鱭31 尾，來(lái)自溫州甌江；短頜鱭35 尾，來(lái)自秭歸香溪河。具體信息如表1 所示。樣本經(jīng)過(guò)冷凍保存后，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定(體長(zhǎng)、體質(zhì)量)。

表1 刀鱭、鳳鱭和短頜鱭的采樣信息Tab.1 Sampling information for C.nasus, C.mystus and C.brachygnathus

1.2 耳石處理

取出樣本的1 對(duì)矢耳石，分別裝入離心管內(nèi)并用蒸餾水浸泡1 h，后在JP-030 型超聲波清洗機(jī)(深圳潔盟，中國(guó))中洗滌30 min，除去耳石黏液與雜質(zhì)。清洗結(jié)束后，按照標(biāo)號(hào)順序依次置于培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下干燥。

1.3 耳石形態(tài)學(xué)參數(shù)與形態(tài)指標(biāo)

刀鱭耳石形態(tài)學(xué)參數(shù)包括耳石尺寸參數(shù)和形狀指標(biāo)。尺寸參數(shù)利用Mettler Toledo PL403 電子天平(梅特勒托利多，瑞士)對(duì)耳石進(jìn)行稱重(精確至0.000 1 g)。利用Nikon SMZ-2000 解剖顯微鏡(尼康，日本)對(duì)左、右矢耳石拍照，如圖1 所示，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)量耳石形態(tài)學(xué)參數(shù)(精確至1 mm)；形狀指標(biāo)利用尺寸參數(shù)計(jì)算得出，如表2 所示。

圖1 3 種鱭屬魚類矢耳石照片F(xiàn)ig.1 The sagittal otolith of three Coilia spp.

表2 鱭屬魚類耳石尺寸參數(shù)與形狀指標(biāo)Tab.2 Size dimension parameters and shape indices of otolith used to describe the three Coilia spp.

A1：面密度(surface density)：耳石單位面積的質(zhì)量。表征耳石的薄厚程度，可以反映耳石的三維特征；A2：環(huán)率(circularity)：耳石周長(zhǎng)與耳石面積平方的比值；A3：橢圓率(ellipticity)：耳石長(zhǎng)與寬的差與和的比值，指的是外緣點(diǎn)到長(zhǎng)軸的距離的比例；A4：圓度(roundness)：耳石橫截面接近圓的程度，環(huán)率與圓度表征耳石趨近于圓的程度，二者呈負(fù)相關(guān)；A5：幅形比(aspect ratio)：耳石長(zhǎng)與耳石寬的比值，表征耳石軸間的差異程度；A6：矩形趨近率(rectangularity)：耳石面積與其最小外切矩形面積的比值，描述了耳石輪廓與耳石最小外接矩形的關(guān)系；A7：形態(tài)因子(form-factor)：4 倍耳石面積和圓周率的乘積與耳石周長(zhǎng)平方的比值，反映耳石輪廓的規(guī)則程度[15]。上述耳石形狀指標(biāo)在一定程度上可以避免耳石形態(tài)分析誤差，如耳石大小、形狀等客觀因素。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)左右耳石尺寸參數(shù)和耳石形狀指標(biāo)分別進(jìn)行差異系數(shù)檢驗(yàn)、均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，對(duì)7 個(gè)形態(tài)指標(biāo)分別進(jìn)行主成分分析和判別分析。

(1) 差異系數(shù)檢驗(yàn)

差異系數(shù)(C.D)：用于檢驗(yàn)群體間某一相同性狀的差異程度，通常用于區(qū)分亞種。根據(jù)MAYR,et al[16]提出的識(shí)別和劃分亞種的75%規(guī)則，公式如下：

式中：M1和M2為2 個(gè)群體某一相同形態(tài)性狀平均值；S1和S2為對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差；C.D 為判斷亞種和種水平的臨界值，大于臨界值(1.28)差異性達(dá)到亞種水平，相反則屬于種間差異。

(2)均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)

均數(shù)差異顯著性(Mdiff)：分析群體間某一相同性狀的差異程度的t檢驗(yàn)方法。公式如下[17]：

式中：ni和nj為群體樣本數(shù)；Mi和Mj為某一性狀平均值；mi和mj為對(duì)應(yīng)性狀的標(biāo)準(zhǔn)誤差；概率水準(zhǔn)為P=0.05，以t＞2.58 為差異顯著的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

(3)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)

分析左右耳石尺寸參數(shù)和耳石形狀指標(biāo)，以檢驗(yàn)左右耳石是否存在差異。

(4)主成分分析

計(jì)算形態(tài)指標(biāo)特征值，選擇大于1 的主成分因子。利用第一、二主成分得分繪制成分載荷圖。

(5)判別分析

根據(jù)Fisher’s 準(zhǔn)則[17]對(duì)耳石形狀指標(biāo)進(jìn)行逐步判別分析，建立3 種鱭屬魚類的線性判別函數(shù)方程，以便查明樣本的歸屬情況。

上述所有分析運(yùn)用SPSS 24.0 軟件，制圖使用Origin 2022 軟件。

2 結(jié)果

2.1 差異系數(shù)檢驗(yàn)

差異系數(shù)檢驗(yàn)如表3 所示，刀鱭和短頜鱭的7 個(gè)耳石尺寸參數(shù)在2 個(gè)種間的差異系數(shù)均小于1.28，根據(jù)MAYR,et al[16]的規(guī)則判定刀鱭與短頜鱭在耳石形態(tài)上的差異未達(dá)亞種水平，二者為同種下的不同生態(tài)型群體。

表3 刀鱭和短頜鱭耳石尺寸參數(shù)的差異系數(shù)和均數(shù)差異顯著性Tab.3 Mdiff and C.D of otolith measurement characteristic of C.nasus,and C.brachygnathus

2.2 均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)對(duì)刀鱭和短頜鱭耳石的7 個(gè)尺寸參數(shù)的均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅耳石周長(zhǎng)的均數(shù)差異顯著性值小于2.58，其余的6 個(gè)參數(shù)均數(shù)差異顯著性值均大于2.58。均數(shù)差異顯著性比例非常高，說(shuō)明具有不同生活史的2 種鱭屬魚類在耳石形態(tài)方面已經(jīng)存在明顯的種群差異特征。由于鳳鱭的分類地位較為明確，是單獨(dú)的物種。因此本文僅研究刀鱭與短頜鱭的差異系數(shù)與均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)。

2.3 配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)

3 種鱭屬魚(以刀鱭為例，如表4 所示)的左右矢耳石參數(shù)與指標(biāo)差異均不顯著(配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＞0.05)。因此，統(tǒng)一使用左耳石進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，若出現(xiàn)左耳石破損可用右耳石替代。

表4 刀鱭左右矢耳石的差異性分析Tab.4 The analysis of t-test for the left and right sagittae of C.nasus

2.4 主成分分析

主成分分析結(jié)果如表5 所示，3 種魚類中均有2 個(gè)形狀指標(biāo)的特征值大于1，分別記作第一主成分和第二主成分。第一主成分分別解釋了約49%、44%、49%的變量信息。刀鱭的第一主成分中A4、A6具有較高的正載荷，A2、A7的載荷量較低；鳳鱭的第一主成分中A3、A5具有較高的正載荷，A2、A7的載荷量較低；短頜鱭的第一主成分中A1、A6具有較高的正載荷，A4的載荷量較低；第二主成分中，刀鱭的A1、鳳鱭的A3、A7、短頜鱭的A3、A5有著較高的載荷量，他們與第一主成分分別解釋了78%、81%和90%的變量信息。前2 個(gè)主成分散點(diǎn)圖顯示：3 個(gè)種群分布在4 個(gè)象限內(nèi)，這種分布表現(xiàn)出一定的隨機(jī)性，各個(gè)群體之間存在明顯的交叉現(xiàn)象(圖2)。

圖2 3 種鱭屬魚類耳石形狀指標(biāo)第一、二主成分分析散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot scores based on the first two principal components for otolith shape indices of three Coilia spp.

表5 3 種鱭屬魚類耳石形狀指標(biāo)主成分分析結(jié)果Tab.5 The result of principal component analysis for otolith shape indices of three Coilia spp.

2.5 判別分析

將3 種鱭屬魚類的7 種耳石形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)輸入SPSS 軟件，利用逐步判別分析得到3 個(gè)耳石形狀指標(biāo)(A1、A2、A7)，將這3 個(gè)形態(tài)指標(biāo)納入判別分析的方程：

將各個(gè)體的耳石形狀指標(biāo)依次代入以上3 個(gè)判別方程，每個(gè)個(gè)體得到3 個(gè)函數(shù)值，最大的函數(shù)值對(duì)應(yīng)的判別函數(shù)表示的群體即為該個(gè)體所屬的群體。判別結(jié)果如表6 所示，可以看出判別正確率在90.3%～100%之間，綜合判別正確率為93.8%。

表6 3 種鱭魚判別分析結(jié)果Tab.6 Discriminant result of three Coilia spp.

圖3 是基于前2 個(gè)判別函數(shù)值繪制的散點(diǎn)圖，3 個(gè)群體之間各自呈區(qū)域性聚集，鳳鱭和短頜鱭有少部分重疊，刀鱭為單獨(dú)聚類。

圖3 判別函數(shù)散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot based on the first two discriminant functions

3 討論

3.1 矢耳石形態(tài)指標(biāo)識(shí)別刀鱭和短頜鱭物種地位的有效性

目前，對(duì)于短頜鱭的物種地位有效性存在很大爭(zhēng)議。短頜鱭最早被KREYENBERG 和PAPPENHEIM于1908 年確定為1 個(gè)物種，因其上頜骨和生活環(huán)境等特征不同于其他鱭屬魚類，因此被視為一個(gè)有效種[18]。但隨著調(diào)查的深入，在一些江湖連通的水域中也發(fā)現(xiàn)了短頜鱭的蹤影，上頜骨這一明顯鑒別刀鱭和短頜鱭的特征變得模糊，一時(shí)間對(duì)于短頜鱭物種有效性引起了許多學(xué)者的廣泛討論[19]。目前關(guān)于這二者的分類地位存在不同觀點(diǎn)：在21 世紀(jì)初期，許多研究認(rèn)為短頜鱭物種地位是無(wú)效的，唐文喬等[20]基于線粒體控制區(qū)全序列計(jì)算短頜鱭與刀鱭之間平均K2-P 遺傳距離僅為0.017，認(rèn)為短頜鱭是刀鱭的淡水生態(tài)型群體。周曉犢等[21]利用線粒體COⅠ基因作為DNA 條形碼，再次證明了短頜鱭未達(dá)到種或亞種的分化水平。近幾年，XUAN Zhongya,et al[22]利用分子生物學(xué)與耳石微化學(xué)學(xué)科相結(jié)合的手段，對(duì)刀鱭與短頜鱭進(jìn)行了群體遺傳分析，認(rèn)為二者應(yīng)作為2 個(gè)獨(dú)立的鱭屬魚類，這與本世紀(jì)初其他研究結(jié)果不同。本文利用差異系數(shù)檢驗(yàn)分析刀鱭與短頜鱭耳石形態(tài)特征，根據(jù)MAYR,et al[16]的差異系數(shù)計(jì)算法則，所檢驗(yàn)的7 個(gè)參數(shù)均小于1.28，表明刀鱭與短頜鱭之間的差異并未達(dá)到亞種水平，支持2 種魚類為同一物種的結(jié)論。均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示二者在耳石形態(tài)方面存在較大的差異。從結(jié)果不難看出，刀鱭與短頜鱭之間分化水平較低，由于長(zhǎng)期生活在不同的水域環(huán)境中，導(dǎo)致不同耳石形態(tài)有明顯的種群差異性。在不同魚類群體之間，耳石形態(tài)特征主要由遺傳因素決定[23]，此外耳石形態(tài)還受到環(huán)境異質(zhì)性等因素的影響，這一點(diǎn)在大西洋鱈Gadus morhua身上得到了很好的驗(yàn)證，水溫對(duì)其耳石形態(tài)方面起到了重要的作用[24]。不同水域間，水體環(huán)境往往存在一定的差異。本文所研究的刀鱭和短頜鱭分別采自楠溪江與香溪河。楠溪江位于甌江下游，與甌江水體交換頻繁，并與東海連通；而香溪河是三峽庫(kù)區(qū)一級(jí)支流中距離三峽大壩最近的河流。三峽大壩竣工后，香溪河水體與長(zhǎng)江水體交換速度緩慢。兩地存在巨大的地理差異，這也就造成二者耳石均數(shù)差異顯著，耳石形態(tài)存在明顯差異。這也再次證明不同水域環(huán)境對(duì)魚類耳石形態(tài)有著較大的影響。

3.2 3 種鱭屬魚類矢耳石多元統(tǒng)計(jì)分析比較

利用3 種鱭屬魚類耳石尺寸參數(shù)與形狀指標(biāo)分別進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明左右耳石各項(xiàng)指標(biāo)差異均不顯著(P＞0.05)，再次驗(yàn)證我國(guó)鱭屬魚類左右矢耳石無(wú)顯著性差異[25]。基于左右矢耳石可替代性、個(gè)體大、易于觀察等優(yōu)勢(shì)，其可靠性已然成為物種特征形態(tài)學(xué)分析的有利工具[26]。主成分分析可以較好地篩選重要變量，降低遺漏重要變量的風(fēng)險(xiǎn)，簡(jiǎn)化分析統(tǒng)計(jì)過(guò)程[27]。本文主成分分析結(jié)果的累計(jì)貢獻(xiàn)率較好地解釋了總變異。在主成分分析散點(diǎn)圖中，3 種魚類耳石樣本相互交織在一起，進(jìn)一步結(jié)合判別分析散點(diǎn)圖，可以較好地利用耳石形態(tài)區(qū)分3 種不同群體，顯示這3 種魚在耳石方面存在較大的區(qū)別，這也與上述結(jié)論相符合。在判別分析中，篩選得到A1(面密度)、A2(環(huán)率)、A7(形態(tài)因子)3 個(gè)形狀指標(biāo)，這些指標(biāo)可以作為今后開展鱭屬魚類耳石形態(tài)分析的主要候選指標(biāo)，可以較大程度提高群體識(shí)別能力。此外，判別分析的綜合正確率為93.8%，證明耳石形態(tài)學(xué)是有效地識(shí)別這3 種魚的方法。因此，利用耳石形態(tài)學(xué)鑒別不同群體時(shí)，應(yīng)盡可能地多收集樣本的大小變量(周長(zhǎng)、直徑、面積等)和形狀指標(biāo)(形態(tài)因子、橢圓率等)，綜合2 種角度對(duì)群體的識(shí)別效果更好[6]。在魚類群體識(shí)別中，除了運(yùn)用種群生態(tài)學(xué)分析法如形態(tài)學(xué)法、生活史特征分析、寄生蟲標(biāo)志法等，還常見到種群遺傳分析和耳石信息分析的方法。遺傳分析對(duì)于生活史高度重疊、遺傳差異性較小的魚類時(shí)，其鑒別效果會(huì)大打折扣。而耳石作為一種特異性高、群系特異性顯著的生物標(biāo)志物[28]，用于區(qū)分魚類群體優(yōu)勢(shì)(易于保存、受到外界影響小等)更加明顯。將不同的耳石信息分析方法相結(jié)合，能更好地劃分不同的魚類群體[29-30]。相信隨著耳石形態(tài)學(xué)研究工作的進(jìn)一步深入，其在漁業(yè)資源相關(guān)領(lǐng)域的研究中會(huì)起到越來(lái)越重要的作用。

3.3 我國(guó)鱭屬魚類的分類

目前，我國(guó)鱭屬魚類包括刀鱭、鳳鱭、七絲鱭C.grayi3 種，這一觀點(diǎn)得到了絕大多數(shù)學(xué)者的支持[31-39]。鳳鱭在鱭屬魚類中，處于系統(tǒng)發(fā)育較為原始的位置，刀鱭和七絲鱭分別為適應(yīng)寒冷與溫暖性氣候的分化的物種[20]。短頜鱭與湖鱭分別為刀鱭的2 個(gè)不同生態(tài)型群體，隨著時(shí)間的推移，在地理格局與水體環(huán)境等因素的綜合影響下，不排除短頜鱭與湖鱭分化為亞種的可能。如表7 所示，在鱭屬魚類的研究中，過(guò)去往往集中于長(zhǎng)江中下游至長(zhǎng)江口及其周圍湖泊水域，東海區(qū)也有部分研究，長(zhǎng)江上游流域刀鱭耳石形態(tài)暫無(wú)報(bào)道。長(zhǎng)江中上游有許多大型水利設(shè)施，形成天然的地理隔離，這些水利樞紐可能阻礙了上游與下游流域魚類基因的交流；相較于上游，中下游流域大型水利設(shè)施較少，魚類基因交流較為頻繁，中上游的短頜鱭群體保留了較為原始的鱭屬魚類特征，這可能是本研究與XUAN Zhongya,et al[22]研究結(jié)果不一致的原因。

表7 中國(guó)鱭屬魚類分類的研究現(xiàn)狀Tab.7 The research status of Coilia spp.classification in China

綜上所述，由于本文僅利用耳石形態(tài)對(duì)鱭屬魚類進(jìn)行種間識(shí)別并對(duì)物種有效性進(jìn)行分析，在討論鱭屬魚類種間識(shí)別與物種有效性問(wèn)題時(shí)可能存在一些短板，今后應(yīng)結(jié)合分子生物學(xué)等手段，對(duì)耳石形態(tài)學(xué)得出的相關(guān)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步判斷耳石形態(tài)學(xué)在種間識(shí)別等問(wèn)題研究中的科學(xué)性。此外，本文對(duì)短頜鱭物種進(jìn)行有效性分析時(shí)，短頜鱭樣品收集僅選擇在長(zhǎng)江上游(秭歸香溪河)，并未采集長(zhǎng)江中游與下游流域的樣品，因此在討論物種有效性時(shí)，應(yīng)豐富不同流域的樣本，因地制宜地對(duì)不同流域的種類分別進(jìn)行討論，綜合研判，以此確定其有效地位。

致謝：本研究在耳石的形態(tài)學(xué)測(cè)量、照片拍攝等方面得到了自然資源部第二海洋研究所毛琴同學(xué)的大力幫助，特表謝忱！