芹菜素對化學法氧糖剝奪/復氧復糖損傷大鼠心肌細胞保護作用研究

禹博，祁琳，金鑫，曹清文，田晨，李佳穎，王越，周建妹，陳康寅

（1．天津醫科大學第二醫院心臟科，天津市心血管病離子與分子機能重點實驗室，天津心臟病學研究所，天津 300211；2．武警特色醫學中心藥劑科，天津 300162；3．武警后勤學院軍事藥學教研室，天津 300309；4．天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617；5．浙江醫院干部保健科，杭州 310013）

中國心血管疾病患病率處于持續上升階段，急性心肌梗死的死亡率于2002—2018 年總體呈上升態勢[1]。急性心肌梗死后，通過溶栓或經皮冠狀動脈介入治療及早恢復心肌灌注是減少心肌梗死面積、改善臨床預后最有效地方法。但恢復血供又可能造成心肌頓抑、無復流，甚至心肌損傷加重的現象，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia－reperfusion injury，MIRI），成為再灌注療法獲益的主要障礙。MIRI 主要涉及氧化應激、線粒體損傷、凋亡、自噬等機制[2－5]，目前MIRI 發生機制尚不完全清楚，缺少療效確切的預防及治療藥物[6]。因此，進一步探討MIRI 的機制，尋找安全有效的治療藥物，仍有重要的現實意義。

芹菜素是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物。作為一種脂溶性還原劑，其可在治療帕金森病、腦缺血再灌注損傷、腫瘤等多種疾病中發揮重要作用[7－9]。研究表明，芹菜素可通過抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPKs）信號通路減輕大鼠離體心肌缺血再灌注損傷，也可通過上調Janus 激酶2（JAK2）－信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）和磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路在物理缺氧誘導的氧糖剝奪/復氧復糖（oxygen－glucose deprivation/restoration，OGD/R） 損傷中發揮保護作用[10－12]。但目前尚無關于芹菜素對MIRI中自噬作用的報道。利用化學性缺氧模擬劑氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）構建OGD/R 模型[13]，相比物理缺氧，無需專門低氧培養設備，具有操作更方便，缺氧效果穩定等特點。因此，本研究利用氯化鈷建立H9c2 細胞的OGD/R 模型，初步探討芹菜素對H9c2細胞OGD/R 損傷的影響，并探討其調節凋亡和自噬相關分子機制，為進一步研究芹菜素抗MIRI 提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠H9c2 心肌細胞（購自中國科學院細胞庫）；胎牛血清、DMEM 高糖培養基和0．25%胰蛋白酶（Gibco，Waltham，MA）；DMEM 無糖培養基、PBS 緩沖液、CoCl2粉劑、MTT、PMSF 抑制蛋白降解液和二抗（北京索萊寶科技有限公司）；芹菜素（上海源葉生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（康為世紀生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；5×蛋白上樣緩沖液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；PVDF膜（密理博科技有限公司）；HIF－1α 抗體、β－actin抗體及超敏ECL 發光液（Affinity Biosciences 公司）；SIRT－1、p62、LC3A/B、Bax、Bcl－2 抗體（ABclonal 公司）；LDH 測定試劑盒、SOD 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Caspase－3 ELISA 檢測試劑盒（伊特生命科學研發有限公司）。

1.2 細胞培養及分組 處理大鼠H9c2 心肌細胞在含有10%FBS、100 U/mL 青霉素/100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，實驗使用的細胞均處于對數生長期。實驗分3 部分：（1）模擬1%低氧等效CoCl2濃度確定實驗：分為①對照組；②1%O2組；③CoCl2（0．1～1．2 mmol/L）組。1%O2組是將細胞在三氣培養箱（1%O2、5% CO2、94% N2）中用含1%FBS 的DMEM 高糖培養基培養24 h，CoCl2組是用不同濃度CoCl2處理并在含1%FBS 的DMEM 高糖培養基培養24 h。（2）模擬1%O2OGD/R 模型等效CoCl2濃度確定實驗：分為①對照組；②1%O2組；③CoCl2（0．6 和0．8 mmol/L）組。根據第一部分實驗結果確定的CoCl2濃度處理細胞，1%O2組是將細胞置于三氣培養箱中用含1%FBS 的DMEM 無糖培養基培養16 h 后，置于正常條件（復氧復糖）培養4 h；CoCl2組將細胞用0．6 和0．8 mmol/L CoCl2處理并在含1%FBS 的DMEM 無糖培養基培養16 h 后，置于正常條件培養4 h。（3）芹菜素對H9c2 細胞OGD/R 作用的影響：①對照組；②OGD/R 組（CoCl2濃度為0．8 mmol/L）；③OGD/R+芹菜素組。不同濃度芹菜素預處理24 h。

1.3 細胞活力測定 將H9c2 細胞根據實驗分組以8×103個/孔的密度接種于96 孔板，培養24 h 后用含1%FBS 的DMEM 高糖培養基同步化24 h，然后根據實驗分組處理細胞。結束培養前4 h，棄去上清，避光加入100 μL/孔MTT（0．5 mg/mL，PBS 配制），作用4 h 后棄上清，加入100 μL/孔DMSO，充分震蕩，492 nm 處測定每孔吸光度值。細胞活力計算公式：細胞活力（%）=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。每組設5 個復孔。

1.4 蛋白提取和Western 印跡 按照實驗分組，將H9c2 細胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養24 h 后用含1%FBS 的DMEM 高糖培養基同步化24 h，然后根據實驗分組處理細胞。棄去培養液，用PBS 清洗細胞2 遍，每孔加入適量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液提取蛋白并用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后，以每泳道20 μg的蛋白上樣量用10% SDS－PAGE 凝膠進行電泳、轉膜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，使用5%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白結合，TBST 洗膜3 次，每次10 min，4℃下孵育一抗（1∶500 稀釋）過夜。次日，吸出一抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min，HRP 結合二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次后，ECL 化學發光試劑盒顯色，采用Image J 軟件對蛋白條帶的光密度值進行分析。

1.5 細胞caspase－3 含量測定 將H9c2 細胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，依據實驗分組處理細胞并收集細胞，在細胞沉淀中加入約0．4 mL 的PBS，混勻，在冰水浴中進行超聲破碎細胞，使細胞內蛋白充分釋放，4℃3 000 r/min 離心10 min 得到樣品，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。設置空白孔、標準品孔及樣本孔，根據ELISA 試劑盒操作說明加入試劑及待檢樣本，覆膜，37℃溫育1 h；洗滌，加入底物，37℃溫育15 min；加入終止液，在450 nm 波長處測定各孔的OD 值，繪制標準曲線，并計算細胞的caspase－3 濃度。

1.6 細胞SOD 含量測定 細胞分組和處理同1．5，設置對照孔、對照空白孔、樣品孔及樣品空白孔，根據SOD 試劑盒操作說明書加入相關試劑，混勻后37℃溫育20 min，在450 nm 波長處測定各孔的OD值，根據說明書計算SOD 含量。

1.7 細胞外液LDH 水平測定 將H9c2 細胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，依據實驗分組處理細胞后收集各自的培養液上清。設置空白孔、標準孔、測定孔及對照孔，根據LDH 試劑盒說明書加入相關試劑并依次37℃溫育后加入終止液后，在450 nm 波長處測定各孔的OD 值，根據說明書計算LDH 漏出量。

1.8 統計學處理 應用Graph Pad Prism 9．0 軟件進行數據處理及作圖，計量資料中符合正態分布資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組內兩兩比較采用SNK 法，P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模擬1%O2的等效CoCl2濃度 結果圖1a 所示，與對照組相比，1%O2及CoCl2（0．4～1．2 mmol/L）組細胞活力均明顯降低（P＜0．05）；與1%O2組相比，CoCl2（0．5～0．8 mmol/L）組細胞活力降低程度無統計學差異（P＞0．05）。圖1b 所示，與對照組相比，1%O2及CoCl2（0．5～0．8 mmol/L）組HIF－1α 表達均明顯上調（P＜0．05），且與1%O2組相比無顯著差異（P＞0．05）。因此選取0．6 mmol/L 和0．8 mmol/L CoCl2用于OGD/R 模型構建篩選。

圖1 不同濃度CoCl2 對H9c2 細胞活力和HIF-1α 表達的影響Fig 1 The effects of 1%O2 and CoCl2 of different concentrations on the viability and expression of HIF-1α in H9c2 cells

2．2 模擬1%O2OGD/R 模型等效CoCl2濃度 結果圖2a 所示，與對照組相比，1%O2及CoCl2（0．6、0．8 mmol/L）組細胞活力明顯降低（P＜0．05）。與1%O2組相比，0．8 mmol/L CoCl2組細胞活力降低沒有統計學意義（P＞0．05）。圖2b 所示，與對照組相比，1%O2及CoCl2（0．6、0．8 mmol/L）組HIF－1α 表達均明顯上調（P＜0．05），且與1%O2組相比無顯著差異（P＞0．05）。因此選取CoCl2（0．8 mmol/L）用于后續OGD/R 模型及檢測實驗。

圖2 OGD/R 條件下不同濃度CoCl2 對H9c2 細胞活力及HIF-1α表達的影響Fig 2 The effect of 1%O2 and CoCl2 of different concentrations on the viability and expression of HIF-1α of H9c2 cells under the condition of OGD/R

2.3 OGD/R 條件下芹菜素對H9c2 細胞活力、SOD及LDH 的影響 圖3a 所示，與對照組相比，OGD/R組的細胞活力均受到明顯抑制（P＜0．05）；與OGD/R組相比，芹菜素（0．01～10 μmol/L）組細胞活力有顯著差異（P＜0．05）；圖3b 所示，與對照組相比，OGD/R 組的SOD 含量明顯下降（P＜0．05）；與OGD/R 組相比，10 μmol/L 芹菜素組SOD 含量顯著提高（P＜0．05）；圖3c 所示，與對照組相比，OGD/R 組的LDH 漏出量明顯提高（P＜0．05）；與OGD/R 組相比，10 μmol/L 芹菜素組LDH 漏出量顯著下降（P＜0．05）。

圖3 OGD/R 條件下芹菜素對H9c2 細胞活力、SOD 及LDH 的影響Fig 3 The effects of API on the viability，SOD and LDH of H9c2 cells under the condition of OGD/R

2.4 芹菜素對OGD/R H9c2 細胞凋亡相關指標的影響 圖4a、b、c 所示，與對照組相比，OGD/R 組Bcl－2 表達量明顯下降（P＜0．05），Bax 的表達量明顯增加（P＜0．05）；10 μmol/L 芹菜素可顯著提高Bcl－2的表達量（P＜0．05），降低Bax 的表達量（P＜0．05）；圖4d 所示，與對照組相比，OGD/R 組的caspase－3 含量明顯增加（P＜0．05）；與OGD/R 組相比，10 μmol/L芹菜素組的caspase－3 含量明顯下降（P＜0．05）。

圖4 OGD/R 條件下芹菜素對H9c2 細胞凋亡相關指標的影響Fig 4 The effects of API on the apoptosis-related indexes of H9c2 cells under the condition of OGD/R

2.5 芹菜素對H9c2 細胞OGD/R 損傷SIRT1 及自噬相關蛋白表達的影響 圖5 所示，與對照組相比，OGD/R組SIRT1 及LC3Ⅱ/Ⅰ表達量明顯下降（P＜0．05），p62 的表達量明顯增加（P＜0．05）；10 μmol/L 芹菜素可顯著提高SIRT1 及LC3Ⅱ/Ⅰ的表達量（P＜0.05），降低p62 的表達量（P＜0.05）。

圖5 OGD/R 條件下芹菜素對H9c2 細胞SIRT1 及自噬相關指標的影響Fig 5 The effects of API on the SIRT1 and autophagy-related indexes of H9c2 cells under the condition of OGD/R

3 討論

MIRI 是由多種細胞因子和信號通路參與的復雜病理過程，對心血管病患者的治療和預后造成了嚴重影響。因此，MIRI 機制的研究一直是心血管領域的熱點。如何減輕MIRI 對改善心肌梗死患者預后具有重要意義。OGD/R 誘導的H9c2 細胞損傷是經典的體外心肌細胞損傷模型，常用于心肌梗死和MIRI 的藥物篩選和機制研究。根據剝氧方式不同，可分為物理缺氧和化學缺氧。物理缺氧存在設備復雜昂貴，模型穩定性差，缺氧程度難以控制的缺點，而化學缺氧則可以有效避免上述缺點且操作簡便易行。CoCl2通過鈷離子代替HIF 的脯氨酰羥化酶活性位點中的Fe2+，能在體外誘導細胞產生缺氧損傷[14-15]，因此CoCl2常用于化學缺氧損傷模型。HIF-1α 是由缺氧刺激產生的重要轉錄因子，在缺氧誘導的哺乳動物細胞中廣泛表達，為缺氧應答的全局性調控因子，與氧化應激密切相關[16]。故本研究以H9c2 細胞為實驗對象，采用細胞活力和HIF-1α 相結合作為評價指標，比較1%O2和CoCl2建立的缺氧和OGD/R 損傷效果，構建簡便易行且穩定的H9c2 細胞化學OGD/R 模型。結果顯示，0.8 mmol/L CoCl2聯合剝糖作用16 h，復氧復糖4 h的方案與此條件下1%O2造成的損傷相近，可作為H9c2 細胞穩定的OGD/R 損傷模型。

本研究通過MTT 實驗闡明了芹菜素對OGD/R H9c2 細胞活力的影響。結果顯示，低濃度的芹菜素（0.000 1、0.001 μmol/L）對OGD/R H9c2 細胞沒有作用；中等濃度的芹菜素（0.01～10 μmol/L）對OGD/R H9c2 細胞有保護作用；而高濃度的芹菜素（40～100 μmol/L）對OGD/R H9c2 細胞有明顯毒性作用，故接下來的研究選用1、10 μmol/L 的芹菜素進行實驗。OGD/R 會造成心肌細胞氧化應激損傷，SOD 和LDH 是氧化應激損傷的重要標志物[17]。SOD 與氧自由基的清除能力密切相關，檢測SOD 水平可反映氧自由基攻擊引起的細胞脂膜損傷的嚴重程度。LDH作為一種催化酶，主要參與丙酮酸和乳酸的轉化，當細胞膜損傷時其可釋放到細胞外基質，檢測LDH水平可反映細胞膜完整性及細胞損傷程度。本研究顯示芹菜素可提高OGD/R 所致的細胞SOD 降低，可減少OGD/R 所致的LDH 漏出，提示芹菜素可以保護OGD/R 導致的細胞氧化應激損傷。

心肌細胞凋亡是MIRI 的主要致病機制之一，心肌細胞是永久細胞，凋亡會導致心肌收縮功能障礙，阻斷凋亡過程可防止心肌細胞的丟失，減少心臟損傷。Bcl-2 家族是重要的細胞凋亡調控蛋白，而其中的Bcl-2（抑制凋亡蛋白）和Bax（促進凋亡蛋白）發揮著關鍵作用，兩者可以結合，形成二聚結合體，調節線粒體的穩定狀態，進而調控細胞凋亡[18]。Caspase-3 是細胞凋亡的主要執行者，可引起DNA降解、細胞核碎裂，最終導致細胞凋亡的發生[19]。本研究發現，芹菜素可提高OGD/R 所致的Bcl-2 降低，減少OGD/R 所致的細胞Bax 和Caspase-3 增加，提示芹菜素可以減少OGD/R 導致的細胞凋亡。

自噬是一種復雜保守的自我降解過程，對維持細胞內穩態至關重要。自噬在心臟疾病中的作用取決于特定的病理情況和發病階段，適度的自噬有助于保持心臟健康，而自噬不足或過度則對心臟造成損傷[20-21]。LC3 是自噬的標志物，其中存在LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種形式，泛素樣作用下的LC3-Ⅰ與膜結構上的磷脂共價結合，形成LC3-Ⅱ存在于自噬體的內外膜上，所以LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值可反映自噬水平[22]。p62 是選擇性自噬接頭蛋白，是連接LC3 與待降解泛素化底物的重要橋梁。作為自噬待降解的產物，自噬流受阻時大量泛素化蛋白會堆積到細胞內，此時p62 表達水平會升高；而在自噬流活化狀態下，p62 被降解，表達水平降低[23]。因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62 表達水平能可評價細胞自噬流水平。Liu 等[24]通過動物實驗證實，鹽誘導蛋白2 可能通過mTOR/ULK1 信號通路促進自噬，抑制該蛋白可通過減少異常自噬減輕心肌MIRI。而Li 等[25]通過動物和細胞實驗證實促進自噬通量可抑制MIRI 誘導的細胞凋亡。這說明自噬在MIRI 中的兩面性。SIRT1 是sirtuins 蛋白家族的一員，主要位于常染色體區域，可在細胞核和細胞質中穿梭調節，其通過催化組蛋白和轉錄因子的賴氨酸去乙酰化修飾，從而影響細胞增殖、衰老與代謝等生理活動[26]。SIRT1通過其脫乙酰酶活性參與自噬從起始到降解的不同步驟的調節。當然，SIRT1 的水平和功能也受自噬過程的調節[27]。Zhang 等[28]發現去甲腎上腺素抑制劑可在心肌缺血再灌注損傷小鼠中發揮保護作用，其機制與SIRT1 對自噬小體的清除密切相關。Zhong等[29]研究表明SIRT1 可通過減少炎癥和誘導自噬發揮抗心肌缺血損傷的作用。Wang 等[30]利用H9c2細胞證實，SIRT1 可通過促進自噬抑制心肌肥厚。本研究顯示，OGD/R 條件下，SIRT1 和LC3-Ⅱ/Ⅰ明顯降低，p62 蛋白表達明顯上調，提示自噬水平降低。芹菜素可一定程度逆轉上述自噬通量的變化，表明芹菜素增強了OGD/R H9c2 的自噬水平，該過程可能與SIRT1 的作用有關。

綜上所述，自噬、氧化應激和凋亡之間存在復雜的相互作用關系。氧化應激可以激活自噬，也可促進凋亡[31-32]。自噬可以通過清除受損的線粒體，降低活性氧，減輕細胞氧化應激損傷，進而減少細胞的凋亡[33]。本研究結果顯示，芹菜素能提高H9c2 細胞OGD/R 模型的細胞活力，減少細胞凋亡，具有明顯抑制氧化應激損傷的作用，可能與其通過調控SIRT1 促進細胞自噬有關，但它們之間的相互關系及深入機制，仍需要進一步實驗加以驗證。