甘藍型油菜響應干旱脅迫的轉錄組分析

張蕾　阮羽萱　潘嬌　陳敏　劉博宇　阮穎　黃勇

摘要：甘藍型油菜（Brassica napus L.）是我國主要油料作物之一，為國家糧油安全提供了重要保障。干旱嚴重限制了油菜種植規模擴大、產量與品質提升。為挖掘甘藍型油菜抗旱的關鍵基因，闡明油菜耐旱機制，本研究以甘藍型油菜湘油15為對象，通過實驗室模擬干旱處理后的葉片為材料進行轉錄組測序（RNA-Seq）、生物信息分析并 qRT-PCR 驗證。發現轉錄組樣本平均Clean baseas約為9.6 G，且各樣品堿基百分比（Q30）大于93.21%，比對到參考基因組上的Reads在89％以上。干旱處理4 h后，湘油15出現了440個差異表達基因（DEGs），其中148個基因上調，292個基因下調。隨機選取10個基因（上調與下調各5個）進行qRT-PCR驗證，其中9個基因的qRT-PCR結果與 RNA-Seq結果相符，僅1個基因表達趨勢相反，相似度可達90％，證實轉錄組測序結果的可靠性。結果表明甘藍型油菜湘油15主要通過光合作用、碳代謝和滲透調節等途徑調節抗旱能力，為進一步闡明油菜耐旱機制奠定了基礎。

關鍵詞：甘藍型油菜；干旱脅迫；轉錄組分析；差異表達基因

中圖分類號：S634.301文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0051-05

干旱是全球發生頻率最高、影響范圍最廣、對國民經濟造成巨大損失的自然災害［1-2］。油菜是我國種植面積最廣、產量最高的油料作物之一［3］，其中甘藍型油菜是廣泛種植于長江中下游區域的油菜品種，但其整個生長期對水的依賴性較強，耐旱性較差。干旱極大地影響了油菜的發育、產量和品質，嚴重威脅人類的糧油安全［4］。

當遭受干旱脅迫時，植物在一定程度上能夠通過自身調節適應環境的變化。氣孔是植物散失水分的主要途徑，當植物處于干旱脅迫下，將調控葉片氣孔閉合以降低蒸騰作用，從而減少植物體內水分流失，進而影響光合作用與碳代謝［5］。此外，植物細胞中的一些離子和滲透調節物質將累積以維持細胞內離子穩態和滲透調節平衡，從而使自身保存水分的能力保持在較高的水平［6］。當植物處于逆境脅迫下，細胞代謝發生紊亂，大量積累的活性氧破壞了生物膜的結構，影響其功能的正常發揮，嚴重時危害細胞生長，導致植株死亡［7］。為減輕活性氧積累帶來的影響，作物進化出復雜的酶和抗氧化劑系統，如低分子抗氧化劑和活性氧清除酶［8］。

轉錄水平上的調控是生物基因表達的主要調控方式之一，是對生物進行研究的關鍵組成部分［9］。高通量測序技術的出現，使研究者能夠更有效地研究不同處理條件或不同發育過程中基因的差異表達譜，篩選新的功能基因［10-12］。在本研究中，用20％聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫處理甘藍型油菜湘油15，借助高通量測序技術進行分析，篩選干旱處理誘導表達基因信息，初步挖掘耐旱基因和代謝通路，構建抗旱性相關的調控網絡。為甘藍型油菜耐旱機制提供理論依據，為培育耐旱品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和干旱處理

植物材料為甘藍型油菜湘油15，先將其種子進行表面消毒，后播種于含有霍格蘭營養液的蛭石中，溫室條件下正常生長45 d（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗，光照強度為10 000 lx，濕度為40％～60％），長出3～4片真葉后小心洗去蛭石，置于霍格蘭營養液中并充氣，光照培養箱中預培養3 d，根據營養液體積，加入20％聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫，處理時間為4 h。選取生長狀態基本一致的5株植株進行混合取樣，處理前的樣品編號為C1、C2、C3，處理后的樣品編號為T1、T2、T3。樣本于液氮中速凍，保存于-80 ℃中，用于后續試驗。

1.2 試驗時間與地點

2021年7月21日于湖南省作物表觀遺傳與發育重點實驗室進行。

1.3 轉錄組測序

樣品由百邁克生物科技（長沙）有限公司進行RNA提取、質量分析、cDNA文庫構建和轉錄組測序分析［13］。

1.4 差異表達基因的篩選和分析

首先對樣品中Mapped Reads數目與轉錄本長度歸一化，以FPKM方法作為檢測轉錄本或基因表達水平的指標［14］。時間和空間特異性是基因表達的2個特性，當處于不同的條件下，表達水平具有顯著差異的基因或轉錄本稱為差異表達基因（DEGs）。根據不同樣品間的相對表達水平，可將DEGs劃分為下調基因和上調基因。利用R語言 DESeq2 程序包對過濾后的數據進行篩選來獲得DEGs，篩選標準為：差異倍數（fold change，簡稱FC）大于2，即|log2FC|≥1；錯誤發現率（false discovery rate，簡稱FDR）小于0.01［15］，FDR是通過對差異顯著性P值（p-value）進行校正得到的，即p-value＜0.01。使用 Blast2GO軟件對差異基因進行基因功能注釋。

1.5 通過qRT-PCR驗證差異表達

隨機選取10個DEGs（上、下調基因各5個）進行實時熒光定量分析（qRT-PCR）驗證轉錄組測序中差異基因表達的準確性。通過Trizol法提取轉錄組測序備份樣品的總RNA，每樣品取1 ng RNA通過擎科生物cDNA合成試劑盒反轉錄，最終cDNA體積為20 μL。qPCR引物設計見表1。qRT-PCR使用Applied Biosystems 7300實時PCR系統，設置3次技術重復，使用2-ΔΔCT法計算相對定量數據。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序質量分析

轉錄組測序分析對照組和干旱處理試驗組各3個樣本。高通量測序后，為保證數據分析的質量，對原始數據進行過濾得到clean reads。整體上分析，干旱處理組和對照組的3個重復平均reads數分別約為34 094 369、30 190 757，樣本平均堿基數約為9.6 G，且各樣品Q30堿基百分比在93.21%及以上，GC含量為47.57%～48.8%。使用 HISAT2比對系統分析得到，各樣品reads與參考基因組的比對效率在89.18%～91.65%（表2）。整體測序數據質量良好，可用于后續分析。

2.2 差異表達基因分析

利用DESeq2對甘藍型油菜各樣本的轉錄組數據進行分析，以P值<0.01且差異倍數|log2FC|≥1作為顯著差異表達基因的篩選條件。從圖1可知，對照組和試驗組（C vs T）中鑒定到DEGs共有440個，其中148個DEGs表達上調，292個DEGs表達下調。

2.3 差異表達基因GO分析

以P≤0.01為標準將差異表達基因進行GO注釋。根據差異基因對應的生物過程、分子功能和細胞組分的不同，分別進行 GO 富集分析。數據結果統計發現，生物過程主要集中在韌皮部蔗糖的裝載、

應對鎘離子、磷酸戊糖分流、糖酵解、葉綠體移動等（圖2-A）；分子功能主要集中在果糖二磷酸醛縮酶活性、磷酸核酮糖激酶活性、吡哆醛磷酸的結合等（圖2-B）；細胞組分主要集中在胞質核糖體、質膜、質外體、葉綠體被膜等（圖2-C）。結果表明，甘藍型油菜在干旱脅迫下的差異表達基因主要與植物生長發育如光合作用和糖代謝過程有關。甘藍型油菜可以通過體內細胞全方位的協調作用來減少外部惡劣環境對植物體所造成的傷害，同時調節內部代謝活動以保證植物的基本生長。

2.4 差異表達基因KEGG分析

為分析在干旱脅迫下甘藍型油菜發育過程中體內代謝途徑的變化，對差異基因進行 KEGG 分類統計（P<0.01）。這些差異基因主要富集通路包括碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、氨基酸生物合成和代謝、磷酸戊糖途徑（圖3）。代謝途徑分析表明，干旱脅迫對甘藍型油菜的碳代謝、氨基酸代謝有影響。

2.5 差異表達基因的qRT-PCR驗證

隨機選取上調與下調各5個差異表達基因驗證轉錄組測序結果的可靠性，通過qRT-PCR驗證干旱處理前后的表達水平，將所選基因的相對表達與RNA-seq分析的相對表達進行比較，結果表明，qRT-PCR結果的相對趨勢與RNA-seq數據基本一致，證明本研究RNA-seq結果的可靠性（圖4）。

3 討論與結論

光合作用直接影響作物生長發育及產量，干旱環境中光合作用強度是衡量作物抗旱能力的重要依據［16-17］。筆者發現，差異表達基因GO和KEGG注釋到的結果與光合作用、碳代謝、滲透調節有關，研究結果與前人在不同物種的發現較為一致。研究發現，棉花［18-19］和蘇丹草［20］干旱轉錄組的KEGG代謝通路顯著富集于光合作用中。對梭梭［21］和甘藍型油菜［22］的干旱轉錄組分析表明，其KEGG富集于碳代謝等過程。碳水化合物可以為逆境下的植物提供基本能量以維持正常生命活動，同時還可以作為體內信號分子調節一系列代謝反應以適應不利環境［23］。植物受到水分脅迫時，滲透調節系統會改變植物的物質代謝過程，一些大分子物質如蛋白質、淀粉等會分解成小分子有機物如可溶性糖和氨基酸等［24］，它們能作為滲透調節因子保持植物體內滲透壓的平衡，保護逆境環境中的植物細胞。對干旱脅迫棉花的轉錄組分析顯示，差異表達基因顯著富集在滲透調節系統上［13］。

在干旱脅迫期間，為通過調節細胞過程在干旱條件下生存，植物中的基因表達發生了顯著變化［25］。通過差異基因表達方法闡明植物的耐旱性，為確定可能的耐旱機制提供了有價值的信息。對低溫脅迫下云霧貢茶進行轉錄組分析，篩選并鑒定了差異基因CsPPO具有提高植物耐寒性的功能［26］。對鹽堿脅迫下的紫花苜蓿轉錄組分析篩選到差異基因MsNAC47，對其功能研究發現MsNAC47通過調控鈣離子的轉運使植物抵御鹽堿脅迫［27］。在本研究中，PEG-6000模擬干旱處理前后湘油15共有440個DEGs，其中148個表達上調，292個表達下調， 并隨機對其中10個DEGs進行qRT-PCR進行驗證。

雖然結果與RNA-seq檢測的基因表達量上調或下調的倍數存在差異，但這兩者的趨勢基本一致，表明轉錄組測序富集到DEGs數據是準確的，推測此DEGs對于甘藍型油菜抗旱有調控作用，可以進行基因克隆與功能驗證等深入研究。

項目有效地篩選了甘藍型油菜湘油15干旱脅迫響應基因，這些基因主要調控光合作用、碳代謝和滲透調節等過程，研究結果為闡明甘藍型油菜的耐旱機制提供了參考。

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收稿日期：2022-06-21

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：31971834）；湖南省教育廳優秀青年項目（編號：19B266）。

作者簡介：張 蕾（1998—），女，湖南衡陽人，碩士研究生，從事植物分子生物學研究。E-mail：zl8398@163.com。

通信作者：黃 勇，博士，教授，從事分子生物學研究。E-mail：yonghuang@hunau.edu.cn。