橄欖種質資源遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建

邵雪花　劉傳濱　匡石滋　賴多　劉傳和　賀涵　肖維強

摘要：利用ISSR分子標記技術，對101份橄欖種質資源進行遺傳多樣性分析，并繪制指紋圖譜。從96條ISSR引物中篩選出10條引物，對廣東省農業科學院果樹研究所橄欖資源圃和潮州市果樹所資源圃內101份資源進行分子標記，使用UPGMA聚類分析橄欖種質資源遺傳多樣性，從10對引物中挑選擴增條帶清晰、多態性好的核心引物進行遺傳多樣性分析，并構建橄欖DNA指紋圖譜。分析結果顯示，10條ISSR引物對101份橄欖樣品進行擴增，共得到136條條帶，其中多態性條帶135條，多態率為99.26%，平均每條引物擴增得到條帶13.60條，平均每條引物擴增得到多態性條帶13.50條，表明供試材料間遺傳多樣性較高。通過UPGMA聚類分析可知，101份橄欖種質資源樣品間的遺傳相似性系數為0.58～0.97，表明品種間親緣關系較近。在遺傳相似性系數為0.68時，可將101份橄欖種質資源分為5組，第1組包含種質48份，第2組包含種質45份，第3組包含種質5份，第4組包含種質2份，編號C74的大納甜橄欖單獨為第5組，說明該品種與其他樣品相比發生了明顯的遺傳變異。利用篩選得來的6條核心引物組合成功構建了橄欖DNA指紋圖譜，為供試的101份橄欖品種編寫了一套唯一的指紋圖譜編碼。研究結果成功構建了101份橄欖種質的指紋圖譜，為橄欖種質資源的挖掘、利用和創制新品種等提供理論依據。

關鍵詞：橄欖；ISSR分子標記；指紋圖譜；種質資源；遺傳多樣性

中圖分類號：S667.502.4文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0094-09

橄欖（Canarium album），橄欖科橄欖屬喬木，別稱黃欖、青果、橄欖子等，原產于我國南方，主要分布在我國福建省、廣東省、四川省、廣西壯族自治區、重慶市和浙江省等南部省份（市）和地區，尤以廣東省和福建省栽培最多［1］。橄欖是傳統的藥食同源水果，其味甘酸，性平，有清熱解毒、利咽化痰、除煩醒酒的功效［2］，其果實富含豐富的多酚類物質［3-4］、黃酮類化合物［5］，可加工制成果酒、果汁、茶葉等［6-8］，還能用于抗病毒［9］、抗氧化［10-11］、保護肝臟［12］、提高免疫和調節血脂血糖［13］等方面。

目前，橄欖的新品種選育快速發展，由于不同地區的橄欖品種相互引種、雜交，導致了各個地區橄欖品種遺傳背景復雜，但目前品種鑒定工作大多依靠形態特征鑒別［14-16］，橄欖遺傳背景不明確、缺乏科學系統的檢測方法和權威的分類系統［17］，致使同名異物或同物異名的現象時常發生。ISSR是一種研究物種遺傳多樣性的常見方法，結合了RAPD和SSR 2種技術的優點，具有不受環境影響、結合位點豐富和靈敏度準確性高等特點，在品種鑒定方面，DNA分子標記技術比傳統技術更加方便、快捷［17-18］。

李婷利用ISSR分子標記技術對福建莆田24份不同品種的枇杷葉進行鑒定與分析，使用14條核心引物對其進行擴增，共擴增出150條條帶，其中有79條多態性條帶，多態率為 52.67%［19］。崔學強等利用ISSR技術對22種石斛蘭的親緣關系及遺傳多樣性進行了分析，共擴增出241條條帶，其中有241條多態性條帶，多態性條帶比例為100%，遺傳相似系數為0.70～0.88［20］。楊培奎等采用ISSR技術對粵東和潮汕地區的64個橄欖品種進行鑒定，結果表明，粵東地區與潮汕地區的橄欖遺傳多樣性水平較低，且來源地與品種名關系不大［21］。賴瑞聯等通過ISSR和RAPD聯用技術對福建地區的86份橄欖資源進行了遺傳多樣性分析，發現橄欖種質資源具有豐富的遺傳多樣性，且這種遺傳多樣性存在明顯的地域性差異［22］。陳海云等對云南的59份油橄欖進行了ISSR鑒定分析，發現云南地區的橄欖資源同樣具有較高的遺傳多態性［23］。在種質資源科學研究中，品種鑒定的原則是選用較少的引物區分較多的品種。

以上研究結果充分說明：（1）ISSR技術可有效鑒別出橄欖種質資源的遺傳多樣性；（2）橄欖種質資源的遺傳多樣性大多具有明顯的地區差異。廣東省農業科學院果樹研究所橄欖資源圃從2010年開始大量收集國內外橄欖種質資源，包括瀕臨淘汰的地方品種及國內外的主栽品種，目前已有資源60余份，而潮州市果樹研究所橄欖資源圃主要集中了廣東省內的橄欖資源，為闡明這2個資源圃內橄欖資源的同名異物或同物異名現象與品種間的遺傳分化和變異情況，本研究擬通過ISSR技術對廣東省農業科學院果樹研究所橄欖資源圃和潮州市果樹研究所橄欖資源圃中的101個橄欖品種進行遺傳多樣性分析，以期通過改善ISSR擴增條件篩選出核心引物，開發一種能夠運用在大規模樣本篩查且具備較高多態率的橄欖品種鑒定方法，并構建分子指紋圖譜，為ISSR 分子標記在橄欖分類方面的應用提供借鑒，以期為橄欖資源的品種鑒定和種質創制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗方案

試驗在廣東省農業科學院果樹研究所果樹資源與環境實驗室進行，于2021年9月在廣東省農業科學院果樹研究所和潮州市果樹研究所橄欖資源圃進行供試101份橄欖樣品的采集（種質資源品種信息見表1）。將采摘后的新鮮橄欖嫩葉迅速置于干冰中保存，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

使用北京聚合美生物科技公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取101份橄欖樣品的DNA［24］（2021年10月）。將提取的DNA樣品使用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，通過凝膠成像系統檢測其DNA純度，使用Nano Drop 2000分光光度計檢測DNA濃度，合格DNA樣品置于 -20 ℃ 冰箱內保存備用［25］。

1.2.2 ISSR分析

在加拿大哥倫比亞大學公布的通用引物序列中篩選出10條多態性好、條帶清晰的引物對101份橄欖種質資源的DNA樣品進行擴增［26］（2021年12月至2022年2月）。PCR反應總體系為30 μL，其中包含15 μL 2X Master Mix，1 μL引物（10 μmol/L），2 μL DNA模板，12 μL去離子水。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，50 ℃復性45 s，72 ℃延伸2 min，共40個循環；72 ℃ 延伸10 min，于4 ℃保存［27］。

使用8 μL PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于凝膠成像系統中觀察條帶，拍照并記錄［25］。

1.3 數據分析

使用人工讀帶的方式統計擴增產物的條帶數。將電泳圖譜上同一水平有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，以此構建0、1數據矩陣［27］。通過NT-SYSpc 2.0軟件計算橄欖樣品間的親緣相似性系數，用以分析橄欖樣品間親緣性關系。使用UPGMA法制作聚類圖，繪制出101份橄欖樣品間的遺傳關系圖譜。利用POPGENE軟件對101份橄欖進行遺傳多樣性分析，計算總擴增條帶數、多態性條帶數與多態率，根據以上數據構建橄欖種質的指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增多態性分析

使用從加拿大哥倫比亞大學設計的通用引物序列中篩選出的10條引物對48份橄欖樣品進行擴增，部分擴增圖譜見圖1-A、圖1-B。

由表2可見，10對引物總共擴增出136條條帶，其中有135條多態性條帶，多態率為99.26%。平均每條引物擴增條帶數為13.6條，平均每條引物擴增得到多態性條帶13.5條。在10條引物中，有9條引物的多態率為100%，分別是UBC808、UBC812、UBC835、UBC836、UBC880、UBC884、UBC886、UBC888和UBC889。多態性最差的引物為UBC890，其多態率91.67%。引物擴增結果顯示，以上10條引物多態性豐富，其多態率均高于80%，均可用于后續遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建工作。

2.2 聚類結果

UPGMA聚類結果見圖2。結果顯示：101份供試橄欖種質資源樣品間遺傳相似系數為0.58～0.97，平均遺傳相似系數為0.78，品種間有一定的遺傳差異。101份樣品中，品種C54烏欖與C55云旨1號遺傳距離最近， 遺傳系數為0.97。品種C56高州大坡02和C77東酸遺傳距離最遠，遺傳系數為0.58，說明這2個品種遺傳分化程度高。

在遺傳系數0.68處，可將101份種質資源分成5組。第1組包含種質48份，編號為C1～C48。第2組包含種質45份，編號為C49～C52、C54～C55、C57～C73、C75～C96。第3組包含種質5份，編號為C97～C101。第4組包含種質2份，編號為C53、C56。編號C74大納甜樣品單獨為第5組，說明該樣品與其他樣品相比，發生了明顯的遺傳變異。

2.3 橄欖DNA指紋圖譜構建

本研究從表2所列的10條引物中篩選出了6條條帶清晰、多態性高、重復性好的引物用于橄欖DNA指紋圖譜的編寫，分別是UBC808、UBC835、UBC880、UBC886、UBC888、UBC890。選擇這6條引物中清晰、典型、多態性豐富的條帶進行賦值，引物典型條帶賦值信息見表3。其中條帶UBC835-1 080 bp、UBC835-350 bp、UBC886-580 bp 與UBC888-550 bp為品種特征條帶，利用UBC835-350 bp這一位點或同時通過UBC835-1 080 bp、UBC886-580 bp與UBC888-550 bp這3個位點，可以鑒別出品種C74大納甜。

根據表3多態性條帶賦值標準對101份橄欖供試樣品進行DNA指紋編碼，結果見表4。其中品種C7吶種的指紋編碼為23-1-2-345-—-15，表示該品種的PCR擴增產物在引物UBC808的1 100、750 bp處、引物UBC835的1 080 bp處、引物UBC880的680 bp處、引物UBC886的700、580、300 bp 處，引物UBC890的1 250、400 bp處均有條帶；在引物UBC888給予賦值的典型條帶位點無條帶。在品種C14長穗赤的指紋編碼為12-1-123-1345-2-123，表示該品種的PCR擴增產物在引物UBC808的1 250、1 100 bp處，在引物UBC835的1 080 bp處，在引物UBC880的750、680、625 bp處，在引物UBC886的1 250、700、580、300 bp處，引物UBC888的450 bp處，引物UBC890的1 250、700、660 bp處均有條帶。

6條引物中的每一條引物都不能單獨用以鑒定101份種質，但將6條引物結合使用，便可以準確、高效地鑒定所有種質資源。圖3-A、圖3-B、圖 3-C、圖3-D為101份橄欖種質資源DNA指紋編碼對應的標準指紋圖譜。通過圖3-A、圖3-B、圖3-C、圖3-D能夠更加清晰、直觀地看出101份橄欖種質資源的多態性擴增情況，且每個品種都擁有一套唯一的指紋編碼。

3 討論與結論

ISSR 是一種利用微衛星序列作為 PCR 引物來生成多位點標記的技術［27］。目前，ISSR技術不僅已經廣泛應用于各種野生種與栽培品種的鑒定中［28-29］，還可應用在常規表型分類以及細胞學分類的鑒定上［30］。近年來的研究表明，ISSR技術可有效鑒別出橄欖種質資源的遺傳多樣性［31］，單獨運用ISSR技術擴增的多態性近90%［23］，ISSR和RAPD技術相結合擴增的多態性達95%［32］，多態性雖然較高， 但引物的需求量大或需借助其他技術手段進行聯合分析，鑒定工作較復雜。在種質資源科學研究中，品種鑒定的原則是選用較少的引物區分較多的品種。本研究從96條ISSR多態性引物中篩選出10條核心引物用于101份橄欖種質親緣關系、遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構建，10條核心引物擴增的多態率為99.26%，進一步分析發現，最少可利用3對（UBC808、UBC835和UBC886）多態性引物即可全部區分101份橄欖資源。

通過UPGMA聚類分析橄欖種質資源的遺傳多樣性發現，供試的橄欖種質資源具有較高的遺傳多樣性，且品種間存在較豐富的遺傳變異，在遺傳系數0.68處，可將101份種質資源分成5組。第1組包含種質48份，編號為C1～C48。第2組包含種質45份，編號為C49～C52、C54～C55、C57～C73、C75～C96。第3組包含種質5份，編號為C97～C101。第4組包含種質2份，編號為C53、C56。編號C74的大納甜樣品單獨為第5組。說明供試的橄欖品種之間沒有地域性差異，相同出處、相似命名的品種間親緣關系并不一定最近，如思賀香欖1號和思賀香欖2號、高山大坡01和高山大坡02，這一現象也與前人的研究結果相吻合［17，21，33］。親緣關系揭示，同一資源圃的橄欖樣品遺傳相似性較高，這可能是因為材料的來源地相對集中，品種存在交叉引種或不同嫁接組合導致；命名相似的品種并不一定聚為一類，這也許是在常年定向選育中，由于不同的實生母樹通過嫁接繁衍，出現了某些果實形態特征相似，從而使用了相近的命名，如思賀香欖1號和思賀香欖2號。受橄欖品種資源限制和農業生產習慣、技術的影響，在品種選育上具有一定的盲目性和隨意性，因而出現了品種遺傳背景混亂的現象。

本研究利用了ISSR分子標記技術對廣東省農業科學院果樹研究所和潮州市果樹研究所的101份橄欖種質資源進行了品種鑒定與分析，通過分子標記技術建立了橄欖種質資源的指紋圖譜，為品種資源編寫了一套獨一無二的“分子身份證”，可避免重復性的收集和保存，剔除同名異物和同物異名的橄欖種質資源，為橄欖的分子育種提供理論依據。

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收稿日期：2022-04-19

基金項目：廣東省科技廳駐鎮幫鎮扶村農村科技特別員項目（編號：KTP20210112）；廣東省農業科學院汕尾分院科技合作專項（編號：2020汕尾分院專項-02）；廣東省優稀水果現代農業產業技術體系創新團隊項目（編號：2019KJ116）；廣東省潮州市重大科技專項（編號：20210106）。

作者簡介：邵雪花（1983—），女，寧夏石嘴山人，博士，助理研究員，主要從事果樹栽培與新品種育種研究。E-mail：sxh19831017@163.com。

通信作者：肖維強，碩士，副研究員，主要從事果樹栽培與新品種育種研究。E-mail： xwq6817@126.com。