IL-33和炎癥細胞因子在結腸腺癌中的表達及相關性

段芷穎，陳火英，雷可，陳小紅，史悅嬌，夏承明，孫燕

1.中南民族大學生命科學學院，湖北 武漢 430074；2.桂林醫學院第二附屬醫院檢驗科，廣西 桂林 541004；3.武漢市第三醫院，湖北 武漢 430000

結腸癌是嚴重危害人類健康的消化道惡性腫瘤，發病率占胃腸道腫瘤的第三位，其死亡率僅次于肺癌[1-3]。結腸癌主要分為腺癌、黏液腺癌和未分化癌，大體形態呈息肉狀、潰瘍型。結腸腺癌(colon adenocarcinoma，COAD)是結腸腺上皮來源的常見消化道惡性腫瘤，是結腸癌多種病理類型中最常見的一種[4]。慢性炎癥性腸炎患者、結腸息肉患者和肥胖者是COAD 易感人群，因生活方式如高脂飲食改變人類腸道的菌群結構，其發病率呈逐年上升趨勢。因此，開發早期檢測和新的治療方法，對于有效的疾病管理和提高COAD患者生存質量、生存率是非常必要的[5]。

白細胞介素33(interleukin 33，IL-33)是IL-1細胞因子家族的新成員，作為雙功能因子，不僅具有核轉錄因子活性，而且具有細胞因子活性，通常駐留在它所表達細胞的細胞核中[6]。當它作為細胞因子時，發揮炎癥細胞因子的作用并參與免疫應答過程，在炎癥性疾病中促進Th2免疫反應。已有研究報道，IL-33在多種惡性腫瘤中發揮促進炎癥和抑制炎癥的雙重作用[7-8]。胃癌、肝癌和非小細胞肺癌患者血清中IL-33的水平升高、腫瘤組織病灶區IL-33的表達異常，參與癌癥的發生、發展和轉移，與疾病預后不良相關[9-11]。因此，選擇性抑制IL-33 過度表達而保留正常的細胞核表達IL-33成為靶向腫瘤治療研究的新目標。雖然IL-33在腫瘤免疫中的作用已被廣泛研究，但IL-33在COAD發生、發展中的作用有待進一步探究。

本文以COAD為實驗對象，利用人類蛋白質圖譜數據庫(Human Protein Atlas，HPA)進行數據挖掘，分析COAD結腸組織IL-33和炎癥相關的細胞因子的表達，以及分析IL-33 與炎癥細胞因子的相關性。預測IL-33 在COAD 中的作用，從而以IL-33 為靶點防治COAD的機制研究與臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 利用TIMER 2.0 數據庫(http://timer.cistrome.org)對COAD炎癥細胞因子進行初步篩選，利用HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org)檢索并分析15 名健康人和47 例COAD 患者結腸組織IL-33和炎癥細胞因子的蛋白表達水平以及相關性。

1.2 方法

1.2.1 篩選炎癥細胞因子 TIMER (Tumor Immune Estimation Resource)數據庫是類似于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的一個腫瘤免疫在線研究工具，主要研究免疫浸潤與遺傳或臨床特征之間的關聯。進入TIMER 2.0 數據庫，選擇檢索選項“Exploration”，畫面顯示4 個目標檢索方式，選擇“Gene DE”檢索腫瘤患者與健康人之間的差異基因表達，輸入關鍵詞，例如“IL-33”，系統將自動彈出該數據庫收錄的差異基因類型，選擇目標搜索基因，點擊“Submit”即加載出IL-33 在各類腫瘤患者和正常人體內的表達，使用箱線圖顯示基因表達水平的分布。

1.2.2 檢索癌變結腸組織中炎癥細胞因子的表達免疫組化圖譜 蛋白質在組織、細胞或亞細胞水平的準確定位與蛋白質功能密切相關，為了全面系統性解析蛋白質在疾病中的作用，有必要對蛋白質表達進行空間分辨率的研究。HPA 數據庫致力于提供人體內24 000 種蛋白質的相關信息，包括人體組織、血液、細胞和大腦中的分布信息，以及病理狀態下免疫組織化學染色圖等信息，產生了超過1 000 萬張顯示單細胞水平的蛋白質表達模式的圖像，并共享于www.proteinatlas.org。HPA 數據庫核心是收集獨特的抗體，通過免疫組織化學和免疫細胞化學繪制整個人類蛋白質組圖譜，目前呈現每種蛋白質在48 種人體正常組織、20 種腫瘤組織、47 個細胞系和12 種血液細胞內的分布和表達。目前HPA 數據庫分為六個主要部分：(1)顯示蛋白質在人體所有主要組織和器官中分布的組織圖譜；(2)顯示蛋白質在單個細胞中的亞細胞定位的細胞圖譜；(3)顯示蛋白質水平對癌癥患者生存影響的病理學圖譜；(4)顯示血細胞和主動分泌蛋白質表達譜的血液圖譜；(5)顯示蛋白質在人、小鼠和豬腦部的分布圖譜；(6)顯示蛋白質參與人體代謝的代謝圖譜。使用HPA 數據庫共納入62 例結腸組織免疫組化染色病理圖(表1)。首先，進入HPA 數據庫，在“SEARCH”檢索框中輸入關鍵詞“IL-33”，將顯示IL-33 在Tissue(人體組織)、Pathology(病理組織)和Cell(細胞)中的表達圖譜，而在Cell type(細胞系)、Brain(大腦)和Blood(血液)中則未收錄明確數據。然后，點擊“Tissue”，選擇畫面左側“TISSUES”并選擇“COLON”，即進一步檢索IL-33 在人體結腸組織中的表達。例如在“COLON-Antibody staining”中 包 括“HPA024426”和“CAB007057”兩種抗體對正常結腸組織進行免疫組化染色圖，并說明IL-33 在結腸內皮細胞(endothelialcells)、腺細胞(glandular cells)、外周神經/神經節(peripheral nerve/ganglion)中的表達程度。最后，任意點擊一張免疫組化染色病理圖即獲取圖源信息，記錄樣本ID編號和免疫組化染色抗體名稱。

表1 樣本數據信息Table 1 Information on sample data

1.3 觀察指標與評價方法 采用雙盲法對結腸組織免疫組化染色病理圖進行量化分析，在雙盲試驗中，實驗者和參與者只有在所有數據被記錄完畢后才能對樣本的所屬組別知情。將提取出的62 個免疫組化圖隨機排列，隱藏所有圖源信息，交由實驗者和參與者進行識別和記錄。在控制抗體類型一致的情況下，判斷陰性細胞和陽性細胞，其陽性細胞表達呈現深棕著色，記錄其陽性細胞的個數，取兩組數據的平均值進行統計學分析。

1.4 統計學方法 GraphPad Prism 8.0 軟件統計學分析并作圖。計量資料以均值±標準誤(±s)表示，兩組資料間比較采用Two-tailed Student's-t 檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TIMER 2.0 數據庫預測COAD 炎癥細胞因子 通過TIMER 2.0數據庫對COAD炎癥細胞因子進行初步篩選，結果提示IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1等細胞因子可能通過多靶點協同作用于COAD，見圖1。

圖1 TIMER 2.0數據庫篩選炎癥細胞因子Figure 1 TIMER 2.0 database screens for inflammatory cytokines

2.2 COAD結腸組織IL-33、TNF、IL-4和IL-6陽性細胞表達分布 通過免疫組織化學染色和蘇本素復染法，分別對HPA數據庫來源的健康人和COAD結腸組織切片炎癥細胞因子的表達進行觀察，染色病理圖呈現棕黃色顆粒即陽性細胞。結果顯示：在結腸組織中炎癥細胞因子IL-33、TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1均有表達，主要表達于黏膜上皮細胞(圖2A1~J1；圖2A2~J2是圖2A1~J1局部放大圖片)。如圖2A1~D1所示，杯狀細胞呈上大小下之形狀，形似高腳杯，呈空泡狀，Normal 組杯狀細胞幾乎不表達IL-33 和TNF，而COAD 組黏膜上皮細胞顯著性的表達IL-33 和TNF。如圖2E1~F1 所示，IL-4 陽性細胞主要分布于黏膜上皮細胞，與Normal 組相比較，COAD 組結腸黏膜上皮細胞表達IL-4陽性細胞數量較少，未見結腸“隱窩”結構和杯狀細胞，且邊緣較為模糊。如圖2 G1~H1 所示，結腸黏膜上有很多“隱窩”結構，形似“小花”淺色花瓣是分泌堿性黏液的杯狀細胞，Normal組結腸IL-6陽性細胞幾乎表達在“小花”周圍的黏膜上皮細胞中(圖2G1)，與Normal 組相比較，COAD 組IL-6 陽性細胞的表達減少(圖2H1)。此外，如圖2 I1~J1 所示，TGF-β1陽性細胞主要表達在結腸黏膜上皮細胞，且TGF-β1陽性細胞表達量較少。

圖2 COAD結腸組織IL-33、TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1的表達分布圖Figure 2 Distribution of IL-33,TNF,IL-4,IL-6,and TGF-β1 expression in colon tissues of COAD

2.3 COAD 結腸組織IL-33、IL-4 和TNF 的表達及其相關性 IL-33 作為一種炎癥細胞因子，其在消化道炎癥中表達升高，參與調節腸道免疫、腸道菌群、腸上皮細胞損傷等。通過HPA 數據庫中提取出相應條件下的所有樣本，導出HPA024426抗體檢測COAD結腸組織中IL-33陽性細胞表達情況，并對IL-33陽性細胞進行細胞計數分析發現，IL-33 在COAD 中的表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3A)。TNF 是主要由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎細胞因子，參與調節炎癥反應和免疫應答。如圖3B所示，COAD結腸組織TNF 的表達升高，結腸組織IL-4 和IL-6 的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3C 和圖3D)，此結果與TIMER 2.0 數據庫預測COAD 血清IL-4 和IL-6的水平升高相反。TGF-β1是一種轉化生長因子，在炎癥、組織修復、胚胎發育和免疫調節發揮著重要的作用，如圖3E所示，與對照組相比，COAD結腸組織TGF-β1的表達整體趨勢升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，推測這可能是因在不同狀態人體結腸組織中TGF-β1的表達差異性不明顯，有待進一步數據庫挖掘和實驗研究。此外，對COAD 結腸組織中IL-33與炎癥細胞因子TNF、IL-4、IL-6 和TGF-β1進行了相關性分析，結果發現IL-33 與TNF 的表達呈正相關性(圖3F)，而IL-33 與IL-4、IL-6 和TGF-β1的表達無相關性(圖3G~圖3I)，表明IL-33參與調控COAD炎癥反應病變區分泌促炎癥細胞因子TNF。

圖3 COAD結腸組織中IL-33和炎癥細胞因子的表達及相關性分析Figure 3 Expression and correlation of IL-33 and inflammatory cytokines in COAD colon tissues

3 討論

炎癥在腫瘤的發生、發展中起著關鍵性作用，近20年的流行病學、遺傳學和藥理學方法的研究數據表明，炎癥促進腫瘤增殖和轉移。在腫瘤的臨床治療中，使用抗炎藥可以改善腫瘤患者的預后狀態，減少手術后傷口炎癥和感染，促進傷口愈合和降低癌癥轉移和復發風險。炎癥反應在COAD的發生、發展中起著重要作用，炎癥相關的細胞因子指標與COAD患者的生存預后密切相關，但炎癥影響COAD患者病程的內在因素分子機制仍未闡明。腸道細胞因子網絡不僅是炎癥和組織平衡的關鍵媒介，而且影響COAD各階段的致癌性，而炎癥細胞因子失衡是炎癥性腸病發病的主要原因。

在尋找可能與腫瘤炎癥發病機制有關的生物標志物時，新的證據指向IL-1家族新成員IL-33，它既是一種雙重功能的細胞因子，又是一種具有調控轉錄功能的細胞核因子，組成性表達在胃腸道、皮膚和肺等屏障組織細胞中，IL-33在炎癥反應和腫瘤的發生、發展及預后方面發揮著重要作用[12-13]。IL-33是多種炎癥性疾病的潛在介質，近年來成為研究腫瘤炎癥機制和治療靶點的新熱點。炎癥是IL-33釋放的主要因素之一，在不同類型的腫瘤中IL-33的表達水平對腫瘤病程的影響呈現明顯的差異性，多數腫瘤患者IL-33的表達水平顯著升高，并與腫瘤發生、發展呈正相關性[14]，IL-33可進一步誘發腫瘤的發展浸潤和轉移。相關的研究表明，結直腸癌患者腫瘤組織中IL-33的表達水平顯著高于正常組織，結腸癌患者外周血中IL-33的水平明顯升高，且與結腸癌病情程度顯著相關[15]。炎癥相關的細胞因子如TNF-α、IL-4和IL-6等在結腸癌病程中發揮作用，表明IL-33和炎癥細胞因子對結腸癌患者的預后具有密切聯系。此外，IL-33 還可以抑制細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制結腸癌細胞的生長[16]。

腫瘤微環境與機體免疫系統Th1/Th2極化有關，腫瘤細胞的分化可抑制Th1型細胞因子的分泌、促進Th2型細胞因子的生成，導致Th1/Th2 失衡和免疫逃逸。Th1 型細胞因子主要有TNF-α、IFN-γ、IL-2 和IL-12等，Th2 型細胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6 和IL-10等。蛋白質的正確空間分布對其功能至關重要，而異位表達、過量表達、點突變和片段缺失往往會導致人類疾病的發生。HPA數據庫已經成為研究人員研究人類組織和細胞中蛋白質定位和表達的寶貴工具。為了進一步探究IL-33和炎癥細胞因子引發COAD的免疫學機制，本研究利用TIMER2.0數據庫和HPA數據庫，聚焦于COAD 中結腸部位的IL-33 和炎癥細胞因子(TNF、IL-4、IL-6和TGF-β1)的表達和相關性分析。通過數據篩選和比對，對COAD結腸組織免疫組化病理圖進行量化統計，分析得出COAD 結腸組織IL-33 和TNF的表達升高，IL-4和IL-6的表達降低，同時COAD結腸組織IL-33與TNF的表達呈正相關性。

IL-33和炎癥細胞因子在COAD結腸組織中表達的差異性可為進一步研究結腸炎癥和結腸癌的臨床治療提供理論基礎。炎癥反應會增加罹患結腸癌的風險，是否在食用者能承受住應激的情況下，通過調節膳食中IL-33等炎癥細胞因子的水平降低結腸癌的發病率，還有待后期進一步探究。