解毒活血方灌腸對潰瘍性結腸炎小鼠結腸炎癥及腸道菌群的影響

胡藍爍 楊先照 王建云 江海燕 劉果 劉元 張雯 思瓔桀 王新月

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種發病機制尚未完全明確的慢性非特異性結直腸炎癥性疾病。目前認為,腸道微環境改變后產生持續異常的免疫反應可能是導致UC發生和發展的重要原因[1]。腸道菌群失調導致的腸道微環境改變主要表現為腸道菌群種類、數量、比例、定位及生物學特性上的變化,通過干預腸道內的菌群可以對UC起到治療作用[2]。解毒活血方為筆者團隊灌腸治療UC的臨床驗方,亦是北中醫三院脾胃病科的協定處方,在減輕UC癥狀、長時間誘導緩解、減少復發方面具有良好的臨床療效[3-4]。以往實驗研究表明,解毒活血方灌腸能夠下調與腸道微生物識別、免疫反應密切相關的Toll樣受體4信號通路相關蛋白的表達,調整促炎因子與抗炎因子水平[5]。在前期研究的基礎上,本課題組繼續以葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)建立的UC小鼠模型為研究對象,延長給藥及觀察時間,觀察解毒活血方灌腸對小鼠腸道微生態的物種、豐度、多樣性及代謝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠,SPF級,7周齡,雄性,體質量(21.2±1.5)g,實驗動物購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,實驗動物合格證號:SCXK(京)2019-0010。本實驗經北京永欣康泰科技發展有限公司實驗動物中心倫理委員會批準(批準號:YXKT2022L008)。動物在溫度(25±2)℃,濕度45%、12小時光照實驗環境下自由飲水和進食,適應性喂養1周。

1.2 實驗藥物

本實驗使用解毒活血方(黃連10 g、黃柏10 g、苦參10 g、五倍子10 g、三七3 g、白及3 g)購自北京中醫藥大學第三附屬醫院藥房,由北京康仁堂藥業有限公司提供(批號:黃連配方顆粒20039981,黃柏配方顆粒21028681,苦參配方顆粒21021431,五倍子21007911,三七配方顆粒21019521,白及配方顆粒21007453)。藥物加蒸餾水充分混勻后,按照60 kg成人和20 g小鼠等效劑量換算比例1∶10,濃縮成含生藥6.12 g/mL的灌腸液,滅菌分裝后于4℃冰箱保存。美沙拉秦灌腸液(德國Dr.Falk Pharma GmbH公司生產,規格:4 g/支,批號:H20150127)。

1.3 主要試劑與儀器

DSS(美國MP Biomedicals公司生產,規格:100 g/瓶,批號:0216011080);OMEGA-soil DNA抽提試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司生產,批號:D5265-01);2%瓊脂糖凝膠(西班牙Bioweste公司生產,規格:100 g/瓶,批號:111860);FastPfu Polymerase(北京全式金生物技術有限公司生產,批號:M20105);AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Axygen公司生產,批號:RH185765);TruSeqTMDNA Sample Prep Kit(美國Illumina公司生產,批號:15055162);NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒(美國Bioo Scientific公司生產,批號:5144-01);MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒(美國Illumina公司生產,批號:15055256)。

移液器(德國Eppendorf公司,型號:Eppendorf N13462C);微型離心機(合肥艾本森科學儀器有限公司,型號:ABSON MiFly-6);小型離心機(德國Eppendorf公司,型號:Eppendorf 5430 R);超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:NanoDrop2000);電泳儀(北京市六一儀器廠,型號:DYY-6C);PCR儀(美國ABI公司,型號:ABI GeneAmp?9700);MISEQ測序儀(美國Illumina公司,型號:Illumina Miseq);旋渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司,型號:QL-901);粉碎研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司,型號:TL-48R)。

1.4 分組給藥與組織取材

80只小鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組,每組20只。各組小鼠均予SPF級動物標準飲食喂養。模型組、西藥組、中藥組小鼠自由飲用蒸餾水配置的3% DSS溶液,連續7天,制備 UC小鼠模型[5]。小鼠逐漸出現大便次數增多伴膿血、體質量下降、進食減少等表現,造模7天后各組動物隨機選取2只驗證造模成功。造模成功后,各組動物給予灌腸處理,每日1次,連續14天。根據小鼠體重換算灌腸劑量為0.02 mL/g,中藥組按12.2 g/kg予解毒活血方混懸液灌腸,西藥組按1.33 g/kg給予美沙拉秦灌腸劑灌腸,模型組及正常組給予相同體積的生理鹽水灌腸。

給藥14天后,經水合氯醛麻醉后在無菌操作臺上打開小鼠腹腔,剖取肛門至盲腸末端的整個結腸組織,于吸水紙上展開并測量長度,沿腸系膜縱向剪開,取結腸中的小鼠糞便置于無菌管內放置-80℃冰箱內凍存,結腸組織經0.9%氯化鈉注射液清洗后放置4%多聚甲醛溶液中固定備用。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況觀察及疾病活動指數(disease activity index,DAI) 實驗期間每天觀察并記錄各組小鼠體質量、飲食飲水量,觀察各組小鼠精神狀態、活動度、毛色光澤程度及排便次數、大便性狀、便血情況。小鼠體重下降百分比:不變為0分,下降1%～5%為1分,5%～10%為2分,10%～15%為3分,大于15%為4分。大便性狀:正常為0分,軟但成形為1分,未成形便為2分,半成型和稀便之間為3分,稀便為4分。血便:潛血陰性為0分,潛血陽性為1分,便中帶血為2分,便中帶血和血便之間為3分,血便為4分。小鼠體質量、大便性狀和便血情況評分總和為DAI。

1.5.2 結腸長度測量及黏膜損傷指數(colonic mucosa damage index,CMDI)評分 測量從小鼠肛門至盲腸的結腸長度,縱向剪開結腸后用放大鏡觀察結腸黏膜形態,進行黏膜損傷指數評分[6],黏膜損傷指標包括粘連(0分:無粘連;1分:結腸與周圍組織輕度粘連,易剝離;2分:結腸與周圍組織重度粘連,剝離困難),潰瘍形成及炎癥(0分:無潰瘍及炎癥;1分:局部充血,無潰瘍;2分:1處潰瘍不伴腸壁充血或增厚;3分:1處潰瘍伴炎癥;4分:≥2處潰瘍伴炎癥;5分:≥2處潰瘍和/或炎癥>1 cm;6～8分:潰瘍和/或炎癥≥2 cm,病變范圍每增加1 cm,計分加1),腺瘤樣占位(0分:無腺瘤;1分:1處腺瘤;2分:≥2處),計算各項總和。

1.5.3 結腸組織學損傷指數(colon histopathological score,CHS)評分 將固定48小時的結腸組織按照脫水、包埋、切片(厚度4 μm)、常規HE染色的順序制作病理切片,光學顯微鏡下觀察各組小鼠結腸組織病理改變,并進行組織學損傷評分,組織學指標包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、纖維化及病變深度,其中炎癥、纖維化按有無及輕重,潰瘍按無、潰瘍<3 mm、潰瘍≥3 mm分別計 0、1、2 分,病變深度按無及達黏膜下層、肌層、漿膜層分別計0、1、2、3 分,各項相加得總分[7]。

1.5.4 小鼠腸道菌群的16S rRNA測序 (1)DNA抽提和PCR擴增:采用Omega soil試劑盒從凍存的小鼠糞便中提取DNA,使用NanoDrop 2000檢測DNA濃度和純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。以338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 為引物對V3-V4可變區進行PCR擴增,擴增程序為:95℃預變性3分鐘,27個循環(95℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒),最后72℃延伸10分鐘。擴增體系為20 μL,包括4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mM dNTPs,0.8 μL引物(5 μM),0.4 μL FastPfu 聚合酶,10 ng DNA模板。(2)文庫構建和Illumina Miseq 測序:使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測,利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。根據Illumina MiSeq 平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。構建文庫步驟:連接“Y”字形接頭,使用磁珠篩選去除接頭自連片段,PCR擴增進行文庫模板的富集,氫氧化鈉變性后產生單鏈DNA片段,利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.5.5 小鼠腸道菌群差異分析 用Qiime tools import插件,將測序所得的原始序列fastq文件,導入為可進行QIIME2后續處理的文件格式。運用QIIME2 dada2插件進行質控、修剪、去噪、拼接,并去除嵌合體后,得到最終的特征序列表格[8]。使用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對到預先訓練好的13_8版本99%相似度的GREENGENES數據庫(根據338F/806R引物對將數據庫修剪到V3V4的區域),得到物種分類信息表[9],用QIIME2 feature-table插件剔除所有污染性的線粒體和葉綠體序列,完成各組小鼠腸道菌群的數據質控和物種注釋。

1.5.6 小鼠腸道菌群多樣性分析 使用QIIME2 core-diversity插件計算多樣性矩陣,采用特征序列水平Alpha多樣性指數中observed OTUs、Chao1指數來評估小鼠腸道菌群物種組成的豐富度和均勻度。同時應用R軟件包“mixOmics”,偏最小二乘判別分析(PLS-DA)計算Beta多樣性指數,包括Bray Curtis、unweighted UniFrac、weighted UniFrac指數),評估包括優勢菌群及稀有菌群在內的各組小鼠腸道微生物群落結構間的差異性[10]。

1.5.7 小鼠腸道菌群代謝功能預測分析 采用PICRUSt軟件對小鼠腸道微生物群體可能的功能組成進行推斷,構建微生物全譜系的基因功能預測譜[11],并通過KEGG、MetaCyc和EC數據庫對功能基因進行注釋,對各組小鼠腸道微生物代謝功能進行注釋。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠排便與體質量變化

造模后各組小鼠均出現大便次數增多、便質不成形、大便帶血等排便異常,同時伴有活動量及進食減少、體重減輕、體毛脫落。經過14天治療后,西藥組、中藥組血便減少,大便逐漸成形,進食量增加,精神狀態改善,體重較前恢復。對照組小鼠大便性狀及排便次數同前,進食量及體重繼續下降。實驗過程中,造模期間各組小鼠無死亡,治療期間中藥組灌腸死亡1只。

2.2 各組小鼠結腸長度、DAI、CMDI、CHS評分

與正常組比較,模型組小鼠結腸長度縮短(P<0.05),DAI、CMDI、CHS評分升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組及西藥組小鼠結腸長度增加(P<0.05)、DAI降低(P<0.01),中藥組CMDI、CHS評分降低(P<0.05);與西藥組比較,中藥組DAI、CMDI評分降低(P<0.01,P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠結腸長度、DAI、CMDI、CHS比較

2.3 結腸組織病理組織學改變

正常組小鼠結腸組織結構完整,未見潰瘍及壞死,結腸黏膜上皮完整,可見明顯的隱窩和大量杯狀細胞。模型組小鼠黏膜層完整性受損,潰瘍突破黏膜肌層,可見隱窩萎縮和杯狀細胞大量減少,黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤。西藥組小鼠結腸黏膜可見散在淺潰瘍,仍有較多炎性細胞浸潤,可見隱窩膿腫。中藥組小鼠可見大量杯狀細胞,結腸黏膜及黏膜下層少見炎性細胞浸潤,隱窩結構恢復。見圖1。

注: A 正常組;B 模型組;C 西藥組;D 中藥組。

2.4 各組小鼠腸道菌群門屬水平主要物種相對豐度比較

經16S rRNA技術測序后共得到9628個操作分類單元(operational taxonomic units, OTU),包括11個門,109個屬。在門水平,厚壁菌門與擬桿菌門為優勢菌群(總體豐度分別為49.23%、34.90%),其次為疣微菌門、變形菌門和放線菌門。在屬水平,總體豐度大于10%的優勢菌群依次為擬桿菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬、Turicibacte菌屬、Allobaculum菌屬、AKK菌屬(總體豐度依次為19.2%、16.6%、12.2%、11.6%、10.4%、10.2%),見表2。其中,正常組優勢菌群為乳桿菌屬及AKK菌屬;模型組擬桿菌屬、梭菌屬為優勢菌群,與正常組比較,豐度升高(P<0.05,P<0.01);西藥組擬桿菌屬及Allobaculum菌屬為優勢菌群,與模型組比較,豐度升高(P<0.05);中藥組以擬桿菌屬、梭菌屬、Turicibacter、Allobaculum菌屬為優勢菌群,與西藥組比較,擬桿菌屬豐度降低(P<0.05),Allobaculum、Turicibacter菌屬豐度升高(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表2 各組小鼠腸道菌群門水平主要物種相對豐度比較

表3 各組小鼠腸道菌群屬水平主要物種相對豐度比較

2.5 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較

對各組小鼠腸道菌群相對豐度均>1%者進行組間差異性分析。與正常組比較,模型組Allobaculum菌OTU升高(P<0.05),Turicibacter菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、Mucispirillum菌、消化鏈球菌、薩特氏菌、腸球菌OTU升高(P<0.01);AKK菌、Arthromitus菌、乳桿菌OTU降低(P<0.01)。與模型組比較,西藥組雙歧桿菌、AKK菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),腸球菌OTU降低(P<0.05),梭狀芽孢桿菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.01);中藥組Turicibacter菌OTU升高(P<0.05),雙歧桿菌、AKK菌、Allobaculum菌OTU升高(P<0.01),乳桿菌、梭狀芽孢桿菌、Mucispirillum菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.01),腸球菌OTU降低(P<0.05)。與西藥組比較,中藥組雙歧桿菌、Turicibacter菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),乳桿菌、Mucispirillum菌OTU降低(P<0.01),消化鏈球菌、薩特氏菌OTU降低(P<0.05)。見表4～5,圖2。

注:cladogram圖由內到外,對應界門綱目科屬不同的分類層級,層級間連線代表所屬關系。每個圓圈節點代表一個物種,節點為黃色代表在分組間差異不顯著,不為黃色則代表該物種是對應顏色分組的特征微生物(在該分組豐度顯著較高)。有顏色的扇形區域為特征微生物的下屬分類區間。

表4 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較個)

表5 各組小鼠腸道菌群組間OTU差異比較個)

2.6 各組小鼠腸道菌群多樣性比較

與正常組比較,Alpha多樣性指數Observed OTUs、Chao1下降(P<0.05),Beta多樣性距離Bray Curtis、Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac縮小(P<0.01);與模型組比較,中藥組Bray Curtis增大(P<0.01),Observed OTUs、Chao1升高(P<0.05),西藥組Bray Curtis、Unweighted Unifrac增大(P<0.05);與西藥組比較,Chao1、Bray Curtis增大(P<0.05)。見表6。

表6 各組小鼠腸道菌群Alpha及Beta多樣性差異比較

2.7 各組小鼠微生物群落代謝功能預測比較

與正常組比較,模型組碳水化合物代謝降低(P<0.05),AMPK信號通路表達、脂類、萜類、聚酮代謝降低(P<0.01),氨基酸、維生素、輔酶代謝、多糖生物合成與代謝升高(P<0.01)。與模型組比較,西藥組AMPK通路表達、碳水化合物、多糖生物合成與代謝升高(P<0.05),萜類、聚酮代謝降低(P<0.05);中藥組AMPK通路表達、碳水化合物代謝升高(P<0.05),脂類、萜類、聚酮代謝升高(P<0.01),氨基酸、維生素、輔酶代謝、多糖生物合成與代謝降低(P<0.05)。與西藥組比較,中藥組脂類、萜類、聚酮代謝升高(P<0.01),維生素、輔酶代謝降低(P<0.05),多糖生物合成與代謝降低(P<0.01),見表7。

表7 各組小鼠腸道微生物群落代謝功能預測比較

3 討論

鑒于UC具有遷延難愈,邪氣較甚,深伏難解的特點,結合中醫毒邪學說與絡病學說,針對“毒邪深伏、絡病難愈”的特征[15],課題組認為UC存在毒邪內聚,蘊結腸腑,入血入絡的微觀病機[16]。邪氣蘊結不解謂之毒,UC易感個體因先天稟賦差異,加之外感六淫、飲食不節、情緒失調、過度勞累等因素,導致脾胃功能失常,水濕滯留腸間,久羈不去,化生濕熱。雖然現代醫學對于UC的發病機制尚未明確,但腸道微生態菌群與結腸炎癥的相關性問題已成為業界專家關注的焦點。已有研究證實,腸道微生物在維持宿主黏膜屏障結構的完整、營養代謝、免疫調節及對病原體的防御等方面均具有重要作用。腸道微生物種群的多樣性、空間或數量發生改變,益生菌數量減少、病原菌過度生長等腸道菌群失調可能是導致UC發生和發展的關鍵因素[2]。腸道內益生菌減少,條件致病菌增多,并由此引發炎癥反應及代謝障礙可以視作毒邪化生的表現。

目前研究發現,乳桿菌、Turicibacter菌、AKK菌、Arthromitus菌、雙歧桿菌為常見的腸道益生菌,在構建宿主腸道屏障、維持腸道菌群生態平衡、阻止致病菌對腸道的入侵和定植、控制內毒素、調節機體免疫力、提高營養利用度上均具有重要作用[17-21]。擬桿菌、梭菌、消化鏈球菌、腸球菌為人與鼠腸道的基石菌群,能夠吸收和降解膳食中人體不能夠降解的多種植物多糖,參與脂肪代謝,調節細菌毒素的產生并增強宿主固有的免疫反應等,但同時也是機會致病菌,可以產生毒素,引起炎癥,誘發或加重感染[21-24],其中薩特氏菌、Allobaculum菌、Mucispirillum菌對腸道炎癥有促進作用[25-27]。腸道微生物還可以通過發酵不能被宿主小腸吸收利用的食物殘渣和上皮細胞分泌的內生黏液來發揮代謝作用[28]。一方面,腸道內微生物可將各種多糖、寡糖,代謝為短鏈脂肪酸,為結腸上皮細胞提供能量來源,還能調節葡萄糖代謝,降低血糖與血脂[29]。另一方面,腸道內微生物在厭氧的條件下也能代謝肽和蛋白質產生短鏈脂肪酸,但同時會生成如氨、胺、苯酚、吲哚等有害物質,即腐敗作用[30]。此外,腸道細菌還參與了多種維生素的合成以及鈣、鎂、鐵等離子的吸收,參加萜類及聚酮代謝,發揮抗炎、抑菌及維持細胞穩定的作用[31]。

本研究中,UC模型小鼠疾病活動指數升高、結腸長度縮短,結腸黏膜及組織學損傷評分均反映了小鼠的結腸炎癥情況。經藥物干預后,美沙拉秦及解毒活血方灌腸均有有效減輕小鼠結腸炎癥,解毒活血方治療作用更為顯著。腸道菌群失調可能是UC的發病機制之一,本實驗采用16S rRNA技術對UC小鼠腸道菌群進行分類測序后發現,各組小鼠均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門為優勢菌群,與既往研究結果一致[32]。在屬水平,模型組小鼠腸道中的益生菌Arthromitus菌減少,而梭菌屬、消化鏈球菌屬、薩特氏菌屬、腸球菌等機會致病菌屬增多,增加了結腸炎癥發生的幾率;西藥組及中藥組小鼠腸道內雙歧桿菌屬增多,梭狀芽孢桿菌、腸球菌屬、薩特氏菌屬等機會致病菌減少;中藥組小鼠腸道菌群中益生菌的增多及機會致病菌的減少優于西藥組。其次在物種組成的多樣性上,模型組小鼠物種組成的豐富度和均勻度指數均下降,優勢物種與稀有物種的多樣性差異距離均縮小,經中藥干預后,小鼠腸道菌群物種組成的豐富度和均勻度指數均回升,優勢物種與稀有物種的多樣性差異距離均恢復。在各組小鼠代謝功能預測中,模型組小鼠無論是與能量相關的AMPK信號通路表達、還是碳水化合物、脂類、萜類、聚酮代謝、共棲生物合成與代謝均較空白小鼠降低,但與腐敗相關的氨基酸代謝升高。與模型組比較,西藥組、中藥組小鼠AMPK通路表達、碳水化合物、萜類、聚酮代謝升高,且中藥組脂類代謝高于西藥組,氨基酸代謝低于模型組。說明中藥在恢復碳水化合物、脂類等對身體有益的代謝功能上療效均優于西藥組。

綜上,經DSS造模后,模型組小鼠除疾病活動指數升高、結腸長度縮短、黏膜炎性損傷外,還出現益生菌種群減少,條件致病菌數量增加,物種多樣性及差異性下降,能量代謝降低,腐敗作用增加,這些變化可能是UC毒邪化生的機制之一,解毒活血方灌腸能提高小鼠菌群的物種豐度,促進益生菌的生長,抑制機會性致病菌或有害菌的定殖,提高腸道優勢菌群及稀有菌群的多樣性,改善微生物群落的代謝功能,維持腸道菌群的穩態,這可能是解毒活血方減輕DSS造模UC小鼠結腸炎癥的作用機制。但實驗總體觀察時間較短,中藥組小鼠腸道菌群同正常組小鼠仍有較大差異,仍需通過制備慢性UC模型、延長觀察時間來進一步驗證解毒活血方抗炎、抗復發的機制。