基于核轉錄因子-κB信號通路探討鐵包金巴布膏治療腰椎間盤突出癥的作用機制

安娟 李振宇 常裕紳 張子鳴 葉子豐 匡浩銘 匡建軍 戎寬

腰椎間盤突出癥(lumber disc herniation,LDH)是指由于椎間盤組織在外力或退行性病變的作用下,纖維環破裂,髓核向外突出,導致單側或雙側坐骨神經受壓或受刺激而引起的腰背痛、下肢放射性疼痛、麻木等為主要癥狀的一種疾病[1]。相關研究發現[2],疼痛是由于髓核突出誘導自身免疫介導所產生的炎癥反應而引發的。大部分患者的腰部疼痛呈自限性,所以臨床上多以保守治療作為本病的首選方法[3]。中醫學外治法具有操作方便、毒副作用小、療效確切等優點,患者易于接受[4]。《理瀹駢文》指出:“外治之理,即內治之理;外治之藥,即內治之藥。”藥膏外貼屬于體表給藥,經皮膚吸收后,能讓藥效直至病所。鐵包金巴布膏為湖南省中醫藥研究院匡建軍教授經過長期臨床實踐而得出的經驗膏方,在臨床上能有效緩解腰椎間盤突出癥患者的癥狀[5],前期也有實驗[6]表明此中藥藥膏有確切的抑制炎癥的作用,但其對LDH的作用機制尚未研究。故本研究采用自體髓核移植法制備大鼠LDH模型,探討鐵包金巴布膏的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級3月齡雄性SD大鼠40只,體質量200～250 g,購自湖南中醫藥大學實驗動物中心,合格證號:SYXK(湘)2019-0009。所有大鼠均飼養于湖南中醫藥大學動物房大鼠實驗室,室溫23～25℃,濕度50%～60%,12小時交替明暗周期,標準飼養。本實驗通過湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物

鐵包金巴布膏由湖南省中醫藥研究院制劑室制備,組成:鐵包金10 g、生川烏6 g、生草烏6 g、肉桂8 g、木瓜4 g、三棱4 g、莪術4 g、木鱉子4 g、木通4 g、當歸4 g、白蘞4 g、赤芍4 g、透骨草4 g、血竭2 g。將本處方藥物濃縮后水提,在水域恒溫中加熱攪拌均勻,再涂至無紡布上,蓋襯。規格7 cm×9.5 cm每片,每10 g藥膜中含2 g生藥材。

雙氯芬酸二乙胺乳膠劑(扶他林軟膏)(北京諾華制藥有限公司,批號:VP2727,規格20 g/支)。

1.3 主要實驗試劑與儀器

蘇木素、伊紅(珠海貝索細胞科學技術有限公司,貨號分別為BA4097、BA4098);大鼠腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒(睿信生物科技有限公司,貨號分別為RX302058R、RX302869R);超純總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉錄試劑盒(上海近岸生物科技有限公司,貨號分別為E096-01A、E047-01B)。PW-812型全自動酶標洗板機、MB-530型多功能酶標分析儀(深圳市匯松科技發展有限公司),GL-88B型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),5810R型臺式高速離心機(Eppendorf 艾本德公司),HS50型病理切片掃描儀,CFX96型Real-Time PCR檢測儀(美國BIO-RAD伯樂公司)。

1.4 實驗方法

所有大鼠適應性喂養7天后,采用隨機數字表法從40只大鼠中抽取10只作為正常組。剩余30只建立LDH大鼠模型:參照Cho HK等[7]自體髓核移植法建立動物模型,術后切口處理:手術部位涂抹少量紅霉素,避免術后傷口愈合過程中瘙癢大鼠自行撕咬;傷口清潔敷料包扎后用網套固定,避免大鼠過度活動導致傷口暴露感染。術后3天內所有大鼠均左側臀部肌肉注射青霉素,400000 IU/kg,1次/日,以預防感染。正常組不做處理。術后觀察大鼠情況,若存在右下肢腫脹,行走時無力代償性拖動或出現跛行即表明造模成功。造模成功后第3天,采用隨機數字表法將其分為模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組3組,每組10只,進行給藥。按照體表面積比換算出鐵包金巴布膏的大小為1.54 cm×2.09 cm[8],外貼L5椎旁,每日上午1次,6小時后蘸生理鹽水擦凈;陽性藥物組以扶他林軟膏外涂L5椎旁,每日上午1次,6小時后蘸生理鹽水擦凈;正常組及模型組均以生理鹽水涂抹,每日上午1次,共給藥30天。

1.5 神經功能測定

神經功能評分依照Siegal的方法[9],分別觀察大鼠干預前、干預第10天、干預第20天、干預第30天右側后肢的神經功能情況。該功能評分共有6級:0級,運動正常,記2分;1級,甩尾無力,記4分;2級,后肢無力,行走有輕度困難,記6分;3級,后肢無力,行走時存在明顯不穩定性,記8分;4級,站立不穩,但后肢可移動,記10分;5級,癱瘓,后肢無自主移動,記12分。

1.6 取材

各組大鼠給藥干預30天后,禁食1小時,麻醉大鼠,腹主動脈采集血液,每只采取6 mL左右,并暴露右側L5神經根,冷凍臺上取受壓神經根后處死大鼠。所取血液常溫靜置45分鐘后,4℃,3000 r/min離心15分鐘取上清,通過液氮轉移到-80℃冰箱保存用于酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。再取L5神經根組織,分為2份,一份存放在凍存管中,-80℃冰箱保存用于實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)檢測,另外一份用多聚甲醛固定用于蘇木精-伊紅(hematoxylin -eosin, HE)染色檢測。

1.7 指標檢測

1.7.1 HE染色觀察神經根的形態學 先將取下的L5神經根組織放入4%多聚甲醛中固定2天后脫鈣,再進行石蠟包埋,切片(5 μm),脫蠟后HE染色。每張切片均按要求嚴格進行,最后中性樹膠封片,常溫晾干后在顯微鏡下觀察大鼠L5神經根形態的變化。

1.7.2 ELISA檢測血清炎癥因子IL-1β及TNF-α含量 取待測血清,冰上解凍,按照說明書進行操作,不同濃度標準品和血清樣品各加50 μL,設空白孔及待測樣品孔,將板放置37℃溫箱孵育后,加底物A、底物B各50 μL,顯色后再加終止液50 μL,終止反應,在酶標儀中讀取并記錄OD值。

1.7.3 qRT-PCR檢測髓樣細胞分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)、核轉錄因子-κB(nuclear factor κ B,NF-κB)P65的mRNA表達水平 將凍存的大鼠神經根組織快速剪斷后轉移到一個干凈的1.5 mL離心管中,加入500 μL Buffer TL,用研磨棒研磨,再加500 μL Buffer TL、200 μL lBuffer EX及70%無水乙醇等混勻攪拌,取混合液600 μL加入至核酸純化柱中,反復離心后,棄純化柱,留洗脫的RNA。提取總RNA后,將純化的RNA逆轉錄成cDNA,均按說明書的步驟進行。最后在熒光定量器中設置反應時間:95℃ 1分鐘,95℃ 20秒,60℃ 20秒,72℃ 30秒。查看溶解曲線圖,統計Ct值,采用2-△△Ct計算法計算各組基因的相對表達量。以β-actin為內參引物,所有引物均在上海生工生物股份有限公司合成,詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較

干預前,與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組神經功能評分無統計學差異(P>0.05)。在干預第10、20和30天,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組神經功能評分較模型組下降(P<0.05)。鐵包金巴布膏組、陽性藥物組在治療第10、20和30天的神經功能評分均較干預前下降(P<0.05)。提示干預前大鼠LDH模型神經功能評分升高,經鐵包金巴布膏干預后,神經功能評分下降。見表2。

表2 各組LDH模型大鼠干預前后的神經功能評分比較分)

2.2 各組大鼠神經根形態觀察

HE染色結果顯示,正常組大鼠神經根結構形態規則,細胞核均勻,核仁清晰,胞漿內的尼氏小體均勻排列;模型組結構形狀不規則,細胞腫脹,細胞漿內存在較多的空泡狀改變,尼氏小體排列不均;與模型組相比,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組結構形態較規則,細胞核較均勻,胞漿空泡狀數量較少,尼氏小體排列較均。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C 鐵包金巴布膏組;D 陽性藥物組。

2.3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較

與正常組比較,模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組的大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均降低,差異有統計學意義(P<0.05);與鐵包金巴布膏組比較,陽性藥物組的大鼠血清IL-1β及TNF-α含量水平均降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組LDH模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量比較

2.4 各組大鼠神經根組織NF-κB p65及MyD88的mRNA表達比較

與正常組比較,模型組、鐵包金巴布膏組、陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達均升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,鐵包金巴布膏組、陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達均降低,差異有統計學意義(P<0.05);與鐵包金巴布膏組比較,陽性藥物組NF-κB p65及MyD88的mRNA表達均降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組LDH模型大鼠神經根組織NF-κB p65、MyD88的mRNA表達比較

3 討論

中醫學將LDH歸屬于“腰痛”“痹證”范疇,是由于受風寒濕之邪困阻經絡導致經氣不行,氣滯而血瘀,加之正氣不足,邪氣乘虛而入引發的腰痛。本病的治療以祛風除濕、扶正祛瘀為主。鐵包金巴布膏主要的藥物包括鐵包金、生川烏、生草烏、肉桂、三棱、莪術、木瓜等,方中鐵包金又名多花勾兒茶,始載于《嶺南采藥錄》,其性平,味苦、澀,具有益氣固腎、消腫解毒、化瘀止血等功效。藥理學研究表明其具有鎮痛抗炎、抗氧化的作用,這和鐵包金內含有黃酮類和多酚類成份密切相關[10]。生川烏、生草烏性熱、味苦,具有祛風除濕、溫經散寒止痛等功效。有學者研究發現,這兩味藥能降低炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α的表達,抗炎效果明顯[11-12]。肉桂,味辛、甘,性大熱,具有溫經通脈、散寒止痛等功效。有研究者應用數據挖掘技術,發現肉桂通過正調控一氧化氮生物合成過程、細胞遷移、褐色脂肪細胞分化等治療LDH,與其抗氧化、抗炎抗菌的藥理作用一致[13]。三棱味苦,性平;莪術味苦,性溫,均具有行氣止痛等功效,是常用的藥對。三棱乙酸乙酯萃取物的鎮痛效果最明顯,三棱莪術復方的抗炎活性更顯著[14]。木瓜味酸,性溫,具有舒筋活絡等功效,有藥理研究顯示木瓜的提取物木瓜苷有較強的鎮痛抗炎及提高免疫力的作用[15]。扶他林軟膏是常用的外搽藥,其通過抑制環氧酶,阻斷前列腺素的合成,減少外周痛覺感受器刺激而發揮鎮痛作用,是恰當的陽性藥物。

NF-κB信號通路是一種經典的炎癥調節通路,當NF-κB信號通路激活后,可誘導炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達,加重靶器官炎癥反應[16]。有學者的研究證實,NF-κB信號傳導在調節慢性炎癥和壓力誘導的椎間盤退變中起重要作用[17]。NF-κB p65似乎是激活促炎介質表達的主要途徑,因此阻斷此種途徑特有的p65亞基可能是抑制炎性的最佳策略[18]。MyD88是Toll樣受體和1L-1R成員炎癥信號中經典的銜接蛋白[19],Liu等[20]研究者使用MyD88條件性敲除小鼠,建立慢性壓迫性神經痛模型,發現慢性壓迫損傷誘導背根神經節神經元中MyD88和趨化因子C-C基序配體2表達的上調,巨噬細胞浸潤到背根神經節中,以及野生型小鼠脊髓背角中的小膠質細胞活化,但在條件性基因敲除小鼠中未見明顯變化,說明MyD88能上調外周和中樞神經系統的炎癥反應,并維持持續的神經病理性疼痛。

此前的實驗研究顯示,鐵包金巴布膏可降低LDH大鼠模型的脊背根神經根的炎性細胞因子磷脂酶A2的活性,減緩腰椎間盤突出癥大鼠的癥狀[6],但未具體研究作用機制。磷脂酶A2是一種炎癥介質和致痛物質,炎癥作為一種正常的防御反應,能應對病原微生物及外部損傷,而炎癥應答為機體識別受體識別病原微生物分子模式及外部損傷分子模式,通過啟動相關的信號傳導,可激活轉錄因子,調控基因表達,最后引發炎癥,NF-κB就為參與炎癥反應相關表達的重要轉錄因子之一[21]。故此次研究以NF-κB為切入點,更深入的探討鐵包金巴布膏治療LDH大鼠的作用機制是否與調節NF-κB信號通路有關。

本實驗結果表明,干預前后各時間點模型組、鐵包金巴布膏組和陽性藥物組大鼠神經功能評分依次降低,提示經鐵包金巴布膏和陽性藥物治療后大鼠損傷的神經組織逐漸修復;HE染色結果顯示,模型組大鼠神經根結構不規則,神經元細胞腫脹,胞漿內存在較多空泡狀改變,經鐵包金巴布膏和陽性藥物治療后此類病理改變較少,提示鐵包金巴布膏可減輕大鼠受損腰部神經根病理變化;鐵包金巴布膏組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及神經根組織中的NF-κB p65、MyD88的mRNA相對表達量顯著下降,提示鐵包金巴布膏通過下調NF-κB信號通路中相關分子的表達水平,減少炎癥因子的釋放,起到鎮痛的作用。

綜上所述,鐵包金巴布膏治療LDH可能與抑制NF-κB信號通路相關,這可能是鐵包金巴布膏起到治療作用的機制之一。本實驗應用的是中藥復方,其膏藥成分復雜,作用機制存在多樣性,且僅驗證了鐵包金巴布膏對NF-κB信號通路的調節作用,無法全面系統地揭示鐵包金巴布膏治療LDH的科學內涵。因此,今后將進一步探討鐵包金巴布膏治療LDH的其它參與調節的信號通路,并探索出其治療LDH的主要活性成分。