貝母藥材中的生物堿類化學成分與藥理活性分析

白 玉，張素紅，張會麗

（鄭州工業應用技術學院 藥學與化學工程學院，河南新鄭 451100）

貝母為多年生草本植物，其鱗莖供藥用，能止咳化痰、清熱散結。貝母藥材作為常見的中藥，其有效成分復雜，研究其藥理活性，可在臨床實踐中發揮顯著的作用。中藥貝母的有效化學成分中，已分離檢驗出的生物堿化合物多達100余個，主要包括異甾體生物堿與膽甾衍生物。異甾體生物堿分為西藜蘆堿類和介藜蘆堿類；膽甾衍生物分為白藜蘆堿類和茄次堿類。除此之外，川貝母中還含有皂苷、萜類、甾體、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、烯烴類化合物、醇類化合物、呋喃類化合物、酮類化合物、烷烴類化合物和無機元素等多種成分。川貝母不僅具有良好的止咳化痰功效，而且能養肺陰、宣肺、潤肺而清肺熱，是一味治療久咳痰喘的良藥，因此，在許多治療急性氣管炎、支氣管炎、肺結核等病癥的中藥方劑或中成藥制劑中都有川貝，如蛇膽川貝露、川貝枇杷露等，以增強治療疾病的效果[1]。基于生物堿及其藥物活性的研究中，對其抗腫瘤藥理活性進行研究，能夠為貝母的臨床藥用價值提供參考。

1 材料和方法

1.1 一般材料

擇取A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460非小細胞肺癌（肺癌的常見臨床分期，包括鱗狀細胞癌、大細胞癌和腺癌，相比其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉移相對較晚）細胞株資料進行研究，通過 UHPLC-QTOF-MS/MS 結合細胞代謝組學技術觀察貝母提取物對腫瘤細胞增殖的影響，從而明確貝母對不同種類非小細胞肺癌細胞株的抗腫瘤作用。

取手術切除獲得的23例非小細胞肺癌組織，1 h內移植于NOD/SCID 小鼠或BALB/c 裸鼠皮下，觀察移植瘤成瘤情況，測量移植瘤體積，繪制生長曲線圖，計算成瘤率、成瘤潛伏時間和成瘤時間，分析并比較移植成瘤組和未成瘤組所對應患者的相關臨床病理指標，并取移植成瘤組和所對應患者的組織標本進行病理學分析。

1.2 方法

將中藥川貝母的果肉和果皮分開，通過比較不同提取溶劑、不同提取體積、不同提取方法制成待測樣品，確定待測樣品的最終制備條件。建立中藥貝母待測樣品的方法學，通過UHPLC-Q-TOF-MS 鑒定待測樣品的主要成分，并測定小鼠試樣血清中多種生物堿的濃度，計算其藥動學參數。通過細胞侵襲實驗與遷移實驗，觀察貝母提取物對A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460 的遷移及侵襲力是否有抑制作用。

（1）將貝母粉碎，過80～120 目篩，加入原料量5～10 倍的50%～95%乙醇溶液，40～50 ℃浸漬提取3～5 次，合并提取液，真空濃縮至原體積的3%～10%，室溫放置24 h，沉淀除糖，過濾，母液真空濃縮至干，加原料藥量0.4～0.6倍的水溶解，所得溶液通過預處理的大孔吸附樹脂吸附，流速0.8～1.2 mL/min，吸附完畢，先用水洗脫，洗脫液棄去，再用乙醇溶液洗脫，流速3.0～10.0 mL/min，至流出液無生物堿反應，減壓濃縮，干燥，得貝母總生物堿。

（2）貝母提取物對不同種類非小細胞肺癌細胞株的藥理活性的研究：培養非小細胞肺癌細胞A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460，以不同濃度的貝母提取物為實驗組，以等量的0.9%NaCl作為對照組，采用UHPLC-QTOF-MS/MS 結合細胞代謝組學技術觀察貝母提取物對腫瘤細胞增殖的影響，并以流式細胞儀對細胞凋亡情況進行觀察。

UVB 距小鼠30 cm 處照射。供試藥物貝母生物堿提取物陽性對照藥環耙明（cyclopamine），儀器UV 放射裝置（Daavlin Co.，Bryan，OH），試驗方法用B 波段UV 照射小鼠240 mJ/cm2一周三次，直至有明顯可見的皮膚腫瘤出現，停止照射。口服給藥20周，記錄每周的腫瘤情況。然后取小鼠背部皮膚，以從組織學上研究腫瘤情況。于4℃將組織浸于0.2%戊二醛/2%甲醛-1*PBS 20 min，然后用1*PBS 洗兩次。將組織在37℃置于含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的95%鐵緩沖液中，放置24 h，以患基底細胞癌（BCC）表示部位的面積作為觀察指標。

2 結果

2.1 本次配藥方案

本次實驗的配藥方案見表1。

表1 本次實驗配藥方案

2.2 不同濃度的貝母醇提取物對腫瘤細胞的增殖抑制率

A549和NCI-H157的侵襲轉移能力越強，16HBE及NCI-H460次之，而貝母藥材中的生物堿類化學成分的抗腫瘤藥理活性突出，見表2。

表2 不同濃度的貝母醇提取物對6種腫瘤細胞的增殖抑制率（%）

3 討論

貝母的藥理作用廣泛，在已證實的藥物活性研究中，具有顯著的抗炎作用。貝母含有多種生物堿活性成分。既往研究的相關結果證實，貝母具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、神經保護、鎮痛、抗氧化、藥理活性涉及抗炎、鎮痛、降壓、平喘、抗血栓、膽堿酯酶抑制、抗病毒等作用[2]。

從表2 的結果中，表明了在同一種腫瘤的抗腫瘤研究中，基于中藥貝母化學成分和藥理作用的開發，在臨床應用實踐中具有突出的生物活性[3]。川貝母通過JAK-STAT 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路及鞘脂信號通路等多條通路，作用于EGFR、EGF、CDC42、RHOA、KRAS、CDK1、PLK1、CDK2、CCNB1靶點發揮治療NSCLC 的作用。川貝母通過多種化學成分、靶點和通路的協同作用，發揮治療哮喘和NSCLC 的作用。采用細胞代謝組學手段，分析了貝母非小細胞肺癌A549增殖的作用機制，找出了貝母主要成分中影響較大的代謝通路等生物過程[4]。伊犁貝母中含有豐富的化學成分，生物堿類成分為其主要活性成分。體外抗腫瘤活性篩選結果提示了伊犁貝母具有開發抗腫瘤新藥的潛力，并在目標細胞株，尤其是腫瘤細胞株的抗腫瘤機制上，以不同的體外抑制活性實驗，在不同化合物中的IC50值（衡量藥物誘導凋亡的能力）抑制作用不同。抑制活性研究表明，對Hela 細胞的抑制效應突出，IC50值最高為16.9 μm。應用于甾體生物堿總含量的測定方法主要有分光光度法-酸性染料比色法、酶聯免疫吸附法、滴定法等；包括HPLC-UV，HPLC-ELSD，HPLC-MS 和HPLC-CAD 等，為研究其藥物活性提供了依據。

動物實驗的研究表明，單次灌胃給藥，確定小鼠的最小致死量為2 g/kg；具有一定舒張作用的受試物分別為：FPSA11、FPSA07、FPSA03、FPSA02、FPSA06、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ；在初篩基礎上進行了平喘功效的研究，受試物的拮抗作用從強到弱依次為：FPSA02 ＞氨茶堿、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ＞FPSA07＞FPSA03、硝苯地平；伊貝母提取物0.5 g/kg 能夠在延長咳嗽潛伏期、減少咳嗽次數、促進酚紅分泌方面組間比較具有顯著性差異。貝母生物堿可能通過調節細胞核受體活性、激活轉錄因子活性、調節G 蛋白偶聯的神經遞質受體活性、調節乙酰膽堿受體活性和類固醇激素受體活性等發揮作用；KEGG通路分析顯示，平貝母生物堿可能通過TNF 信號通路、IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路、MAPK 信號通路等發揮作用。分子對接結果顯示，平貝母生物堿與抗炎蛋白具有較低的結合能。貝母總生物堿、總核苷抑制P-gp 的外排活性，呈現濃度依賴性；浙貝母總生物堿、總核苷低劑量組Calcein 熒光比率為（134.96±11.91）%、（126.89±10.42）%， 顯著高于空白組（100.00±11.49）%（P＜0.05）。浙貝母總生物堿、總核苷高劑量組Calcein 熒光比率為（209.72±9.44）%、（162.42±7.83）%，顯著高于空白組（100.00±11.49）%。浙貝母總多糖低、高劑量組與空白組無顯著差異。

從藥物活性化作用來講，貝母具有多種藥理活性，其提取物及活性成分具有止咳，化痰，平喘，解痙，鎮靜，弛豫回腸，抗腫瘤，擴瞳，興奮子宮，正性肌力，降血壓，抗凝，擴張冠狀動脈的突出功效。貝母屬植物中含有許多類化學物質，如生物堿類、皂苷類等，通常認為貝母生物堿是其主要有效成分，為評價貝母質量，常通過貝母生物堿的含量高低作為活性強弱的關鍵性標識。貝母生物堿提取物在制備治療基底細胞癌及其他腫瘤藥物中的應用，其作為中藥材的機理主要是通過區分出腫瘤細胞，并使其死亡，從而達到治療效果。同時能保留正常的組織細胞（包括正常表皮基層和毛囊的未被區分的其他細胞）。由于貝母生物堿提取物引起腫瘤細胞死亡的原因是通過非基因毒性機制，因此不同于放射治療和化學療法那樣，它們是通過破壞DNA 來發揮作用，對正常細胞也帶來了殺傷。依據該機理，貝母生物堿提取物特別適用于癌癥治療，能治療基底細胞癌以及其他如髓質母細胞瘤、橫紋肌瘤、纖維肉瘤、消化道腫瘤和小細胞肺癌等通過hedgehog/圓滑信號傳導途徑來繁殖細胞和防止細胞凋亡的腫瘤。總之，結合表2和相關學者的資料，證實了貝母藥理活性作用效果突出，不同濃度的提取物的實驗結果和藥理作用分析等表明了該藥物在臨床抗腫瘤研發領域的突出優勢。

4 結束語

貝母提取物的藥理活性與藥物提取濃度呈正相關，生物堿類化學成分提取率越高，藥物活性成分越強。臨床通過采用技術手段對其生物堿化學成分進行定量和定性分析，并在實際的藥理活性研究領域中被證實為具有推廣應用價值的藥材。