衣康酸酐抗原修復液在改善前處理不佳組織的免疫組織化學染色結果中的應用研究

陳麗雅 王鳳翔 鄒瓊瑜 廖鴻力

[摘要]?目的?探討衣康酸酐抗原修復液改善前處理不佳組織免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）染色結果的效果。方法?收集2022年3～5月溫州市中心醫院術后病理標本68例，其中乳腺癌19例，腸癌32例，扁桃體17例。模擬前處理不佳的組織處理流程制作組織蠟塊，每個病例每種標記抗體切片2張，根據隨機數字表法分為對照組（使用乙二胺四乙酸抗原修復液）和實驗組（使用衣康酸酐抗原修復液），對比兩組的免疫組化染色結果。結果?通過實驗選擇4mmol/L的衣康酸酐作為抗原修復液。實驗組與對照組的敏感度比較差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組免疫組化染色結果的特異性優良率顯著高于對照組（92.48%?vs.?76.69%，χ2=25.43，P<0.05）；實驗組免疫組化染色的細胞形態顯著優于對照組（χ2=13.60，P<0.01），對照組普遍出現皺褶、局部掉片、細胞腫大甚至嚴重變形、細胞膜/質/核定位不清晰；而實驗組皺褶較少，幾乎無掉片現象，細胞形態相對完整，細胞膜/質/核定位相對清晰。結論?當組織固定不及時或脫水流程出現問題，建議使用衣康酸酐抗原修復液以獲得特異性及細胞形態較好的免疫組化染色結果。

[關鍵詞]?衣康酸酐；免疫組織化學；固定；非特異性結合

[中圖分類號]?R446.8??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.016

Application?of?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?in?improving?immunohistochemical?staining?results?of?poorly?pretreated?tissues

CHEN?Liya，?WANG?Fengxiang，?ZOU?Qiongyu，?LIAO?Hongli

Department?of?Pathology，?Wenzhou?Central?Hospital，?Wenzhou?325000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?in?improving?immunohistochemical?staining?results?of?poorly?pretreated?tissues.?Methods?From?March?to?May?2022，?68?postoperative?pathological?specimens?were?collected?in?Wenzhou?Central?Hospital，?including?19?cases?of?breast?cancer，?32?cases?of?bowel?cancer?and?17?cases?of?tonsil.?Tissue?wax?blocks?were?made?by?simulating?the?tissue?processing?process?with?poor?pretreatment，?and?of?each?antibody?were?made?for?each?case.?Two?slices?of?each?labeled?antibody?for?each?case?were?devided?into?control?group?（using?ethylenediaminetetraacetic?acid?antigen?repair?solution）?and?experimental?group?（using?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution），?and?compare?the?immunohistochemical?staining?results?of?the?two?groups.?Results?Four?mmol/L?itaconic?anhydride?was?selected?as?the?subsequent?antigen?repair?solution.?There?was?no?significant?difference?in?sensitivity?between?experimental?group?and?control?group?（P>0.05）.?The?specific?excellent?and?good?rate?of?immunohistochemical?staining?results?in?experimental?group?was?significantly?higher?than?that?in?control?group?（92.48%?vs.?76.69%，?χ2=25.43，?P<0.05）.?The?morphology?of?cells?stained?by?immunohistochemistry?in?experimental?group?was?significantly?better?than?that?in?control?group?（χ2=13.60，?P<0.01）.?In?control?group，?folds，?local?sheet?loss，?cell?enlargement?or?even?severe?deformation，?and?unclear?cell?membrane/plasmic/nuclear?localization?were?common，?while?in?experimental?group，?folds?were?less，?there?was?almost?no?sheet?loss，?cell?morphology?was?relatively?intact，?and?cell?membrane/plasmic/nuclear?localization?was?relatively?clear.?Conclusion?When?the?tissue?is?not?fixed?in?time?or?there?is?a?problem?in?the?dehydration?process，?it?is?recommended?to?use?itaconic?anhydride?antigen?repair?solution?to?obtain?the?specific?and?better?immunohistochemical?staining?results?of?cell?morphology.

[Key?words]?Itaconic?anhydride;?Immunohistochemistry;?Fixation;?Non-specific?binding

免疫組織化學（以下簡稱免疫組化）檢測技術發展至今已有一個多世紀，技術十分成熟，但免疫組化染色問題卻一直長期存在，主要原因是影響免疫組化染色結果的因素眾多。其中影響較大的包括組織前處理、抗原修復條件、一抗及檢測系統的敏感度和特異性、孵育時間和溫度等[1]。在組織前處理良好的情況下，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic?acid，EDTA）抗原修復，染色結果良好，強度正常，背景清晰，細胞形態正常。當組織前處理不佳時，采用同樣的組織類型、同樣的抗原修復條件和染色條件進行操作，染色結果不佳，非特異性嚴重，組織切片出現皺褶、局部掉片、細胞變形、細胞膜/質/核定位或邊界不清晰等現象。因此，本研究采用衣康酸酐配制的抗原修復液對前處理不佳的組織進行測試，嘗試解決前處理不佳的組織出現非特異性及細胞形態破壞等問題。

1??材料和方法

1.1??材料

1.1.1??一般資料??前瞻性收集2022年3～5月溫州市中心醫院術后病理標本68例，其中乳腺癌19例，腸癌32例，扁桃體17例。每個病例在不影響病理診斷的前提下，額外多取材一塊組織（大小2.0cm×1.5cm×0.8cm）作為研究對象。乳腺癌每例分別標記抗體HER2、CK、p53；腸癌每例分別標記抗體Ki-67、MSH2、MSH6、PMS2、MLH1、P-gp；扁桃體每例分別標記抗體Bcl-6。每個病例每種標記抗體切片2張，根據隨機數字表法分為對照組（使用EDTA抗原修復液）和實驗組（使用衣康酸酐抗原修復液）。本研究經溫州市中心醫院倫理委員會批準（倫理審批號：L2022-01-078）。

1.1.2??主要試劑??EDTA抗原修復液（pH?9.0）、過氧化物酶阻斷劑、一抗、羊抗鼠/兔HRP標記IgG、DAB（福州邁新生物技術開發有限公司）；衣康酸酐（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2??方法

1.2.1??模擬前處理不佳的組織固定和脫水流程??68例組織延遲24h固定，并降低第一道脫水酒精的濃度至40%，其余流程與正常組織前處理流程一致（梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟）。

1.2.2??免疫組化染色流程??組織切片經脫蠟、水化后，對照組和實驗組均采用水煮鍋于100℃維持20min。抗原修復后，滴加50μl過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered?saline，PBS）沖洗3min×2；滴加50μl一抗室溫孵育60min，PBS沖洗3min×2；滴加50μl二抗室溫孵育30min，PBS沖洗3min×2；滴加50μl?DAB室溫孵育5min，自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡檢。兩組除抗原修復液不同外，其他試劑及染色條件完全一致。

1.2.3??衣康酸酐最佳濃度測試??采用不同濃度（1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、16mmol/L）的衣康酸酐配置抗原修復液，氫氧化鈉調節抗原修復液pH至7.4±0.2。然后用正常前處理的病理組織蠟塊，并選擇對抗原修復要求較高的抗體作為測試一抗，EDTA作為對照，測試出最佳衣康酸酐抗原修復液的濃度。

1.2.4??免疫組化染色評判標準??免疫組化染色結果由2名高年資病理醫生參考行業規范指南進行雙盲獨立判讀。判定標準：表達的抗體敏感度根據細胞反應強度綜合判定，深棕色為強陽性（+++），棕色為中度陽性（++），淺棕色為陽性（+），呈現很淡的棕色為弱陽性（±），沒有顏色為陰性（－）；免疫組化特異性評分總分10分，>8分為優良（輕度背景扣1分，中度背景扣2～3分，重度背景扣4～5分，無法判讀不得分）；細胞形態完整、細胞膜/質/核定位或邊界清晰為細胞形態佳，細胞腫大變形、細胞膜/質/核定位或邊界不清晰為細胞形態差[2-3]。

1.3??統計學方法

采用SPSS?20.0統計軟件對數據進行分析處理。計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??衣康酸酐抗原修復液最佳濃度的選擇

結果顯示，1mmol/L和16mmol/L的衣康酸酐比其他濃度的衣康酸酐染色強度整體偏弱，2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L的衣康酸酐整體染色結果稍弱于對照組，但三組染色結果整體無顯著差異，見表1。部分抗體染色結果見圖1。其中，部分較敏感的抗體，如Ki-67、PMS2、Bcl-6等，4mmol/L的衣康酸酐染色結果更佳。綜合考慮，選擇4mmol/L的衣康酸酐作為后續抗原修復液。

2.2??衣康酸酐抗原修復液對免疫組化敏感度的影響

采用4mmol/L的衣康酸酐抗原修復液對組織前處理不佳的組織進行測試，結果顯示，兩組的敏感度比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3??衣康酸酐抗原修復液對免疫組化特異性的影響

實驗組免疫組化染色結果的特異性優良率顯著高于對照組（92.48%?vs.?76.69%，χ2=25.43，P<0.05），見表3、圖2。其中，特異性差異最顯著的是HER2和p53，由于該病例組織前處理較差，EDTA修復已嚴重影響診斷結果，無法判讀。

2.4??衣康酸酐抗原修復液對細胞形態的影響

實驗組免疫組化染色的細胞形態顯著優于對照組（χ2=13.60，P<0.01），見表4。對照組普遍出現皺褶、局部掉片、細胞腫大甚至嚴重變形、細胞膜/質/核定位不清晰；而實驗組皺褶較少，幾乎無掉片現象，細胞形態相對完整，細胞膜/質/核定位相對清晰，見圖3。

3??討論

自1941年Coons采用熒光素標記抗體檢測肺組織中肺炎雙球菌取得成功以來，免疫組化技術得到快速發展，其主要用于病理診斷、鑒別診斷、判斷疾病的預后和評估臨床療效[4]。隨著個性化精準醫療的興起，尤其在腫瘤治療領域，通過免疫組化染色技術檢測腫瘤病理標本中的特定分子，對分子靶標進行定位指導治療更需要其結果的準確性和穩定性[5]。影響免疫組化染色結果的因素較多，其中影響較大的因素是抗原修復[6-7]。常用的抗原修復方式為熱修復和酶修復。常用的抗原修復液有EDTA、檸檬酸、Tris、胰酶、胃酶等[8-9]。本研究選取EDTA熱抗原修復液作為對照，EDTA是免疫組化中最常用、效果最佳的抗原修復液，具有抗原決定簇暴露充分、性價比高、染色結果強等優點[10-12]。

此外，試劑滴度、孵育時間、溫度、特異性和敏感度等也可影響免疫組化染色結果，其中較易忽視的影響因素是組織前處理。臨床醫生對標本前處理的重視程度不夠，術后未及時固定；醫生取材的組織過大過厚及大標本未按要求剖開固定；病理技術人員對標本處理流程、更換脫水試劑的不規范等多種因素均會影響組織前處理效果[13-15]。從免疫組化角度看，固定不僅要凝固細胞內蛋白質以保持組織的固有形態和結構，而且要盡量減少酶反應以防細胞自溶導致抗原彌散至組織間質。組織固定不及時或脫水不徹底，組織細胞易出現自溶、破裂、褶皺等現象，免疫組化染色結果出現部分抗體非特異性及背景著色，嚴重時影響診斷結果[16-17]。

本研究模擬組織前處理不佳的流程，可見組織切片出現明顯的褶皺和細胞自溶現象，部分抗體指標即使采用常規最優化的免疫組化染色流程仍出現明顯非特異性和背景著色；而日常工作中固定及時的組織采用同樣的染色流程背景干凈，特異性好。另外，對固定不及時的病理標本采用衣康酸酐抗原修復液和EDTA抗原修復液進行對比發現，衣康酸酐可顯著改善組織前處理不佳引起的皺褶、脫片、細胞形態破壞及非特異性和背景著色，且染色的敏感度未見明顯下降。衣康酸酐分子中的碳–碳不飽和雙鍵及酐基等活性官能團可作為良好的表面活性劑，主要作用是解除蛋白質之間的交聯且有較好的通用性。前處理不佳的組織經衣康酸酐抗原修復液修復后，細胞自溶裂解物被消除或屏蔽，不易與一抗及二抗發生非特異性吸附，從而起到降低背景和非特異性染色的作用。衣康酸酐抗原修復液為弱堿性，與PBS的pH值一致，對細胞形態破壞比較少，但具體機制尚不明確，需進一步深入探討研究。實驗組的敏感度與對照組相比無統計學意義，但其特異性和細胞形態明顯優于對照組。

綜上，病理技術人員在臨床工作中遇到部分組織固定不及時或脫水流程出現問題，建議使用衣康酸酐抗原修復液以獲得特異性及細胞形態較好的免疫組化染色結果。

[參考文獻][1] 王德田，?丁偉.?實用現代病理學技術[M].?2版.?北京：?中國協和醫科大學出版社，?2022.