β-欖香烯通過調(diào)控RBBP4/H3K27通路抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移

章波 林恒軍 邱學(xué)科 張繼超 王麗紅

[摘要]?目的?探究β-欖香烯（β-elemene，β-E）抑制結(jié)腸癌進(jìn)展的潛在機(jī)制。方法?使用移植腫瘤模型驗(yàn)證β-E在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)作用。將不同濃度（0～400μmol/L）的β-E作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，利用CCK-8、細(xì)胞克隆、Transwell實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡法等評(píng)估細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力。結(jié)果?5-Fu組和β-E組小鼠的結(jié)腸腫瘤重量均顯著低于模型組（P<0.05），5-Fu組小鼠的結(jié)腸腫瘤抑制率顯著高于β-E組[（59.22±0.11）%?vs.?（36.63±0.09）%，P<0.05]。5-Fu組和β-E組小鼠的肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于模型組（P<0.05）。β-E可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、克隆和侵襲。β-E顯著抑制結(jié)腸癌組織中RBBP4和H3K27me3表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論?β-E可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，可能與其調(diào)控RBBP4功能重塑H3K27甲基化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]?結(jié)腸癌；β-欖香烯；RBBP4；H3K27me3

[中圖分類號(hào)]?R445.1??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.020

β-Elemene?inhibits?liver?metastasis?of?colon?cancer?by?regulating?RBBP4/H3K27?pathway

ZHANG?Bo1，?LIN?Hengjun1，?QIU?Xueke1，?ZHANG?Jichao1，?WANG?Lihong2

1.Department?of?Colorectal?and?Anal?Surgery，?Jinhua?Peoples?Hospital，?Jinhua?321000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Pharmacy，?Affiliated?Hospital?of?Shaoxing?University?（Shaoxing?Municipal?Hospital），?Shaoxing?312000，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?new?potential?mechanism?of?β-elemene?（β-E）?inhibiting?the?colon?cancer.?Methods?The?effect?of?β-E?in?inhibiting?the?growth?of?colon?cancer?in?vivo?was?verified?using?a?transplanted?tumor?model.?Different?concentrations?（0-400?μmol/L）?of?β-E?were?used?to?act?on?colon?cancer?cells，?and?then?the?cell?viability，?migration?and?invasion?were?evaluated?by?CCK-8，?cell?cloning，?Transwell?assay?and?Western?blotting.?Results?The?weight?of?colon?tumor?in?5-Fu?group?and?β-E?group?were?significantly?lower?than?those?in?model?group?（P<0.05）.?The?inhibition?rate?of?colon?tumor?in?5-Fu?group?was?significantly?higher?than?that?in?β-E?group?[（59.22±0.11）%?vs.?（36.63±0.09）%，?P<0.05].?The?number?of?liver?metastases?in?5-Fu?group?and?β-E?group?was?significantly?lower?than?that?in?model?group?（P<0.05）.?β-E?could?inhibit?the?proliferation，?cloning?and?invasion?of?colon?cancer?cells.?β-E?significantly?inhibited?the?expression?of?RBBP4?and?H3K27me3?in?colon?cancer?tissues?（P<0.05）.?Conclusion?β-E?can?inhibit?the?proliferation?and?invasion?of?colon?cancer?cells，?which?may?be?related?to?the?regulation?of?RBBP4?function?remodeling?H3K27?methylation.

[Key?words]?Colon?cancer;?β-Elemene;?RBBP4;?H3K27me3

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。雖然手術(shù)、放射治療及多模式聯(lián)合化療已成為治療該病的標(biāo)準(zhǔn)程序，但患者的生存情況近年來(lái)并沒有明顯改善[2-3]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白4（retinoblastoma?binding?protein?4，RBBP4）是多個(gè)染色質(zhì)修飾復(fù)合物的主要成分，在組蛋白的翻譯后修飾中起多種作用，包括乙酰化、去乙?；图谆?。RBBP4表達(dá)上調(diào)與肺癌、甲狀腺、肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)[4-6]。RBBP4可通過調(diào)控組蛋白3第27位賴氨酸三甲基化（histone?H3?lysine?27?trimethylation，H3K27me3）活性，導(dǎo)致腫瘤抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制[7]。因此，RBBP4被認(rèn)為是一種結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)，尋找靶向RBBP4的藥物引起廣泛關(guān)注。研究表明，天然藥物產(chǎn)物在抗癌治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。姜黃屬的根莖作為傳統(tǒng)中草藥是一種常用的活血化瘀藥物，從中提取的β-欖香烯（β-elemene，β-E）已被證明是一種新型的抗腫瘤候選藥物[8]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，β-E對(duì)肝癌、胃癌、乳腺癌和腦癌等具有抗腫瘤作用，其制劑已被批準(zhǔn)為化療輔助藥物[9-12]。然而，目前的研究多為探索β-E如何在體內(nèi)影響結(jié)腸癌，但其具體作用機(jī)制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，β-E可通過調(diào)節(jié)RBBP4/H3K27me3信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，現(xiàn)報(bào)道如下。

1??資料與方法

1.1??主要試劑

β-E（純度>95%）購(gòu)自大連金剛藥業(yè)有限公司。

1.2??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建

6～8周齡雄性BALB/c小鼠（n=30）購(gòu)自青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2022-0001]。所有小鼠均在無(wú)特定病原體條件下喂養(yǎng)。通過建立原位移植結(jié)腸癌模型來(lái)評(píng)估肝轉(zhuǎn)移。具體操作：注射CT26.WT細(xì)胞（1×106細(xì)胞/ml）進(jìn)入小鼠腋窩（n=6），待腫瘤增長(zhǎng)至約1cm3，處死小鼠，取下腫瘤并切成1mm3碎片。取18只小鼠造模，切開左下腹，使用Histoacryl黏合劑把腫瘤碎片附著于小鼠結(jié)腸區(qū)域，縫合小鼠腹腔。另取6只小鼠切開左下腹，不進(jìn)行任何操作直接縫合腹腔，納入對(duì)照組。造模3d后，18只造模小鼠隨機(jī)分為模型組、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）組和β-E組，每組各6只。5-Fu組小鼠給予5-Fu腹腔注射，30mg/（kg·3d）；β-E組小鼠給予β-E灌胃，6g/（kg·d）；對(duì)照組和模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。四組小鼠均干預(yù)15d，每3d記錄一次小鼠體質(zhì)量。末次給藥后1h使用2%異氟烷麻醉小鼠，眼眥取血。處死小鼠，統(tǒng)計(jì)>1mm的轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的數(shù)量，稱重并記錄。根據(jù)下列公式計(jì)算腫瘤抑制率和肝轉(zhuǎn)移率：腫瘤抑制率=（1–處理組平均結(jié)腸腫瘤重量）/模型組平均結(jié)腸腫瘤重量×100%；肝轉(zhuǎn)移率=處理組平均肝轉(zhuǎn)移數(shù)/模型組平均肝轉(zhuǎn)移數(shù)×100%。

1.3??細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，HT-29細(xì)胞在37℃、5%?CO2的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。RBBP4質(zhì)粒由GenePharma（中國(guó)上海）合成。通過蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證構(gòu)建RBBP4細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功。轉(zhuǎn)染前，在6孔板中，每孔加入2ml含有1.0×106細(xì)胞的完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，使用1.8ml不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替，加入轉(zhuǎn)染混合液200μl。2μg模擬物或質(zhì)粒（購(gòu)自GenePharma）分別用100μl?Opti-MEM稀釋。此外，2μl?lipo3000（購(gòu)自Thermo?Scientific）也用100μl?Opti-MEM稀釋。然后將稀釋的模擬物或質(zhì)粒和稀釋的lipo?3000按1∶1充分混合，混合液孵育10min，6孔板中每孔加入200μl混合溶液，細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)48h用于后續(xù)分析。

1.4??細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8法評(píng)估細(xì)胞活力。將3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的β-E（0、25、50、100、200、400μmol/L，用于細(xì)胞毒性檢測(cè)）分別于0、12、24、48h去除上清液，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，向每個(gè)孔中加入100μl培養(yǎng)基和10μl?CCK-8，37℃避光孵育2h，450nm處檢測(cè)吸光度。在6孔板的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞，使其生長(zhǎng)至90%后處理細(xì)胞；用10mmol/L?EdU溶液在無(wú)血清培養(yǎng)基中制備2×EdU溶液；預(yù)熱2×EdU溶液，然后將其添加到等體積含有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，獲得1×EdU溶液。孵育后除去培養(yǎng)基，并向每個(gè)含有蓋玻片的孔加入2.5ml含多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered?saline，PBS），室溫下孵育15min；除去固定液，用2.5ml?PBS洗滌孔中細(xì)胞5min，重復(fù)3遍；除去洗滌液，向前5個(gè)孔中加入2.5ml通透液，室溫下孵育20min；除去通透液，用2.5ml?PBS洗滌每個(gè)孔的細(xì)胞2次，除去洗滌液；每孔使用100?l反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物體積可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，但必須按比例加入反應(yīng)組分。向每個(gè)玻片加入100?l?Click-iT反應(yīng)混合物，室溫下避光孵育30min；除去反應(yīng)混合物，2.5ml?PBS洗滌，除去洗滌液；之后進(jìn)行核染色。按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.5??細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)

Transwell實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估細(xì)胞遷移能力。將含1×105個(gè)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基加入Transwell上室，再將含15%胎牛血清的700μl培養(yǎng)基添加至下室。37℃孵育24h后，用棉簽去除非侵入細(xì)胞。遷移至下層的細(xì)胞多聚甲醛固定并用1%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選取5個(gè)視野在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6??細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

在6孔板中每孔接種1.5×103個(gè)細(xì)胞，每3d換液，培養(yǎng)2周。2周后，4%多聚甲醛固定15min，再用0.1%結(jié)晶紫染色30min。最后，使用顯微鏡統(tǒng)計(jì)細(xì)胞群落數(shù)。

1.7??蛋白質(zhì)印跡法

收集細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定濃度。使用SDS-PAGE凝膠對(duì)30?g總蛋白和4?l標(biāo)記物進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移至0.22μm?PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉，膜與相關(guān)一抗[抗人GSDMD（1∶1000）、抗RBBP4（1∶1000）、抗兔胱天蛋白酶3（caspase-3，1∶1000）、抗兔多腺苷二磷酸核糖聚合酶（1∶1000）、抗鼠GSDMD（1∶1000）、抗GAPDH（1∶5000）、抗兔p-eIF2α（1∶1000）、抗兔eIF2α（1∶1000）、抗兔ATF4（1∶1000）]在4℃孵育12h。PBST清洗3次，與兔二抗（1∶10000）或鼠二抗（1∶10000）孵育2h后，PBST清洗3次后，進(jìn)一步用ECL發(fā)光液顯影。使用IPP6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.8??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS?17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??β-E抑制小鼠結(jié)腸癌原位移植瘤生長(zhǎng)

本實(shí)驗(yàn)造模成功率100%。模型小鼠腹部進(jìn)行性腫脹，伴有腹瀉，活動(dòng)減少，水和食物攝入減少。β-E組小鼠背部毛發(fā)光澤光滑，行為正常，水和食物攝入量增加，而5-Fu組小鼠精神狀態(tài)較差，行動(dòng)遲緩。對(duì)照組和模型組小鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5-Fu組小鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，β-E組小鼠體質(zhì)量顯著高于5-Fu組。5-Fu組和β-E組小鼠的結(jié)腸腫瘤重量均顯著低于模型組（P<0.05），見圖1。5-Fu組小鼠的結(jié)腸腫瘤抑制率顯著高于β-E組[（59.22±0.11）%?vs.（36.63±0.09）%，P<0.05]。

2.2??β-E減少小鼠模型的肝轉(zhuǎn)移

模型組、5-Fu組和β-E組小鼠尸檢，肝臟可見單個(gè)或多個(gè)白色結(jié)節(jié)，即肝轉(zhuǎn)移灶，見圖2A。5-Fu組和β-E組小鼠的肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于模型組（P<0.01），見圖2B。

2.3??β-E抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的β-E刺激HT-29細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力呈濃度依賴性降低；100μmol/L的β-E刺激HT-29細(xì)胞，HT-29細(xì)胞活力呈時(shí)間依賴性降低；不同濃度的β-E（0～200μmol/L）刺激HT-29細(xì)胞24h后，細(xì)胞侵襲和克隆能力均呈濃度依賴性降低，見圖3。

A.不同濃度β-E刺激HT-29細(xì)胞24h的細(xì)胞活力；B.100μmol/L的β-E刺激HT-29細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞活力；C.不同濃度β-E刺激HT-29細(xì)胞24h后的遷移細(xì)胞數(shù)；D.不同濃度β-E刺激HT-29細(xì)胞24h后的細(xì)胞克隆數(shù)

2.4??β-E對(duì)結(jié)腸癌組織RBBP4和H3K27me3表達(dá)的影響

模型組結(jié)腸癌組織中RBBP4和H3K27me3表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），與模型組比較，β-E顯著抑制結(jié)腸癌組織中RBBP4和H3K27me3表達(dá)（P<0.05），見圖4。

3??討論

β-E作為姜黃的主要成分之一，是一種新型抗腫瘤藥物，已被開發(fā)成注射劑、乳劑和其他劑型治療癌癥，如腦癌、肺癌和肝癌等。研究發(fā)現(xiàn)，β-E能阻斷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌的細(xì)胞周期，并影響凋亡相關(guān)基因如caspase-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。本研究旨在探討β-E對(duì)結(jié)腸癌的影響及其可能的分子機(jī)制。在結(jié)腸癌原位模型中，β-E顯著降低小鼠結(jié)腸腫瘤重量及肝轉(zhuǎn)移率。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，β-E可有效降低結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，說(shuō)明β-E具有抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的潛力。

RBBP4蛋白參與染色質(zhì)組裝、重塑和核小體修飾等各種生物過程[6]。既往研究表明RBBP4在結(jié)腸癌組織中升高與其預(yù)后不良和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，RBBP4在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平明顯升高，表明其在結(jié)腸癌中可能發(fā)揮致癌作用，而β-E治療后RBBP4表達(dá)顯著降低。H3K27me3與原癌基因c-Myc、腫瘤抑制基因p53和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物高度相關(guān)[15-17]。本研究中，β-E顯著抑制結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中H3K27me3的表達(dá)，提示β-E抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖可能與抑制H3K27me3表達(dá)有關(guān)。多梳抑制復(fù)合物2（polycomb?repressive?complex?2，PRC2）是H3K27二甲基化和三甲基化的主要閱讀蛋白。RBBP4具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶修飾活性，與PRC2甲基轉(zhuǎn)移酶異常組蛋白甲基化有關(guān)。本研究結(jié)果表明RBBP4介導(dǎo)的PRC2甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)β-E抑制H3K27me3活化很重要。

綜上，β-E可通過調(diào)控RBBP4/H3K27通路抑制結(jié)腸癌的增殖和侵襲過程，可能是一種潛在的治療結(jié)腸癌的候選藥物。

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