基于CIBERSORT方法評價腫瘤浸潤免疫細胞與肝細胞癌預后的關系:一項TCGA數(shù)據(jù)集二次分析*

張文思 陳曉蓉 楊宗國

上海市公共衛(wèi)生臨床中心 中醫(yī)科 (上海, 201508)

肝細胞癌(HCC)目前被認為是一種發(fā)生于慢性肝病引起慢性肝臟炎癥的免疫原性癌癥[1-5]。在慢性肝臟炎癥過程中,固有免疫細胞和適應性免疫細胞與肝組織細胞相互作用,被各種分子機制激活,促進肝損傷和HCC腫瘤免疫原性[6]。最近的研究證據(jù)表明,各種免疫細胞與腫瘤細胞有密切的相互作用。在肝癌形成過程中涉及腫瘤細胞生物學特性的許多分子機制也對免疫系統(tǒng)有相當大的影響[3]。

腫瘤浸潤免疫細胞是復雜的腫瘤免疫微環(huán)境的一部分,與包括HCC在內(nèi)的各種人類癌癥的臨床預后相關[2,7]。特定類型的免疫細胞不僅涉及宿主對腫瘤的防御[8],而且通過選擇更適合在免疫活性宿主中存活的腫瘤細胞或通過在可促進腫瘤生長的腫瘤微環(huán)境中建立條件來加速促進腫瘤進展[9]。此外,腫瘤浸潤免疫細胞在HCC預后中的預后作用仍存在爭議,特異性免疫細胞對腫瘤進展具有雙重作用[9-11]。CIBERSORT對基因表達數(shù)據(jù)的反卷積提供了有關HCC患者免疫細胞組成和預測值的寶貴信息[12-14]。本研究中,我們通過應用CIBERSORT方法研究腫瘤浸潤免疫細胞的相對比例和分布,以及與HCC患者預后的相關性。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)源 肝細胞癌患者基于HTSeq-FPKM平臺的轉(zhuǎn)錄組基因表達數(shù)據(jù)來自癌癥基因組圖譜(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫的基因組數(shù)據(jù)共享數(shù)據(jù)門戶。本研究下載了包括Cart、Manifest和Metadata在內(nèi)的文件,共獲得了374例腫瘤樣本和50例非腫瘤樣本。

1.2 CIBERSORT分析 通過估計RNA轉(zhuǎn)錄本的相對子集進行細胞類型識別的CIBERSORTfa是一種使用基因表達數(shù)據(jù)來估計組織樣本的細胞類型組成的反卷積算法[12]。CIBERSORT基因特征矩陣,稱為LM22,包含547個基因,可區(qū)分22種人類造血細胞表型,包括7種T細胞類型、初始和記憶B細胞、漿細胞、NK細胞和髓系亞群。來自TCGA-LIHC的所有樣本都通過CIBERSORT分析了免疫細胞譜,其缺省特征矩陣為100個排列[12]。每個樣本的22種免疫細胞類型以及CIBERSORT指標作為Pearson相關系數(shù)、CIBERSORTP值和均方根誤差被量化。CIBERSORTP值反映了所有細胞子集的反卷積結果的統(tǒng)計顯著性,可用于過濾掉擬合精度不太顯著的反卷積。只有CIBERSORTP<0.05的數(shù)據(jù)被過濾并選擇用于以后的分析。在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的樣本中,最終以CIBERSORTP≤0.05為標準納入了2例非腫瘤樣本和30例腫瘤樣本。

1.3 生存分析 從cBioPortal for Cancer Genomics(https://www.cbioportal.org/)下載TCGA-LIHC的臨床數(shù)據(jù)[15,16]。VLOOKUP函數(shù)用于匹配巨噬細胞M0和M1與TCGA-LIHC中的臨床數(shù)據(jù)。研究納入了包括總生存期(OS)和無病生存期(DFS)在內(nèi)的HCC結局指標。

1.4 統(tǒng)計學方法 運用R語言中heatmap包(https://cran.rproject.org/web/packages/pheatmap/)對腫瘤和非腫瘤組織之間的免疫細胞進行熱圖分析,使用corrplot包(https://cran.rproject.org/web/packages/corrplot/index.html)進行免疫細胞的相關分析。Graphpad Prism v8.0(GraphPad Software,CA,US)用于統(tǒng)計分析,Student'st檢驗或Mann-WhineyU檢驗用于比較不同臨床病理特征的巨噬細胞分布差異。雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CIBERSORT免疫細胞組分的比較 以CIBERSORTP≤0.05為標準,從所有肝癌樣本中納入了2例非腫瘤樣本和30例腫瘤樣本,如圖1所示。與非腫瘤組織相比,巨噬細胞M0在腫瘤組織中顯著浸潤。巨噬細胞M1在HCC患者的非腫瘤組織中顯著高于腫瘤組織中的巨噬細胞。圖2描述了HCC中腫瘤組織和非腫瘤組織之間22種免疫細胞的分布圖。圖3描述了腫瘤組織和非腫瘤組織中免疫細胞的分布熱圖。

圖1 腫瘤組織與非腫瘤組織中免疫細胞分布差異

圖2 腫瘤組織與非腫瘤組織22種免疫細胞分布圖

圖3 腫瘤組織和非腫瘤組織中免疫細胞的分布熱圖

2.2 免疫細胞的相關性 圖4顯示,基于CIBERSORT所選樣本的免疫細胞之間Pearson相關性。在所有其他具有巨噬細胞M1的免疫細胞中,所有Pearson相關性都<0.5或>-0.5。

圖4 基于CIBERSORT所選樣本的免疫細胞之間Pearson相關性

2.3 HCC患者巨噬細胞M0和M1的生存分析 在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中,361例病例在匹配臨床數(shù)據(jù)和巨噬細胞CIBERSORT分數(shù)后被納入分析。如圖5A-B所示,與M0低浸潤的患者相比,腫瘤組織中巨噬細胞M0高浸潤的HCC患者其OS和DFS顯著縮短(HR=2.06,95%CI=1.45～2.93,P<0.001和HR=1.58,95%CI=1.17～2.14P=0.004)。圖5B-C示,HCC患者中巨噬細胞M1浸潤程度與OS和DFS之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖5 M0和M1浸潤與HCC患者預后的關系

2.4 巨噬細胞M0與臨床病理特征的相關性 如圖6所示,在甲胎蛋白(AFP)升高的HCC患者中,巨噬細胞M0的CIBERSORT分數(shù)顯著增加(P<0.05)。與AJCC Ⅰ期患者相比, AJCC Ⅱ-Ⅳ期HCC患者的CIBERSORT巨噬細胞M0分數(shù)顯著更高(P<0.001)。巨噬細胞M0的CIBERSORT分數(shù)隨著腫瘤病理組織學分級升高顯著增加(P<0.05)。此外,巨噬細胞M0水平與HCC患者的血管浸潤顯著相關(P<0.01)。

圖6 不同臨床病理學特征的M0浸潤程度比較

3 討論

腫瘤中高密度的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)幾乎是所有惡性腫瘤炎癥浸潤的主要成分[17,18]。在募集到腫瘤部位的固有免疫和適應性免疫細胞中,巨噬細胞特別豐富,并且存在于腫瘤進展的各個階段。TAMs可分為M1和M2亞型,CD68是M1的生物標記,CD163和CD206是M2的生物標記[19,20]。

我們的結果顯示巨噬細胞M0在HCC腫瘤中顯著浸潤,并與HCC患者的預后、晚期腫瘤分期和惡性表型相關。研究表明巨噬細胞對HCC生存預后無顯著預測價值[21]。與其非腫瘤區(qū)域相比,已觀察到HCC患者的腫瘤內(nèi)區(qū)域巨噬細胞減少[22]。Li等[14]研究顯示,巨噬細胞與HCC患者OS存在相關性,而對DFS無影響。Ding等[23]發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中的巨噬細胞密度是OS和DFS的獨立預測因子,而腫瘤周圍巨噬細胞密度與HCC患者的OS和DFS均不相關。相反,也有報道稱TAMs對HCC患者的OS和DFS具有保護作用[24]。一項薈萃分析表明,腫瘤內(nèi)CD68+巨噬細胞與OS之間關聯(lián)性無統(tǒng)計學意義,而腫瘤周圍高密度CD68+巨噬細胞與HCC患者OS正相關[10]。CD163+巨噬細胞數(shù)量在瘤體較大、分化差的HCC患者中顯著增加[25]。而且,高CD163+巨噬細胞水平顯示預后不良,并與HCC患者的腫瘤結節(jié)和靜脈浸潤增加相關[20]。高度浸潤的CD206+巨噬細胞與HCC患者侵襲性腫瘤表型和較差OS顯著相關[21,26]。此外,TAMs可引發(fā)腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞增加,從而促進HCC進展[27]。巨噬細胞還具有免疫抑制作用,可在腫瘤進展過程中阻止自然殺傷細胞和T細胞對腫瘤細胞的攻擊[18,28]。考慮到目前的證據(jù),本研究認為TAM亞型的異質(zhì)性及其起源和動態(tài)表型在HCC發(fā)生和進展過程中導致抗腫瘤或促腫瘤發(fā)生功能性差異[10,21,29-31]。

本研究表明,巨噬細胞M0促進了侵襲性腫瘤表型,包括HCC患者血管侵犯、晚期腫瘤分期和AFP升高。TAMs對腫瘤血管化的調(diào)控有較大影響[18,32]。病理分析發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中的巨噬細胞有助于分化良好的HCC患者腫瘤血管形成[33]。已有的證據(jù)表明TAM計數(shù)與HCC患者腫瘤微血管相關[34]。Ding等[23]發(fā)現(xiàn)鄰近巨噬細胞浸潤與血管侵犯相關,但與腫瘤內(nèi)巨噬細胞浸潤程度無關。巨噬細胞通過激活JAK2/STAT3/Snail通路以增強HCC細胞的遷移和侵襲能力,并誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[35]。CD68+巨噬細胞的數(shù)量在腫瘤Ⅳ期的HCC患者中顯著增加[25]。基于既往研究證據(jù)和本研究結果,表明腫瘤浸潤巨噬細胞加速了HCC的惡性腫瘤表型進展。