二陳湯對肥胖小鼠肝臟脂代謝及AMPK/ACC/SREBP1信號通路作用機制研究*

張付民 羅 政 周炎濤 張岱陽

湖北省恩施州中心醫院脊柱外科 (湖北 恩施, 445000)

肥胖為誘發非酒精性脂肪肝炎、糖尿病、腫瘤、冠心病等疾病的重要因素,當前全球肥胖患者已突破21億人,成為全球性的公共衛生問題[1]。目前,肥胖的治療方式主要有鍛煉、飲食控制、減肥手術和藥物治療,其中藥物治療主要包括奧利司他、西布曲明和氯卡色林等[2]。盡管抗肥胖藥物的問世給肥胖患者帶來了曙光,但其引起的副作用也日益顯現,因此迫切需要尋找更為有效且副作用低的治療藥物。

中醫學認為肥胖發病主要與痰濕、濕熱有關,臨床實踐也證實人參、白術、茯苓、黃連等健脾祛濕和清熱燥濕類中藥對肥胖患者具有一定療效[3,4]。二陳湯源自《太平惠民和劑局方》,具有燥濕化痰、理氣和中之功,為中醫治療痰邪的經典方劑。近年來,一些研究證實二陳湯可通過降脂、抗氧化應激、抑制炎癥和調節腸道菌群等途徑改善高脂飲食誘導肥胖模型的肝損傷[5-9]。AMPK/ACC/SREBP1信號通路具有降脂、抗炎的作用,調節該信號通路則可改善肥胖模型的肝臟脂質代謝紊亂和肝臟炎癥病變[10,11]。研究發現二陳湯可通過激活AMPK改善肥胖模型大鼠脂質代謝紊亂[12]。盡管二陳湯抗肥胖的作用已得到廣泛認可,但尚不能確定其是否可通過調節AMPK/ACC/SREBP1信號通路改善肥胖模型的肝臟脂質代謝紊亂。為此,本研究將通過高脂飲食建立肥胖模型小鼠,并給予模型小鼠二陳湯干預,通過觀察小鼠脂質代謝及肝臟炎性病變,以及AMPK/ACC/SREBP1信號通路中關鍵分子表達水平,以揭示二陳湯改善肥胖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠,60只,6周齡,體質量20～22 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司[許可證號:SCXK(遼)2020-0001]。動物飼養于湖北省恩施州中心醫院實驗中心,動物房溫度保持在23～26℃,相對濕度維持在50%～60%,實驗期間動物自由飲水和攝食。

1.1.2 主要藥品及試劑 參考文獻[7]確定二陳湯藥物組成及藥物劑量,即二陳湯由半夏、橘紅各15 g,茯苓 9 g,甘草4.5 g組成,所有中藥材由湖北省恩施州中心醫院中醫部提供。水煎藥物,將藥物濃縮成每毫升含生藥0.435 g的水煎液,置4℃冷藏備用。奧利司他膠囊(重慶華森制藥股份有限公司,批號:國藥準字H20103180)。ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批號分別為C009-2-1、C010-2-1、C011-2-1、A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、A112-1-1)。小鼠IL-1β試劑盒、小鼠IL-6試劑盒、小鼠TNF-α試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號分別為PI301、PI326、PT512)。HE染色液、油紅O染色液、小鼠IL-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號分別為G1120、G1261、SEKM-0046)。AMPKα兔多克隆抗體、p-AMPKα(Thr172)兔多克隆抗體、ACC兔多克隆抗體、p-ACC(Ser79)兔多克隆抗體、SREBP1兔多克隆抗體和β-actin兔單克隆抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號分別為A1229、AP0116、A15606、AP0298、AC026)。

1.2.3 實驗器材 XPR6U/AC型電子天平(上海梅特勒-托利有限公司);3H24RI型離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);N-9848型組織研磨儀(北京赫得科技有限公司);Minux S700A型石蠟切片機(深圳瑞沃德生命科技有限公司);EnVision型酶標儀(美國PerkinElmer公司);EPS-600型電泳儀、Tanon 1600型凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 按照隨機數字生成表將C57BL/6J小鼠隨機分為空白組(Control)組、模型(Model)組、奧利司他(Orlistat)組和二陳湯(ECD)組,每組15只。參考文獻[10,11]予高脂飲食建立肥胖小鼠模型。Control組小鼠給予普通飲食,其余3組小鼠則給予高脂飲食[蔗糖(10%)、豬油(14%)、膽固醇(2%)、膽酸鈉(0.2%)及基礎飼料(72.8%)],連續飼養12周。飼養結束后,尾靜脈取血,通過檢測ALT、AST、TC、TG的含量判斷造型是否成功。經檢測Model組、Orlistat組和ECD組小鼠分別有12只、12只、13只造模成功。選取造模成功的小鼠進行干預,即從第13周開始Control組和Model組小鼠給予等體積的生理鹽水,Orlistat組和ECD組分別按照15.6 mg/(kg·d)和0.87 g/(kg·d)的劑量灌胃奧利司他膠囊和二陳湯水煎液,持續干預4周。

1.2.2 小鼠體重、肝臟濕重及肝體比值檢測 治療后,從每組隨機選取8～11只小鼠,記錄體重,摘眼球取血,取血后置離心機以3 000 r/min離心10 min,取上清液,分裝后置-80℃備檢。取血后,解剖腹腔,剝離肝臟,記錄各組小鼠的肝臟濕重,分裝后置-80℃備檢。計算各組小鼠肝體比值,肝體比值(%)=肝臟濕重/體重。

1.2.3 小鼠血清ALT、AST檢測 將上述部分凍存的血清(n=8～11)恢復至室溫,參照試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中ALT、AST的表達水平。

1.2.4 小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測 將上述部分凍存的血清(n=8～11)恢復至室溫,參照試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的表達水平。

1.2.5 小鼠肝組織HE染色 用6%水合氯醛麻醉(4 ml/kg)剩余小鼠(n=4),解剖胸腔,經心臟灌注4%多聚甲醛溶液,肝臟發白后取肝臟,置4%多聚甲醛溶液固定24 h。固定后石蠟包埋肝組織,用切片機切取5 μm厚的切片。使用二甲苯和梯度乙醇對切片進行脫蠟和透明,置蘇木素染液染色15 min,自來水洗片,置1%鹽酸酒精分化3 s。自來水下洗片,置伊紅染色液染色3 s。二甲苯和梯度乙醇脫水,封片,置顯微鏡下觀察切片,拍照。

1.2.6 小鼠肝組織油紅O染色 取上述石蠟包埋的肝組織,切片機切取10 μm厚的切片,使用二甲苯和梯度乙醇對切片進行脫蠟和透明。將切片置60%異丙醇浸泡20 s,再置油紅O染色液染色10 min。染色后將切片置60%異丙醇分化5 s,蒸餾水洗片,濾紙吸干殘留水分,甘油明膠封片。顯微鏡下觀察切片,拍照。

1.2.7 ELISA檢測小鼠肝組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α檢測 取上述凍存的肝組織100 mg(n=8～11),加入9倍體積的PBS,置組織研磨儀勻漿。研磨后以3 000 r/min離心15 min,取上清液,分裝備檢。參照ELISA試劑盒說明書依次檢測各組小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平。

1.2.8 Western blot檢測小鼠肝組織AMPK/ACC/SREBP1信號通路相關蛋白的表達水平 取上述凍存的肝組織100 mg(n=4),加入RIPA裂解液1 ml,置組織研磨儀研磨,以12 000 r/min離心15 min,取上清液,用BCA蛋白試劑盒測定樣品蛋白濃度。根據蛋白濃度使用Loading buffer稀釋樣品,100℃煮沸10 min,置-20℃保存備檢。制備8%的分離膠和5%的濃縮膠,每孔上樣10 μl,依次電泳和轉膜。置5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗AMPKα(1∶1 000)、一抗p-AMPKα(1∶1 000)、一抗ACC(1∶1 000)、一抗p-ACC(1∶1 000)、一抗SREBP1(1∶1 000)和一抗β-actin(1∶1 000),置4℃孵育過夜。TBST洗膜,將切片置于稀釋后的二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h;TBST洗膜,向切片表面滴加ECL顯色液。凝膠成像儀曝光條帶,拍照,用Image J分析條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用統計軟件SPSS 21.0處理實驗數據。采用Shapiro-Wilk檢驗對各組數據進行正態性分析,實驗數據不符合正態性多組間兩兩比較則采用KruskaL-WallisH檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。符合正態分布則采用單因素方差分析,方差齊性時多組間兩兩比較采用Bonferroni法,方差不齊時多組間兩兩比較采用Tamhahe′s T2法,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二陳湯對肥胖小鼠體重、肝臟濕重及肝體比值的影響 見表1。

表1 二陳湯對肥胖小鼠體重、肝臟濕重及肝體比值的影響

2.2 二陳湯對肥胖小鼠血清ALT、AST的影響 見表2。

表2 二陳湯對肥胖小鼠血清ALT、AST的影響

2.3 二陳湯對肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 見表3。

表3 二陳湯對肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響

2.4 小鼠肝組織HE染色結果 Control組小鼠肝細胞結構清晰,細胞排列整齊,未見明顯的脂肪變性和氣球樣病變。Model組小鼠肝細胞間隙增加,細胞排列欠規則,有明顯的脂肪變性和氣球樣病變,可見炎性細胞浸潤。Orlistat組和ECD組小鼠肝細胞間隙減少,細胞排列較整齊,脂肪變性和氣球樣病變,可見少量的炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色圖 (400×)

2.5 小鼠肝組織油紅O染色結果 Control組小鼠肝細胞形態正常,細胞質可見少量且分布均勻的紅色脂滴。Model組小鼠肝細胞腫大,細胞質內有大量的紅色脂滴。Orlistat組和ECD組小鼠肝細胞腫大減輕,且細胞質內紅色脂滴減少。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織油紅O染色圖 (400×)

2.6 二陳湯對肥胖小鼠肝組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的影響 見表4。

表4 二陳湯對肥胖小鼠肝組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的影響

2.7 二陳湯對肥胖小鼠肝組織AMPK/ACC/SREBP1信號通路相關蛋白的影響 與Control組比較,Model組小鼠肝組織中p-AMPKα/AMPKα、p-ACC/ACC的表達水平顯著降低(P<0.01),而SREBP1的表達水平顯著升高(P<0.01)。與Model組比較,Orlistat組和ECD組小鼠肝組織中p-AMPKα/AMPKα、p-ACC/ACC的表達水平升高(P<0.01,P<0.05),而SREBP1的表達水平顯著降低(P<0.01)。見表5、圖3。

1.Control組;2.Model組;3.Orlistat組;4.ECD組

表5 二陳湯對肥胖小鼠肝組織AMPK/ACC/SREBP1信號通路相關蛋白的影響

3 討論

中醫學認為肥胖之人具有“多痰”“多濕”的病理表現[4,13]。痰和濕本屬同類,具有相資互長的屬性,然二者的生成與脾主運化失調有關,如《素問·至真要大論》言:“諸濕腫滿,皆屬于脾”。脾失運化的發生又與過食肥甘厚味、暴飲暴食關系密切,如《素問·痹論》言:“飲食自倍,脾胃乃傷”。《諸病源侯論·虛勞痰飲候》也有相似的論述,并言:“勞傷之人,脾胃虛弱,不能克消水漿,故為痰飲也”。因此,治療肥胖當注重應用健脾祛濕化痰法[14]。二陳湯源自《太平惠民和劑局方》,具有燥濕化痰、理氣和中之功,被奉為治療痰濕的基礎方。二陳湯中半夏燥濕化痰,橘紅健脾理氣化痰祛濕,茯苓健脾滲濕,甘草健脾和中、調和諸藥,全方共湊燥濕化痰、理氣和中之功。總之,二陳湯主治功效與肥胖發病病機相契合,且臨床和動物實驗也證實其具有抗肥胖的作用。因此,本研究以二陳湯為研究對象。

肝臟脂質代謝紊亂為肥胖發病過程中的重要環節,改善肝臟脂質代謝對于肥胖的結局具有重要意義。研究證實連續給予嚙齒類動物12周及以上高脂飲食可導致肝臟脂質代謝紊亂[15,16]。本研究也發現在給予小鼠12周高脂飲食后,小鼠血清中TC、TG、LDL-C的表達水平顯著升高(P<0.01),且HDL-C的表達水平顯著下調(P<0.01),這表明高脂飲食可導致小鼠肝臟脂質代謝紊亂。綜合HE染色和油紅O染色結果,課題組認為高脂飲食可以誘導肥胖小鼠肝臟脂質代謝紊亂,這一結果與前期研究結論一致[5,6]。課題組在給予模型小鼠二陳湯治療后,小鼠肝臟脂質沉積好轉,血清中TC、TG、LDL-C的表達水平下調且HDL-C的表達水平上調(P<0.01,P<0.05),這表明二陳湯可以改善肥胖小鼠肝臟脂質代謝紊亂。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為細胞能量代謝的感受器,具有調節能量代謝、脂質代謝、炎癥、自噬和凋亡的作用[17]。AMPK家族由AMPKα、AMPKβ和AMPKγ三個亞單位組成,其中APMKα為其主要亞單位[18]。AMPKα在蘇氨酸172位點(Thr172)磷酸化后可促使乙酰輔酶A羧化酶(ACC)在絲氨酸79位點(Ser79)磷酸化,磷酸化的ACC又可進一步抑制下游膽固醇調節元件結合蛋白1(SREBP1)的表達,從而最終改善脂質代謝紊亂[19-21]。激活AMPK/ACC信號通路可抑制SREBP1表達,并最終改善肥胖模型肝臟脂質代謝紊亂[21]。本研究發現,在給予小鼠高脂飲食后,小鼠肝組織中AMPK和ACC的磷酸化蛋白表達水平下調(P<0.01),而SREBP1的蛋白表達水平增加(P<0.01),這表明高脂飲食可導致小鼠肝臟AMPK/ACC/SREBP1信號通路的異常表達。在給予肥胖小鼠二陳湯治療后,小鼠肝組織中AMPK和ACC的磷酸化蛋白表達水平上調(P<0.01,P<0.05),且SREBP1的蛋白表達水平下調(P<0.05)。此外,高脂飲食可導致嚙齒類動物肝臟炎癥病變,AMPK/ACC信號通路的活化則可通過抑制SREBP1的表達,從而抑制促炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的釋放[5,6,19-21]。本研究發現,給予小鼠12周高脂飲食后,模型小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平明顯升高(P<0.01),而二陳湯則可抑制小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平(P<0.01,P<0.05)。綜合分析上述實驗結果,二陳湯可通過調節AMPK/ACC/SREBP1信號通路改善高脂飲食誘導的肝臟脂質代謝紊亂和炎性改變。

上述結果表明,二陳湯可以改善肥胖小鼠的脂質代謝紊亂,其機制可能與其調節AMPK/ACC/SREBP1信號通路有關。本研究初步探討了二陳湯治療肥胖的作用機理,但其深入機制還需要進一步研究。因此,課題組下一步將通過體外實驗驗證其治療肥胖的主要作用靶點和作用機制。