紅景天苷調節miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信號軸對瘢痕疙瘩成纖維細胞生物學功能的影響

蔡翔 何亞男 李伶華 邱百怡 秦宗碧

瘢痕疙瘩(keloid disease,KD)是皮膚傷口在愈合過程中過度生長的瘢痕組織,是一種特殊的病理學瘢痕,病因不明,組織學特點為瘢痕過度形成、成纖維細胞過度增殖、細胞外基質成分過度沉積[1]。臨床上KD表現為瘢痕超出原始損傷范圍,成持續性生長腫塊,可伴有瘙癢或疼痛[2]。紅景天苷(salidroside,SAL)是從景天科景天屬植物紅景天全草或根莖中提取出的主要活性成分之一,現代藥理學研究表明SAL具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤、調節免疫和神經保護等功能[3,4]。SAL對皮膚也具有保護作用,研究發現SAL具有抗皮膚光老化、促進皮膚創面愈合修復、治療黃褐斑、痤瘡等皮膚病等功效[5,6]。有證據表明,非編碼RNA能夠參與KD進展,而微小RNA是一類重要的非編碼RNA,在細胞增殖、遷移、凋亡中具有調控作用[7]。miR-26a-5p作為miRNA大家族的一員,是腫瘤抑制基因,具有阻斷細胞周期和細胞增殖的作用。研究發現JAG1在KD成纖維細胞中顯著高表達,且是Notch的配體之一,JAG1/神經源性基因Notch同源蛋白1(Notch-1)信號通路能夠促進細胞增殖轉移、抑制細胞凋亡等生物學功能[8]。本研究培養原代HKF細胞,探究SAL通過調節miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信號軸對HKF細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 紅景天苷(≥98%)購自于上海源葉生物有限公司;DMEM高糖培養基、胰酶、胎牛血清購自海碧云天生物技術有限公司;青、鏈霉素購自Gibco公司;BCA蛋白定量試劑盒、Trizol試劑購自康為世紀生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司;CCK-8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、Transwell小室購自北京索萊寶生物科技有限公司;JAG1、Notch-1、GAPDH一抗及相應二抗購自CST公司。

1.2 細胞培養 KD標本來自我院術中切除的KD組織,將KD標本使用PBS洗滌,剪去表皮、皮下組織和脂肪等,并切成2 mm3左右小塊,采用組織塊貼壁法對HEK細胞原代培養,置于含10%體積分數胎牛血清的DMEM高糖培養基中,并加入青、鏈霉素,在37℃、5% 體積分數CO2的細胞培養箱中培養。待原代細胞生長至鋪滿細胞皿底部時,加入PBS輕輕晃動使組織塊脫落,加入胰蛋白酶進行消化、傳代。傳3代后取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞轉染與分組 將細胞以5×105個/孔密度接種于6孔板,孵育過夜。將HEK細胞隨機分為對照組(Control組)、SAL低濃度組(SAL-L組,50 μmol/L)、SAL高濃度組(SAL-H組,100 μmol/L)、SAL高濃度+miR-NC組(SAL-H+miR-NC組)、SAL高濃度+miR-26a-5p mimics組(SAL-H+miR-26a-5p mimics組)、SAL高濃度+NC-inhibitor組(SAL-H+NC-inhibitor組)、SAL高濃度+miR-26a-5p inhibitor組(SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組)。SAL藥物濃度參考實驗室前期實驗結果設置。SAL-H+miR-NC組、SAL-H+miR-26a-5p mimics組、SAL-H+NC-inhibitor組和SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組細胞進行相應轉染,轉染24 h后加入100 μmol/L SAL進行干預24 h。

0 h 24 h

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期細胞以1×105個/ml接種在96孔板中,每組設6個復孔。每組細胞進行相應轉染與加藥后,分別培養12 h和24 h后棄去培養基,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,用酶標儀檢測每個孔在450 nm波長(OD450)下的光密度。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移 將對數生長期細胞以5×105個/孔密度接種于6孔板,按1.3進行相應處理后,使用100 μl移液槍吸頭在約100%匯合的細胞單層上劃痕。PBS洗滌后加入不含血清的培養基,24 h后在顯微鏡下拍照,用圖像分析儀測量劃痕寬度。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 調整HKF細胞密度為1×106個,并接種在6孔板中,按方法1.3進行分組與處理。培養48 h后消化細胞,加入無血清培養基配制成1×104個/ml的細胞懸液。Transwell小室置于24孔板中,分別加入20 μl 1 mg/ml的Matrigel基質膠進行包被,在上室加入200 μl細胞懸液,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基600 μl。將其置于細胞培養箱中培養20 h,隨后用棉簽除去室內細胞,加入4%多聚甲醛固定20 min,加入0.1%結晶紫染色10 min,在光鏡下觀察穿過小室基底膜的細胞數。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡 1.3中處理過的各組細胞加入胰酶消化,離心棄去上清液收集細胞。調整細胞懸液的密度為1×106個/ml,加入70%乙醇在4℃下固定24 h,之后離心棄去上清,加入PBS洗滌2次。加入碘化丙啶(PI)試劑,在暗處避光37℃孵育30 min,用流式細胞儀檢測細胞周期。另取重懸細胞,離心沉淀后加入結合緩沖液重懸,加入5 μl Annexin V-FITC試劑和10 μl PI,混勻后室溫避光孵育20 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 RT-qPCR法檢測細胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達 細胞經1.3處理后,加入Trizol試劑用于提取細胞RNA。將提取的RNA按逆轉錄試劑盒說明書操作,逆轉錄為cDNA,并以此為模板,進行PCR擴增。反應條件：95℃預變性10 min,95℃變性20 s,60℃退火55 s,72℃延伸15 min,共循環50次。2-ΔΔCt方法計算各組細胞miR-26a-5p、JAG1、Notch-1 mRNA的表達量。見表1。

表1 引物序列設計

1.9 Western blot檢測細胞JAG1、Notch-1蛋白的表達 細胞經1.3處理后,加入PIPA裂解液提取HKF細胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后被轉移到PVDF膜上。在室溫下將膜在脫脂奶粉中封閉2 h,隨后在4℃下與一抗JAG1(1∶1 000)、Notch-1(1∶1 000)孵育過夜。次日室溫下將膜與相應二抗(1∶2 000)孵育2 h,再用TBST洗滌膜3次,加入ECL顯色劑進行顯色。以GAPDH為內參,使用凝膠圖像處理系統分析目標蛋白的灰度值。

1.10 雙熒光素酶實驗檢測miR-26a-5p與JAG1的靶向關系 利用TargetScan網站對miR-26a-5p與JAG1的靶向關系進行預測。構建JAG1野生型質粒(JAG1-WT)和突變型質粒(JAG1-MUT),將JAG1-WT和JAG1-MUT分別與miR-NC或miR-26a-5p mimic共轉染于HKF細胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 7組HKF細胞增殖情況比較 7組12 h OD450值比較均無差異(P>0.05)。與Control組相比,SAL-H組HKF細胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-L組相比,SAL-H組HKF細胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組細胞OD450值(24 h)顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 7組細胞增殖情況比較

2.2 7組HKF細胞遷移能力比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細胞遷移距離顯著降低(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞遷移距離顯著降低(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細胞遷移距離顯著升高(P<0.05)。見圖1,表3。

表3 7組HKF細胞遷移能力比較 n=6,μm,

2.3 7組HKF細胞侵襲能力比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組侵襲細胞減少(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組侵襲細胞減少(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組侵襲細胞增多(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 Tanswell實驗檢測7組HKF細胞侵襲(結晶紫染色×100)

表4 7組HKF細胞侵襲能力比較 n=6,個,

2.4 SAL對7組HKF細胞周期和凋亡率的影響 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細胞G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05),S期細胞比例顯著減少(P<0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05),S期細胞比例顯著減少(P<0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細胞G0/G1期細胞比例顯著減少(P<0.05),S期細胞比例顯著增加(P <0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表5,圖3、4。

圖3 流式細胞術檢測HKF細胞的細胞周期變化

圖4 流式細胞術檢測HKF細胞凋亡

表5 SAL對7組HKF細胞周期和細胞凋亡率的影響 n=6,%,

2.5 7組HKF細胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細胞miR-26a-5p表達顯著升高,差異均有統計學意義,JAG1和Notch-1 mRNA表達顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞miR-26a-5p表達顯著升高,JAG1和Notch-1 mRNA表達顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細胞miR-26a-5p表達顯著降低,JAG1和Notch-1 mRNA表達顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 7組HKF細胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達 n=6,

2.6 7組HKF細胞JAG1和Notch-1蛋白表達比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細胞JAG1和Notch-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞JAG1和Notch-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細胞JAG1和Notch-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表7,圖5。

圖5 Western blot檢測HKF細胞中JAG1、Notch-1蛋白表達(A Control組;B SAL-L組;C SAL-H組;D SAL-H+miR-NC組;E SAL-H+miR-26a-5p mimics組;F SAL-H+NC-inhibitor組;G SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組)

表7 7組HKF細胞JAG1和Notch-1蛋白的表達 n=6,

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測結果 預測得到的miR-26a-5p與JAG1的結合位點。與JAG1-WT和miR-NC共轉染組相比,JAG1-WT和miR-26a-5p mimic共轉染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與JAG1-MUT和miR-NC共轉染組相比,JAG1-MUT和miR-26a-5p mimic共轉染組的熒光酶活性變化無顯著性差異(P>0.05)。見表8,圖6。

圖6 miR-26a-5p與JAG1的結合位點預測

表8 熒光素酶活性比較

3 討論

KD是良性的真皮纖維增生性腫瘤,好發于10～30歲人群,其中約有86%患者產生瘙癢且難以有效控制,嚴重影響患者的生活質量和心理健康[9]。臨床治療KD主要依靠外科手術或病灶內注射類固醇藥物的方法,但其容易復發,且復發后通常出現病情加重的現象,因此尋找治療KD的新型藥物與治療方法具有重要意義[10]。HKF細胞在KD的形成、病情發展和轉歸中處于重要環節,因其分裂能力和增殖能力強、適應性強,易培養,可在體外穩定培養的特性,是體外研究KD藥理作用和機制的常用細胞[11]。

紅景天又名薔薇紅景天,多分布于我國西藏、四川與甘肅等地,種類繁多,具有益智養心、補氣清肺、收斂止血等功效[12]。SAL作為紅景天的有效成分之一,越來越多研究者證明其具有多種藥理作用。Xu等[13]研究發現SAL可通過激活SIRT1抑制氧化應激信號通路,可能成為治療銀屑病的理想候選藥物。Rong等[14]研究發現SAL通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導人胃癌AGS細胞凋亡和自噬,為胃癌治療提供一定研究依據,并提出了新的見解。李軍等[15]研究發現SAL通過調控SIRT1/NF-κB信號通路,減輕了氧葡萄糖剝奪/再恢復誘導的人神經母細胞瘤細胞損傷。本研究結果顯示,與Control組相比,SAL-H組HKF細胞增殖能力(24 h)、遷移距離、侵襲細胞個數、S期細胞比例顯著減少,細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著增加。這些結果提示SAL可能具有改善KD的作用。

miR-26a-5p是微小RNA的一種,可以調控靶基因表達參與多種疾病的發生發展過程。葉恒等[16]研究發現miR-26a-5p可靶向下調PTEN表達,調控Wnt/β-catenin信號通路,促進成骨細胞增殖、分化和基質礦化。Li等[17]研究發現miR-26a-5p通過靶向CTGF來減輕脂多糖誘導的急性肺損傷,減輕肺部炎癥和細胞凋亡。Li等[18]研究發現過表達miR-26a-5p可以抑制Wnt5a的表達,促進了細胞凋亡,抑制了胃癌中的細胞增殖和細胞侵襲。

JAG1是細胞表面配體,主要在高度保守的Notch信號通路中發揮作用。Notch信號通路在細胞生長發育、器官系統的代謝等過程中均發揮著重要作用[19]。Liu等[20]研究發現JAG1作為致癌基因在卵巢癌的進展和化療耐藥中起重要作用,敲低JAG1可以抑制GATA1誘導的Notch激活和細胞增殖。Yu等[21]研究發現肝細胞中JAG1過表達加劇了非酒精性脂肪性肝炎小鼠的纖維化,而GAG1敲除小鼠則免受纖維化的影響。本研究結果顯示,與Control組相比,SAL-H組JAG1和Notch-1 mRNA和蛋白表達顯著減少(P<0.05),miR-26a-5p表達顯著增加;與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細胞相應指標變化趨勢與上述相同。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,miR-26a-5p inhibitor減弱了SAL對HKF細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,抑制了細胞凋亡。提示過表達miR-26a-5p可能通過下調JAG1/Notch-1信號通路抑制HKF細胞增殖、遷移和侵襲,促進了細胞凋亡。

綜上所述,JAG1是miR-26a-5p的靶標,SAL可能通過上調miR-26a-5p,靶向抑制JAG1/Notch-1信號軸抑制HKF細胞增殖、遷移、侵襲,促進細胞凋亡,改善KD。說明SAL可成為治療KD的一個潛在藥物,為臨床治療研究提供新的思路與方法。