決明子多糖調節IL-6/JAK2/STAT3通路對高糖誘導視網膜神經節細胞損傷的影響

曹平 蘇露煜

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一,也是導致視力損傷和失明的主要原因[1]。視網膜神經節細胞是位于視網膜內表面附近的一種神經元細胞,其為視神經的重要組成部分,高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷是DR發生的重要原因[2]。因此,深入研究高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷機制對治療DR有重要意義。決明子具有清肝明目、潤腸通便的療效,決明子多糖是其主要有效成分之一,具有良好的抗氧化、抗菌、明目、降血糖血脂和增強機體免疫力等作用[3]。有研究證實,決明子多糖可以對青光眼所致視網膜細胞損傷有保護作用[4]。細胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)/Janus激酶2(Janus kinase-2,JAK2)/信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路參與了機體血管生成、免疫調節、細胞增殖分化等多種生理病理過程,與多種疾病的發生發展密切相關[5,6]。有研究表明,鹽酸青藤堿可通過抑制IL-6/JAK2/STAT3級聯反應來抑制漿細胞性乳腺炎的進展[7]。但筆者發現決明子多糖通過調節IL-6/JAK2/STAT3通路對高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討決明子多糖調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路對高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人視網膜神經節細胞株RGC-5購自美國標準生物品收藏中心。

1.2 主要試劑 決明子多糖(貨號：HY-DZ4122)購自安徽華遠經濟發展有限公司;JAK2/STAT3的激活劑colivelin(貨號：30124568)購自深圳海思安生物技術有限公司;丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(貨號：BC0025)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(貨號：BC0175)、谷氨酸(Glu)ELISA試劑盒(貨號：BC1585)購于北京索萊寶科技有限公司;兔源一抗IL-6(貨號：ab233706)、p-JAK2(貨號：ab195055)、JAK2(貨號：ab39636)、p-STAT3(貨號：ab30647)、STAT3(貨號：119352)、增殖細胞核抗原(PCNA)(貨號：ab265585)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)(貨號：ab4051)、自噬微管相關蛋白輕鏈3(LC3)Ⅱ(貨號：ab48394)、LC3Ⅰ(貨號：ab244816)、Beclin-1(貨號：ab217179)以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號：ab288151)均購自美國Abcam公司。

1.3 細胞培養 將RGC-5細胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青-鏈霉素的DMEM培養基中,在37℃、5% CO2的穩定環境下常規培養,定期觀察,每1～2天更換1次培養基,當細胞融合度>85%時,消化傳代,收集對數期的細胞進行實驗。

1.4 高糖誘導及分組 將處于對數期的RGC-5細胞分為對照組(正常培養)、高糖組[8](50 mmol/L葡萄糖處理細胞)、決明子多糖低劑量組[4](50 mmol/L葡萄糖+15 mg/L的決明子多糖)、決明子多糖高劑量組[4](50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L的決明子多糖)、激活劑組[9](50 mmol/L葡萄糖+60 mg/L的決明子多糖+0.5 μmol/L JAK2/STAT3的激活劑colivelin)、激活劑對照組(50 mmol/L葡萄糖+0.5 μmol/L JAK2/STAT3的激活劑colivelin)。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 各組細胞以1×104個/孔接種到96孔板中。分別將細胞培養24、48、72 h后,棄去細胞上清液,且在指定的時間點向每個孔中加入含有10 μl CCK-8溶液的100 μl完全培養基。孵育2 h后,使用酶標儀檢測吸光度。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組RGC-5細胞,以預冷的PBS洗滌2次,添加100 μl結合緩沖液懸浮各組RGC-5細胞,再分別添加Annexin V-FITC和PI染液5 μl,充分混勻,與室溫下避光染色15 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 ELISA檢測細胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量 收集各組細胞上清液,分別參照MDA、SOD、Glu的ELISA試劑盒說明書檢測MDA水平、SOD活性和Glu含量。

1.8 Western blot檢測相關蛋白表達 RIPA裂解緩沖液提取RGC-5細胞總蛋白,電泳分離蛋白,100 V恒壓轉移蛋白至PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶封閉2 h,將膜與一抗IL-6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、PCNA、caspase-3、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、GAPDH,4℃孵育過夜,再將膜與HRP偶聯的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h,棄去液體,洗滌3次,加入ECL試劑觀察蛋白質印跡,Image J軟件評估蛋白的灰度值。

2 結果

2.1 6組RGC-5細胞增殖能力比較 與對照組比較,高糖組RGC-5細胞的OD450值降低(P<0.05);與高糖組比較,決明子多糖低劑量組、決明子多糖高劑量組RGC-5細胞的OD450值升高(P<0.05);與決明子多糖高劑量組比較,激活劑組RGC-5細胞的OD450值降低(P<0.05),與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞的OD450值降低(P<0.05)。見表1。

表1 6組RGC-5細胞OD450值比較 n=6,

2.2 6組細胞凋亡情況比較 與對照組比較,高糖組RGC-5細胞凋亡率升高(P<0.05);與高糖組比較,決明子多糖低劑量組、決明子多糖高劑量組RGC-5細胞凋亡率降低(P<0.05);與決明子多糖高劑量組比較,激活劑組RGC-5細胞凋亡率升高(P<0.05);與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2,圖1。

圖1 6組RGC-5細胞凋亡情況

表2 6組 RGC-5細胞凋亡率比較 n=6,%,

2.3 6組RGC-5細胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量比較 與對照組比較,高糖組RGC-5細胞的MDA水平和Glu含量明顯升高,SOD活性下降(P<0.05);與高糖組比較,決明子多糖低劑量組、決明子多糖高劑量組RGC-5細胞的MDA水平和Glu含量降低,SOD活性升高(P<0.05);與決明子多糖高劑量組比較,激活劑組RGC-5細胞的MDA水平和Glu含量升高,SOD活性下降(P<0.05),與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞的MDA水平和Glu含量升高,SOD活性下降(P<0.05)。見表3。

表3 6組RGC-5細胞上清液中MDA水平、SOD活性和Glu含量比較 n=6,

2.4 6組細胞中增殖、凋亡和IL-6/JAK2/STAT3通路相關蛋白表達比較 與對照組比較,高糖組RGC-5細胞的PCNA表達水平明顯降低(P<0.05),IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表達顯著升高(P<0.05);與高糖組比較,決明子多糖低劑量組、決明子多糖高劑量組RGC-5細胞的PCNA表達水平明顯升高(P<0.05),IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表達顯著降低(P<0.05);與決明子多糖高劑量組比較,激活劑組RGC-5細胞的PCNA表達水平明顯降低(P<0.05),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表達明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞的PCNA表達水平顯著降低(P<0.05),p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、caspase-3表達明顯升高(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 Western blot檢測RGC-5細胞中增殖、凋亡和IL-6/JAK2/STAT3通路相關蛋白表達;A 對照組;B 高糖組;C 決明子多糖低劑量組;D 決明子多糖高劑量組;E 激活劑組;F 激活劑對照組

表4 6組RGC-5細胞中IL-6/JAK2/STAT3通路相關蛋白表達比較 n=6,

2.5 6組細胞中自噬相關蛋白表達比較 與對照組比較,高糖組RGC-5細胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達水平明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,決明子多糖低劑量組、決明子多糖高劑量組RGC-5細胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達水平明顯降低(P<0.05);與決明子多糖高劑量組比較,激活劑組RGC-5細胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達水平升高(P<0.05),與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞的LC3Ⅱ/LC3I、Beclin-1表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 Western blot檢測RGC-5細胞中自噬相關蛋白表達;A 對照組;B 高糖組;C 決明子多糖低劑量組;D 決明子多糖高劑量組;E 激活劑組;F 激活劑對照組

表5 6組RGC-5細胞中自噬相關蛋白表達比較 n=6,

3 討論

DR是一種影響視力甚至致盲的慢性進行性疾病,隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變,DR的發生率呈現上升趨勢[10]。DR患者早期無明顯癥狀,隨著病情的發展,患者會出現視野模糊、缺失、視力下降甚至失明等癥狀,但目前對DR還沒有非常有效的治療手段[11]。因此,積極探索新的藥物靶點以期為DR的防治提供理論參考依據。高糖條件下,視網膜神經節內的SOD活性降低,聚集的活性氧可以將脂質過氧化,產生大量的MDA,造成氧化損傷[12]。本研究用50 mmol/L葡萄糖處理RGC-5細胞,結果表明細胞OD450值、SOD活性降低,細胞凋亡率、MDA水平上升,提示高糖誘導可抑制RGC-5細胞增殖,促進其凋亡,造成其氧化應激損傷。LC3和Beclin-1是自噬標志蛋白,LC3在自噬形成過程中由LC3Ⅰ轉變為LC3Ⅱ,Beclin-1與自噬體形成有關[13]。Glu是視網膜內神經細胞的興奮性遞質,Glu釋放量過量會導致興奮性毒性作用[14]。本研究發現,與對照組比較,高糖組RGC-5細胞的Glu含量、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達上升,提示高糖可導致視網膜神經節細胞產生自噬。

DR在中醫學角度上稱為“消渴目病”,屬于“視瞻昏渺”、“血灌瞳神”、“云霧移晴”、“暴盲”等內障眼病范疇,其主要病機是虛火上炎,灼傷目中血絡;或陰虛日久,目失所養;或氣不攝血,血不循經,水液外滲;或氣虛行血乏力,目中淤血阻絡,陰虛血行滯澀;消渴日久,累及肝腎,目失濡養,由“氣陰兩虛”進展為“肝腎陰虛”,最終導致“陰陽兩虛”,根據患者臨床表征進行辯證論治[15]。中醫學中采用針灸療法、穴位按摩、穴位注射療法、中藥熱敷療法等技術治療DR,同時進行方藥治療,其主要有活血化瘀方、補陽還五湯等復方湯劑治療,復方丹參滴丸、雙丹明目膠囊等中成藥治療,金銀花、芒柄花黃素等單味中藥治療以及中西醫結合治療等,在DR的臨床治療中發揮重要作用[16]。中藥具有多層次,多靶點,毒副作用小等優點,決明子多糖是從天然植物決明子果實中提取出來的一種多糖混合物,具有重要的藥理作用[17]。有研究表明,一定濃度范圍的決明子多糖提取物可以增加下游蛋白血紅素加氧酶的表達,抑制活性氧的產生,從而保護人視網膜內皮細胞免受高血糖引起的氧化損傷[18]。本研究發現,決明子多糖可提高高糖誘導的RGC-5細胞的OD450值、SOD活性、PCNA表達,并且降低細胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達,提示決明子多糖可增強高糖誘導的RGC-5細胞的增殖能力,抑制其凋亡、氧化應激反應和自噬。

IL-6是功能廣泛的細胞因子,其參與了炎性反應、細胞分化及增殖等生理病理過程,胞內JAK2通過IL-6特異性受體與FERM結構域相結合并被磷酸化激活,進一步促進STAT3磷酸化,IL-6/JAK2/STAT3通路調控炎性、增殖、凋亡等多種生物學行為[19]。相關研究表明,補腎化痰方可通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路改善去勢大鼠股丟失[20];染料木黃銅通過類風濕性關節炎中的JAK2/STAT3途徑抑制IL-6誘導的血管內皮生長因子表達和血管生成[21];葛根芩連煎劑通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路來緩解小鼠潰瘍性結腸炎[22]。本研究發現,與對照組比較,高糖組RGC-5細胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達明顯升高,提示IL-6/JAK2/STAT3通路可能參與了高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷。與高糖組比較,決明子多糖低、高劑量組RGC-5細胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達明顯降低,推測決明子多糖可能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路抑制高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷。為了驗證該推測,本研究利用JAK2/STAT3的激活劑colivelin進行干預,結果發現,與高糖組比較,激活劑對照組RGC-5細胞中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達明顯升高,細胞OD450值、SOD活性、PCNA表達明顯降低,細胞凋亡率、MDA水平、Glu含量、caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達顯著升高,表明激活IL-6/JAK2/STAT3通路可加劇高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷。最后還發現,colivelin可減弱決明子多糖對高糖誘導的RGC-5細胞損傷的抑制作用。證實了決明子多糖確實可能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路抑制高糖誘導的視網膜神經節細胞損傷。

綜上所述,決明子多糖可通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路對高糖誘導的視網膜神經節細胞起到保護作用,為開發新的治療DR的藥物提供了理論基礎。